Serratia sp. SYBC H發(fā)酵浮萍生產(chǎn)蛋白酶的研究

李桂英，廖祥儒，蔡宇杰

（1.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州 535011）（2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

浮萍是一種水生植物，生長繁殖快，2～7 d可以繁殖一代，在溫?zé)釒У貐^(qū)可以常年生長。浮萍含有豐富的粗蛋白質(zhì)，纖維素及灰分[1]。對于浮萍的開發(fā)利用，許多研究工作者作過一些報(bào)道，如利用浮萍生產(chǎn)燃料乙醇[2]；提取紫萍中的中藥成分[3,4]；利用浮萍快速生長繁殖的特點(diǎn)，除去污水中豐富的氮、磷成分，從而達(dá)到凈化除污的目的[5,6]；利用生物分離技術(shù)提取浮萍中的多糖[7]；利用浮萍研究植物衰老機(jī)理，以及開發(fā)植物反應(yīng)器和除草劑等[8～12]。

利用微生物生產(chǎn)代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)基的成分及其用量對微生物的生長、代謝產(chǎn)物的積累，甚至對大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)都有很大的影響，因而，培養(yǎng)基成分的選擇和優(yōu)化顯得尤為重要。工業(yè)上，耐有機(jī)溶劑蛋白酶的生產(chǎn)菌株常常來自于假單胞菌屬，芽孢桿菌屬以及某些霉菌[13～16]，鮮有沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的報(bào)道。另外，生產(chǎn)蛋白酶的氮源常常是酵母提取物、牛肉膏和魚蛋白等昂貴氮源[17,18]，后來逐漸擴(kuò)展到利用農(nóng)副產(chǎn)品的下腳料如豆粕，豆皮來發(fā)酵生產(chǎn)[19,20]，尚未見來自于浮萍的生產(chǎn)報(bào)道。據(jù)估計(jì)，常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)基成本占整個(gè)生產(chǎn)成本的30%左右[21]。

從無錫太湖腐敗的藍(lán)藻中分離篩選出一株蛋白酶生產(chǎn)菌株，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，生理生化特性，16S rRNA基因序列分析，以及脂肪酸含量測定，認(rèn)為該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，命名為Serratia sp. SYBC H。擬采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究Serratia sp. SYBC H搖瓶發(fā)酵浮萍生產(chǎn)稀有的蛋白酶的培養(yǎng)基優(yōu)化工作。先采用單因素實(shí)驗(yàn)對Serratia sp.SYBC H生產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵時(shí)間，碳源、碳氮比、無機(jī)鹽和產(chǎn)酶添加劑等因素進(jìn)行篩選，接著采用正交實(shí)驗(yàn)研究影響Serratia sp. SYBC H生產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及其用量范圍。通過培養(yǎng)基優(yōu)化，提高Serratia sp. SYBC H生產(chǎn)蛋白酶的產(chǎn)率。利用Serratia sp. SYBC H發(fā)酵浮萍生產(chǎn)蛋白酶，既提升浮萍資源的利用，又降低蛋白酶的生產(chǎn)成本，增強(qiáng)市場競爭力，獲得經(jīng)濟(jì)效益與環(huán)境凈化的雙贏。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 浮萍與菌株

浮萍取自于無錫太湖，曬干，篩選，除異物，粉碎，過200目篩。

菌株Serratia sp. SYBC H分離于無錫太湖的藍(lán)藻中，保藏于4 ℃的LB斜面培養(yǎng)基及-20 ℃的甘油中。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉5，pH 7～7.2。

斜面培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的組成上再加上2%的瓊脂。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉10，浮萍20，pH 7～7.2。

1.2 測定方法

采用Bhosale的方法[22]，略加改動(dòng)。抽取發(fā)酵液5 mL，8000 r/min離心10 min，取離心上清液0.1 mL作為粗酶，加入0.5 mL預(yù)熱后的1%(m/V)偶聯(lián)酪蛋白溶液，混勻，于37 ℃的水浴中反應(yīng)10 min，加入1.9 mL的10%三氯乙酸終止酶促反應(yīng)。接著，將反應(yīng)混合液離心分離（6000 r/min，10 min)，小心吸取離心上清液，加入2 mL 10% (m/V) NaOH溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)。在波長440 nm下測定吸光值，平行測定三次?？瞻讓φ找允Щ畹牡鞍酌高M(jìn)行相同方法處理。一個(gè)酶活單位(U)定義為在此條件下每分鐘釋放1 μg酪氨酸所需要的蛋白酶量。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液與蛋白酶制備的培養(yǎng)方法

