不同品種辣木葉多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性研究

董竹平，李超，扶雄

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

辣木（Moringa oleifera），屬辣木科辣木屬，是一種分布廣泛，營養(yǎng)價值高，具有諸多生理活性的多年生植物。辣木原廣泛分布于印度北部、巴基斯坦、孟加拉國及阿富汗等，隨著越來越多的人認(rèn)識到辣木重要的營養(yǎng)和藥用價值，很多地區(qū)開始重視辣木的引種培育和開發(fā)利用，包括我國的云南、臺灣、廣東及廣西等地區(qū)均有種植[1]。辣木在全世界主要有14個品種，目前在國內(nèi)引種較多的主要有4個品種：印度傳統(tǒng)辣木、印度改良種辣木（PKM1）、PKM1改良種辣木（PKM2）和非洲辣木。辣木含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、脂肪和碳水化合物等，其蛋白質(zhì)含量高于雞蛋，鈣含量高于牛奶，在印度常被用作孕婦食品，被西方科學(xué)家稱為上帝賜給人類的禮物。辣木是傳統(tǒng)的藥物來源，其根、莖、葉、果和樹皮等常被用來治療各種疾病，比如辣木葉的水提物在印度的很多地區(qū)用于治療糖尿病[2]?，F(xiàn)代研究表明辣木中含有多種活性成分，具有降血糖、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等生理活性，是開發(fā)功能性食品的優(yōu)質(zhì)原料[2,3]。

多糖是由10個以上的單糖組成的高分子化合物，包括植物多糖、動物多糖和真菌多糖等，具有抗炎、抗氧化、抗癌、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等諸多的有益生理活性[4]。植物多糖因其重要的生理活性以及極低的毒副作用，受到國內(nèi)外研究工作者的青睞。辣木葉中含有豐富的多糖，含量范圍為8.61～33.61%[5]。目前國內(nèi)對辣木葉多糖的研究主要停留在提取和含量測定方面，對其活性和結(jié)構(gòu)的報道比較少。本文選取了國內(nèi)引種比較多的三種辣木葉品種：PKM1葉、PKM2葉和非洲辣木葉，采用熱水提取方法提取三個品種的辣木葉多糖，比較研究三種辣木葉多糖的理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗氧化活性，為辣木葉的開發(fā)和深入利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

PKM1、PKM2辣木葉購自中國云南省西谷科技有限公司；非洲辣木葉購自中國云南省昆明樵山記食品有限責(zé)任公司，風(fēng)干后粉碎備用；牛血清蛋白、抗壞血酸(Vc)、凝膠多糖（Curdlan）、海帶多糖（Laminarin）、DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)、ABTS(2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)購自美國Sigma-Aldrich公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax? i3x連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器上海有限公司；A1260高效液相色譜儀（配有Agilent 1260示差檢測器）美國Agilent公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Dionex ICS 3000離子色譜儀，美國Dionex公司；Vector 33紅外光譜儀，德國Bruker公司；Nanoscope 3A原子力顯微鏡，美國Veeco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉預(yù)處理

將辣木葉原料用自來水清洗3遍，用去離子水清洗1遍后置于50 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重。將干燥的辣木葉用中草藥粉碎機(jī)粉碎，過60目篩子后，收集備用。稱取1000 g辣木葉粉末，與4 L乙醇溶液（90%）混合，置于70 ℃水浴鍋中加熱回流4 h，抽濾，收集濾渣，重復(fù)操作一次，收集濾渣，置于50 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重，制得預(yù)處理的辣木葉粉，放在干燥器中備用。

1.2.2 辣木葉多糖的制備

稱取100 g預(yù)處理后的辣木葉粉末，加入2 L的去離子水，于90 ℃水浴鍋中加熱回流2 h，5000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，上清液進(jìn)一步抽濾，收集濾液。濾渣重新提取一次，合并濾液。濾液于45 ℃下減壓濃縮至體積的1/4～1/6。采用Sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1）進(jìn)行脫蛋白，重復(fù)操作12次后，于45 ℃下減壓旋蒸發(fā)除去殘留的Sevage試劑。然后加入200 g的AB-8大孔樹脂，35 ℃條件下?lián)u晃脫色2 h，抽濾分離濾液，大孔樹脂用去離子水洗3次，合并濾液，減壓濃縮至500 mL。在濃縮液中加入無水乙醇，邊加邊攪拌至乙醇濃度為80%，4 ℃冰箱中靜置12 h以上，重復(fù)操作1次，離心收集沉淀，用去離子水復(fù)溶，-50 ℃冷凍干燥得辣木葉粗多糖。稱取1 g粗多糖，配成10 mg/mL的多糖溶液，裝入截留分子量為3000 u的透析袋中透析24 h，收集透析袋內(nèi)的多糖溶液，冷凍干燥制得辣木葉多糖樣品。多糖提取率計算公式如下：