將活化后的斜面菌種劃1～2環(huán)接入滅菌的種子培養(yǎng)基，于30 ℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)10 h。接著，將生長旺盛的種子液按5%的接種比例轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃，200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 蛋白酶生產(chǎn)時(shí)間曲線

以5%的接種比，將生長旺盛的菌種轉(zhuǎn)入已滅菌的基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，每隔3 h取樣，離心分離（8000 r/min，10 min），取離心上清液作為粗酶，測其蛋白酶活力。平行重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.3.3 各種碳源對蛋白酶生產(chǎn)的影響

取葡萄糖、蔗糖、麥芽粉、玉米粉、馬鈴薯粉和小麥粉等各以10 g/L的濃度取代基本發(fā)酵培養(yǎng)基里的可溶性淀粉，其它成分及濃度保持不變，于30 ℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)18 h。取發(fā)酵液，離心分離（8000 r/min，10 min），取離心上清液，測其蛋白酶活力。平行重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.3.4 小麥粉與浮萍的比例對產(chǎn)酶的影響

以小麥粉取代基本發(fā)酵培養(yǎng)基里的可溶性淀粉，以不同的小麥粉與浮萍比例，于30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)18 h。提取發(fā)酵液，離心分離(8000 r/min，10 min)，取離心上清液，測其蛋白酶活力。平行重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.3.5 各種無機(jī)鹽對產(chǎn)酶的影響

分別向基本發(fā)酵培養(yǎng)基加入不同的無機(jī)鹽，其它組分及其濃度保持不變，于30 ℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)18 h。取發(fā)酵液，離心分離(8000 r/min，10 min)，取離心上清液，測其蛋白酶活力。以不加任何無機(jī)鹽的試驗(yàn)作為空白對照，設(shè)空白對照的酶活為相對酶活100%。平行重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.3.6 各種產(chǎn)酶添加劑對產(chǎn)酶的影響

分別向基本發(fā)酵培養(yǎng)基加入不同的添加劑，其它成分及濃度保持不變，于30 ℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)18 h。取發(fā)酵液，離心分離(8000 r/min，10 min)，取離心上清液，測其蛋白酶活力。以不加任何添加劑的試驗(yàn)作為空白對照，設(shè)空白對照的酶活為相對酶活100%。平行重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.3.7 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)六因素三水平正交試驗(yàn)，研究各因素各水平對蛋白酶生產(chǎn)的影響，設(shè)酶活值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以極差R值作為評判依據(jù)。每一組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)平行樣，于30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)18 h。發(fā)酵結(jié)束后，提取發(fā)酵液，離心分離(8000 r/min，10 min)，取離心上清液，測其蛋白酶活力，平行重復(fù)測定三次。篩選的因素及其水平如表1。

表1 六因素三水平正交試驗(yàn)表Table 1 6 factors -3 levels of orthogonal experiment design

1.3.8 蛋白酶純度鑒定

經(jīng)分離純化后的蛋白酶，采用SDS-PAGE檢測，按照試劑盒說明書進(jìn)行配膠和操作。以發(fā)酵上清液作為對照。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS v7.05軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和R值分析，用origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)酶的影響

圖1 發(fā)酵時(shí)間與蛋白酶生產(chǎn)的關(guān)系Fig.1 The relationship between fermentation time and protease production

按5%的接種比，將生長旺盛的菌種接入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)，每間隔3 h取樣，按照蛋白酶的檢測方法(1.2)，測定樣品中的蛋白酶活力。平行重復(fù)三次試驗(yàn)。結(jié)果如圖1發(fā)酵培養(yǎng)基接入菌種后，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，蛋白酶的產(chǎn)值也逐漸增加，發(fā)酵18 h時(shí)，蛋白酶的產(chǎn)值達(dá)到最大值；隨后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，蛋白酶的產(chǎn)值逐漸下降。這種現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生在微生物發(fā)酵產(chǎn)酶過程中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵18 h左右，適宜終止蛋白酶生產(chǎn)。利用Serratia sp. SYBC H發(fā)酵浮萍生產(chǎn)蛋白酶，發(fā)酵周期短，這是Serratia sp. SYBC H有別于其它蛋白酶生產(chǎn)菌株的特征之一。如常見的蛋白酶生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌，其蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)間一般都在40 h左右[23]，有的高達(dá)72 h[24]，Psedomonas sp.菌株生產(chǎn)蛋白酶的時(shí)間一般在48 h以上[25]，有的菌株生產(chǎn)蛋白酶需要120 h[26]。利用Serratia sp. SYBC H發(fā)酵浮萍，周期短，不僅可加速對浮萍的高值化處理，還可以高產(chǎn)蛋白酶，獲得雙重收獲。

2.2 各種碳源對蛋白酶生產(chǎn)的影響

圖2 碳源對Serratia sp. SYBC H蛋白酶生產(chǎn)的影響Fig.2 Effect of carbon source on Serratia sp. SYBC H protease production

微生物生長與產(chǎn)酶都需要碳源。不同的菌種，以及生產(chǎn)不同的酶，需要不同的碳源。通過對碳源的優(yōu)化，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)：Serratia sp. SYBC H發(fā)酵浮萍生產(chǎn)蛋白酶的最佳碳源是小麥粉，其次是玉米粉。簡單易利用的碳源如果糖﹑葡萄糖、蔗糖，其蛋白酶的產(chǎn)率卻較低。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因是由于簡單易利用的碳源如葡萄糖對蛋白酶的生產(chǎn)易形成分解代謝物阻遏作用[27]，降低蛋白酶的生產(chǎn)。因此，為了提高蛋白酶的生產(chǎn)，應(yīng)該避免使用大量可迅速利用的碳源如葡萄糖等。

2.3 小麥粉與浮萍比例對產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的C/N比對產(chǎn)酶有重要影響。因此，我們采用試驗(yàn)結(jié)果中的最佳碳源-小麥粉取代基本發(fā)酵培養(yǎng)基里的可溶性淀粉，研究不同的小麥粉/浮萍之比對蛋白酶生產(chǎn)的影響，結(jié)果如圖3。浮萍：小麥粉為2:1時(shí)，蛋白酶的生產(chǎn)達(dá)到最大值（1378.30 U/mL），表明Serratia sp. SYBC H生產(chǎn)蛋白酶，可以通過控制培養(yǎng)基里的小麥粉/浮萍之比來控制C/N之比，從而提高蛋白酶的產(chǎn)率。在以前的文獻(xiàn)報(bào)道中，有科研工作者也發(fā)現(xiàn)以小麥粉作碳源可以提高蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)[28]。

圖3 浮萍與小麥粉之比對Serratia sp. SYBC H蛋白酶生產(chǎn)的影響Fig.3 Effect of duckweed /wheat flour ratio on Serratia sp.SYBC H protease production

2.4 各種無機(jī)鹽對產(chǎn)酶的影響

對于微生物的生長與代謝，需要各種無機(jī)鹽參與復(fù)雜的生化反應(yīng)。通過向基本發(fā)酵培養(yǎng)基添加不同的無機(jī)鹽，蛋白酶的生產(chǎn)見表2。NaCl顯著刺激蛋白酶的生產(chǎn)，CaCl2不影響蛋白酶的生產(chǎn)，重金屬鹽除了MnCl2不抑制蛋白酶生產(chǎn)外，其它的無機(jī)鹽，如FeCl2、ZnCl2和CoCl2均不同程度地抑制Serratia sp. SYBC生產(chǎn)蛋白酶。類似以NaCl作無機(jī)鹽提高蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)還有Serratia rubidaea菌株[29]。

表2 無機(jī)鹽對Serratia sp. SYBC H蛋白酶生產(chǎn)的影響Table 2 Effects of inorganic salts on Serratia sp. SYBC H protease production

2.5 各種添加劑對Serratia sp. SYBC H生產(chǎn)蛋白酶的影響

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑，經(jīng)常需要添加各種添加劑刺激酶的生產(chǎn)。分別向基本發(fā)酵培養(yǎng)基加入不同的添加劑，以不加任何添加劑的試驗(yàn)作為空白對照，試驗(yàn)結(jié)果如表3。吐溫80顯著促進(jìn)蛋白酶生產(chǎn)，曲拉通X-100，聚乙烯醇對蛋白酶生產(chǎn)的促進(jìn)作用不明顯；一些油脂(酯)類如橄欖油、大豆油、雜油脂和油酸等明顯抑制Serratia sp. SYBC H生產(chǎn)蛋白酶，其產(chǎn)酶值基本為空白對照的50%左右。