得率(%)=多糖樣品的質(zhì)量/辣木葉粉質(zhì)量×總糖含量×100

1.2.3 總糖含量和蛋白質(zhì)含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖樣品中的總糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測定多糖樣品中的蛋白含量。

1.2.4 單糖組成及糖醛酸含量測定

采用離子色譜法測定樣品單糖組成及糖醛酸含量，測試方法參考Ren等[6]報道的方法。稱取5 mg樣品溶解在4 mL的三氟乙酸（2 M）中，轉(zhuǎn)移到10 mL安培瓶中，酒精噴燈封口，110 ℃鼓風(fēng)恒溫干燥箱中水解6 h。冷卻到室溫，于45 ℃下減壓旋蒸除去多余的三氟乙酸，用50%的甲醇清洗5次，45 ℃條件下減壓旋蒸除去甲醇，用適量超純水溶解，定容到50 mL容量瓶中，過0.22 μm水膜，-4 ℃低溫下保存在液相瓶中，然后通過離子色譜儀進(jìn)行分析。巖藻糖（Fuc）、阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glu）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、半乳糖醛酸（GalA）和葡萄糖醛酸（GluA）作為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 分子量的測定

采用高效液相色譜儀測定樣品的分子量分布。稱取2 mg多糖樣品溶解在2 mL的磷酸二氫鉀緩沖液（0.02 M）中，過0.22 μm的水膜，進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用普魯蘭標(biāo)準(zhǔn)品（分子量分別為642000、337000、194000、21100、9600、6100 u）。液相工作條件：色譜柱為TSK-gel G5000 PWXL和TSK-gel G3000PWXL串聯(lián)使用；檢測器：Agilent 1260示差檢測器；流動相：0.02 M磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6.0）；柱溫：35±0.1 ℃；檢測器溫度：45±0.1 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.6 紅外光譜的測定

稱取3 mg的多糖樣品經(jīng)過KBr壓片，采用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.7 三螺旋結(jié)構(gòu)的測定

采用剛果紅試劑法測定樣品的三螺旋構(gòu)象。配制1 mg/mL多糖樣品與等體積的100 μM剛果紅試劑混勻，依次滴加1 M NaOH溶液調(diào)整NaOH濃度為0～0.5 M，紫外全波長掃描每一個NaOH濃度下的混合溶液，得到最大吸收波長，以Curdlan和Laminarin為對照，同時以相同體積的蒸餾水為空白對照。

1.2.8 原子力顯微鏡測量

采用原子力顯微鏡（AFM）觀測樣品的形貌特征。稱取5 mg樣品配成1 mg/mL的樣品溶液，在60 ℃的水浴鍋中攪拌2 h，冷卻至室溫后稀釋400倍，在25 ℃下攪拌6 h。取5 μL溶液滴在平整的云母片上，風(fēng)干后放在AFM的金屬圓盤上測量。

1.2.9 抗氧化活性實驗

1.2.9.1 DPPH自由基清除能力

參照Ren等[6]人的方法并稍加改進(jìn)。DPPH溶液配制：19.7 mg的DPPH溶于50%甲醇，定容到250 mL容量瓶中。樣品溶液用去離子水配置不同梯度濃度。取1 mL不同濃度的樣品溶液與1 mL的DPPH溶液或50%的甲醇溶液混合，渦旋混勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長測定吸光度。DPPH自由基清除率計算公式如下：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A0-A1)/(A2-A3)]×100

其中，A0表示1 mL樣品溶液與1 mL DPPH溶液混合反應(yīng)后的吸光度；A1表示1 mL樣品溶液與1 mL 50%甲醇溶液混合后的吸光度；A2表示1 mL去離子水與1 mL DPPH溶液混合后的吸光度；A3表示1 mL去離子水與1 mL、50%甲醇溶液混合后的吸光度。