吐溫80是微生物產(chǎn)酶常用的非離子表面活性劑。它可以增強(qiáng)微生物細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)微生物對營養(yǎng)基質(zhì)的吸收以及胞外酶的分泌釋放；它還可以增大發(fā)酵液的氣液比表面積，增大溶解氧的傳質(zhì)系數(shù)，有利于好氧菌對溶解氧的吸收利用[30,31]；另外，它還可以保護(hù)酶的活性。

表3 各種添加劑對Serratia sp. SYBC H 蛋白酶生產(chǎn)的影響Table 3 Effects of additives on Serratia sp. SYBC H protease production

2.6 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)的產(chǎn)酶結(jié)果如表4。根據(jù)極差R值分析，對影響蛋白酶生產(chǎn)的因素進(jìn)行排序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥粉為第一主要因素，其次是浮萍，小麥粉和浮萍分別作為產(chǎn)酶的碳源和氮源，它們是影響蛋白酶生產(chǎn)的主要因素。排在第三位的是吐溫80，吐溫80影響蛋白酶的分泌釋放，增強(qiáng)細(xì)胞膜對營養(yǎng)物及溶解氧的吸收。正交實(shí)驗(yàn)的最高產(chǎn)酶值為1459.94 U/mL(第9組)。根據(jù)極差R值分析，pH和接種量不是影響Serratia sp.SYBC H生產(chǎn)蛋白酶的主要因素。

同一株菌，Serratia sp. SYBC H發(fā)酵藍(lán)藻生產(chǎn)蛋白酶的最高產(chǎn)酶值為941 U/mL[32]；發(fā)酵浮萍生產(chǎn)蛋白酶的產(chǎn)酶值為1459.94 U/mL，是發(fā)酵藍(lán)藻產(chǎn)酶值的1.55倍。

表明浮萍作為有機(jī)氮源，比藍(lán)藻更適合Serratia sp.SYBC H生產(chǎn)蛋白酶。同一株菌發(fā)酵，造成蛋白酶產(chǎn)值這么懸殊的原因可能是藍(lán)藻漿里含有抗?fàn)I養(yǎng)因子和抑菌劑[32]，阻礙Serratia sp. SYBC H的生長，要除去藍(lán)藻漿里的抑菌劑和抗?fàn)I養(yǎng)因子，需要復(fù)雜的操作，進(jìn)一步增加生產(chǎn)成本的投入。另一方面，用藍(lán)藻發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶，所配用的是簡單碳源蔗糖，對蛋白酶的生產(chǎn)易形成分解代謝物阻遏作用，從而降低蛋白酶的生產(chǎn)[27]。而浮萍，易于打撈，風(fēng)曬，篩選，粉碎。風(fēng)干的浮萍未曾有抑菌劑的報(bào)道，所配用的碳源是復(fù)雜碳源小麥粉，在極大程度上降低了分解代謝物阻遏作用，這些優(yōu)勢是藍(lán)藻漿發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶所不可比擬的。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其試驗(yàn)蛋白酶活值Table 4 Orthogonal experiment design and protease activity

2.7 蛋白酶純度鑒定

圖4 SDS-PAG分析 Serratia sp. SYBC H蛋白酶Fig.4 SDS-PAGE images of Serratia sp. SYBC H protease

由圖4可知，由浮萍發(fā)酵生產(chǎn)的Serratia sp. SYBC H蛋白酶經(jīng)鹽析，透析，離子交換層析，凝膠層析等一系列分離純化操作，得到電泳純的蛋白酶，其分子量在58 ku左右。經(jīng)分離純化后的沙雷氏菌蛋白酶，脫除了可能殘留于蛋白酶中的沙雷氏菌細(xì)胞，解除了可能存在的安全隱患。另外，整個(gè)發(fā)酵過程是安全的，無Serratia sp. SYBC H逃逸；發(fā)酵結(jié)束后，提取粗酶后的發(fā)酵渣及發(fā)酵液體經(jīng)過滅菌后才排放，故利用Serratia sp. SYBC H發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶是安全可行的。

3 結(jié)論

以酶活為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究了影響Serratia sp. SYBC H發(fā)酵浮萍生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基組成及其用量范圍。Serratia sp. SYBC H發(fā)酵浮萍生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基組成及其最佳水平分別為小麥粉15 g/L，浮萍30 g/L，吐溫80 0.8% (V/V)，NaCl 0.05 mol/L；在試驗(yàn)范圍內(nèi)，最高產(chǎn)酶值可達(dá)1459.94 U/mL，發(fā)酵周期為18 h。

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