1.2.9.2 ABTS自由基清除能力

參照Zhang等[7]人的實驗方法并稍加改進(jìn)。ABTS溶液配置：7 mM ABTS溶液和2.45 mM K2S2O8按1:1的比例配置，避光反應(yīng)12 h生成。ABTS+工作液配置：ABTS溶液加水稀釋到在732 nm波長下吸光度為0.70±0.02。樣品溶液用去離子水配置不同梯度濃度。取0.2 mL不同濃度的樣品溶液與1.5 mL的ABTS+工作液，渦旋混勻，避光反應(yīng)30 min，于732 nm波長下測定吸光度。Vc用作陽性對照。ABTS自由基清除率計算公式如下：

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A0-A1)/A2]×100

其中，A0表示0.2 mL樣品溶液與1.5 mL ABTS+工作液混合反應(yīng)后的吸光度；A1表示0.2 mL樣品溶液與1.5 mL去離子水混合的吸光度；A2表示0.2 mL去離子水與1.5 mL ABTS+工作液混合的吸光度。

1.2.9.3 羥基自由基清除能力

參照Ren等[6]的方法并稍加改進(jìn)。取1 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL Fe2SO4(1.5 mM)、0.7 mL雙氧水（6.7 mM）、0.3 mL水楊酸鈉（20 mM）混勻，置于37 ℃條件下避光孵育1 h，然后于562 nm波長測定吸光度，記為A0；1 mL去離子水替代樣品溶液反應(yīng)的吸光度，記為A1。Vc作為陽性對照。羥基自由基清除率計算公式如下：

羥基自由基清除率(%)=[1- A0/A1]×100

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行一維方差分析（one-way ANOVA），采用Origin 8.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行畫圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖組成

三種辣木葉多糖的得率和化學(xué)組成情況如表1所示?？梢钥吹剑琍KM1辣木葉的多糖得率高于PKM2辣木葉和非洲辣木葉，得率最大為6.84%，其中非洲辣木葉的多糖得率最低，這與岳秀潔等[8]人的研究結(jié)果相似。PKM1辣木葉多糖的總糖含量最高，達(dá)到63.19%，而PKM2辣木葉多糖含有較多的蛋白質(zhì)。此外，三種辣木葉多糖含有不同含量的糖醛酸。這些結(jié)果表明三種辣木葉含有不同含量和組成的活性多糖成分。

三種辣木葉多糖具有相似的單糖組成，均由四種單糖（半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖和木糖）組成，其中半乳糖和阿拉伯糖的摩爾百分含量達(dá)到了90%以上，說明辣木葉多糖主要是由半乳糖和阿拉伯糖組成，這和Chen等[9]人的研究結(jié)果不同，這可能是由于提取方式、檢測方法和原料的差異造成的。

2.2 分子量大小

通過HPGPC對三種辣木葉多糖的分子量分布進(jìn)行測量，結(jié)果如圖1所示。用普魯蘭標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：LogMw=-0.001V3+0.0861V2-2.5962V+31.632（R2=0.9999）。PKM1辣木葉主要含有五種分子量不同的多糖組分，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算，得分子量分別是13699.94 ku（21.84%）、145.469 ku（55.06%）、36.20 ku（5.48%）、20.03 ku（5.76%）、3.82 ku（11.86%）；同樣地，PKM2辣木葉也有五種不同分子量的多糖組分，分別是8310.88 ku（49.91%）、142.73 ku（12.49%）、36.83 ku（7.71%）、19.11 ku（1.91%）和3.90 ku（11.31%）；而非洲辣木主要有四種分子量不同的多糖組分，分別是13762.18 ku（33.21%）、126.54 ku（29.88%）、34.6301 ku（24.85%）和3.83 ku（12.07%）。從結(jié)果可以看到，三種辣木葉多糖的分子量分布區(qū)間相似，主要在10000 ku、140 ku、34 ku和3.8 ku左右有分布，但是不同品種的辣木葉多糖在各個分子量區(qū)間的分布比例有很大的不同，其中PKM2辣木葉多糖在高分子量區(qū)域占比更大，達(dá)到了49.91%，相比于非洲辣木葉多糖33.21%，PKM1辣木葉多糖的21.84%。

表1 三種辣木葉多糖的提取率和化學(xué)組成（%）Table 1 The yields and chemical compositions of polysaccharides from three Moringa oleifera leaves

圖1 三種辣木葉多糖的分子量分布Fig.1 The molecular weight distributions of the polysaccharides from three Moringa oleifera leaves

多糖等生物大分子的活性往往由它的結(jié)構(gòu)決定，故分子量的大小、單糖組成、官能團(tuán)的不同等都能影響多糖的生理活性。You等[10]研究發(fā)現(xiàn)，平均分子量為306.2 ku的香菇多糖，體外抗氧化活性優(yōu)于平均分子量為605.4 ku和25.5 ku的香菇多糖。Hu等[11]用不同濃度的乙醇醇沉得到三組不同分子量的太子參多糖，發(fā)現(xiàn)中等分子量的太子參多糖具有更強(qiáng)的降血糖作用。本文研究得到了三種分子量分布不同的辣木葉多糖，為研究其活性的差異提供依據(jù)。

2.3 三種辣木葉多糖的紅外圖譜

從圖2可以看到，三種樣品均在3410 cm-1、2917 cm-1和1072 cm-1附近有特征峰，分別是O-H伸縮振動峰、C-H振動吸收峰、羧基的C-O伸縮振動峰，是多糖的典型峰，表明三種樣品都是多糖樣品；分別在1738 cm-1、1751 cm-1、1740 cm-1有吸收峰，表明三種辣木葉多糖都含有糖醛酸，是一種酸性多糖，這和離子色譜測出來的結(jié)果一致[12]。分別在887 cm-1、901 cm-1和890 cm-1有吸收峰，表明三種多糖是β構(gòu)型多糖。在1100～1010 cm-1都有兩個吸收峰，說明三種辣木葉多糖都是呋喃多糖，分別在1370 cm-1、1376 cm-1和1367 cm-1有特征峰，說明都有磷酸基的存在[13]。這些特征吸收峰表明這三種辣木葉多糖樣品具有典型的多糖特征吸收，且具有相似的官能團(tuán)。

2.4 螺旋性結(jié)構(gòu)

有研究表明，多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)與其活性密切相關(guān)。Maeda等[14]發(fā)現(xiàn)具有三螺旋結(jié)構(gòu)的β-（1,3）葡聚糖比不具有三螺旋結(jié)構(gòu)的β-（1,3）葡聚糖具有更強(qiáng)的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。故研究辣木多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)有助于研究其生理活性。剛果紅是一種酸性染料，溶于水和酒精，可與具有三螺旋構(gòu)象的多糖發(fā)生結(jié)合，從而使最大吸收波長變大，所以可以通過測量不同NaOH濃度下的多糖與剛果紅溶液的最大吸收波長來推測糖鏈結(jié)構(gòu)。

圖3 三種辣木葉多糖在不同NaOH濃度的溶液中螺旋-卷曲轉(zhuǎn)變分析Fig.3 Helix-coil transition analysis of the polysaccharides from three Moringa oleifera leaves in different NaOH concentrations

從圖3可以看到，在弱堿性條件下，三種辣木葉多糖組同control組相比，最大吸收波長發(fā)生紅移，其中PKM2和非洲辣木葉多糖均在NaOH濃度為0.05 M下最大吸收波長最大，PKM1辣木葉多糖在NaOH濃度為0.1 M時最大吸收波長最大，說明三種多糖在弱堿性條件下具有規(guī)則的三螺旋結(jié)構(gòu)，能與剛果紅試劑形成絡(luò)合物。隨著NaOH濃度的上升，三種辣木葉多糖的最大吸收波長都下降，說明在強(qiáng)堿性環(huán)境下，多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)開始解體。

2.5 原子力圖譜

多糖因為相對分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，自身常存在結(jié)構(gòu)缺陷，從而難以得到良好的晶形，原子力顯微鏡使得對多糖這樣的生物大分子表面形貌的觀察成為可能。

圖4 三種辣木葉多糖的原子力顯微鏡圖譜Fig.4 AFM images of polysaccharides from three Moringa oleifera leaves

由圖4可以看到，三種辣木葉多糖的AFM圖像有區(qū)別，PKM2和非洲辣木葉多糖的AFM圖像呈現(xiàn)球形的構(gòu)象，而PKM1辣木葉多糖AFM圖像呈現(xiàn)狀的構(gòu)象，下端有多分枝結(jié)構(gòu)。

2.6 三種辣木葉多糖的抗氧化活性

2.6.1 羥基自由基清除能力

羥基自由基是一種活性氧自由基，可在細(xì)胞內(nèi)與蛋白質(zhì)，脂類、DNA等各種生物大分子發(fā)生反應(yīng)，過量的自由基會誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化損傷。因此，從天然資源中篩選出一些具有抗羥自由基作用的非酶膳食抗氧化劑，對于增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)在活細(xì)胞中的功能極為重要[15]。

圖5 三種辣木葉多糖的羥基自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging ability of the polysaccharides from three Moringa oleifera leaves

從圖5中可以看出，三種辣木葉多糖對羥基自由基有一定的清除作用，且在0～5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)具有顯著的清除自由基能力，且呈現(xiàn)劑量依賴性。非洲辣木葉多糖和PKM1辣木葉多糖的清除自由基能力相當(dāng)，強(qiáng)于改良的PKM1辣木葉多糖，當(dāng)濃度為5 mg/mL時，非洲辣木葉多糖和PKM1辣木葉多糖對ABTS自由基的清除率分別達(dá)到了87.9%和84.5%。這些結(jié)果表明三種辣木葉多糖均具有抗氧化活性，其中非洲辣木葉多糖和PKM1辣木葉多糖的抗氧化活性最強(qiáng)，而這和前人的研究結(jié)果相似[8]。

2.6.2 DPPH自由基清除活性

DPPH是一種相對比較穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈紫色，在517 nm波長處具有特征吸收，而抗氧化劑能提供電子或氫質(zhì)子供給DPPH自由基，生成穩(wěn)定的化合物，從而使其溶液從紫色向無色轉(zhuǎn)變，其褪色程度與抗氧化劑的給電子能力呈正相關(guān)關(guān)系，因而用分光光度計進(jìn)行快速的定量評價樣品抗氧化能力[16]。

圖6 三種辣木葉多糖的DPPH自由基清除活性Fig.6 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging ability of the polysaccharides from Moringa oleifera leaves

從圖6中可以看出，三種辣木葉多糖對DPPH自由基均有一定的清除作用，且在0～2 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對自由基清除能力呈現(xiàn)劑量依賴性上升，當(dāng)濃度為2 mg/mL時，PKM1辣木葉多糖、非洲辣木葉多糖和PKM2辣木葉多糖的DPPH自由基清除率分別為49.8%、34.4%和27.4%，繼續(xù)增加樣品濃度，其自由基清除率無顯著性變化。盡管三種辣木葉多糖對DPPH自由基的清除能力均低于Vc，但由于其良好的抗氧化活性和較低的副作用，可開發(fā)一種天然的抗氧化劑。

2.6.3 ABTS自由基清除能力

圖7 三種辣木葉多糖的ABTS自由基清除能力Fig.7 2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt (ABTS) radical scavenging ability of polysaccharides from three Moringa oleifera leaves

從圖7可以看出，三種辣木葉多糖對ABTS自由基有一定的清除作用，且在0～5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性上升。其中非洲辣木葉多糖>PKM1辣木葉多糖>PKM2辣木葉多糖。當(dāng)樣品濃度5 mg/mL時，非洲辣木葉多糖和PKM1辣木葉多糖對ABTS自由基的清除率分別達(dá)到了90.5%和87.5%，表明辣木葉多糖具有較顯著的ABTS清除能力。研究表明相比高分子量的多糖，中等或低分子量多糖具有較好的抗氧化活性[17]；此外，研究表明多糖的抗氧化活性與其蛋白質(zhì)、硫酸基和糖醛酸含量相關(guān)[6]。以上結(jié)果表明非洲辣木葉多糖和PKM1辣木葉多糖的抗氧化能力強(qiáng)于PKM2辣木葉多糖，其差異性主要由于其化學(xué)組成和結(jié)果不同。

3 結(jié)論

3.1 PKM1辣木葉、PKM2辣木葉和非洲辣木葉的多糖得率分別為6.84%、4.67%和3.78%。化學(xué)組成分析表明三種辣木葉多糖含有不同含量的總糖、蛋白質(zhì)、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，其中PKM1辣木葉多糖的總糖含量最高，其次是非洲辣木葉多糖和PKM2辣木葉多糖。

3.2 三種辣木葉多糖的分子量分布不同，均由半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖和木糖組成，主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，其摩爾百分比能達(dá)到90%以上，是一種β構(gòu)型的呋喃酸性多糖，具有相似的官能團(tuán)，在弱堿性條件下都具有三螺旋結(jié)構(gòu)。

3.3 三種辣木葉多糖均具有DPPH、ABTS和OH-自由基清除活性，且非洲辣木葉多糖和PKM1辣木葉多糖的清除自由基能力顯著大于PKM2辣木葉多糖，其活性差異主要由于化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)不同造成的。

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