復(fù)方蒼術(shù)方調(diào)節(jié)腸道菌群及腸道保護作用的研究

曾宏亮，肖滿，陳波，曾文彬

（1.中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 410013）（2.湖南方盛制藥股份有限公司，國家級博士后工作站，湖南長沙 410205）

腸道菌群是人體最龐大、最重要的微生態(tài)系統(tǒng)，健康成人腸道棲息著多達500余種細菌，包含的細菌數(shù)達1014個，其基因組信息的總和被稱“腸道元基因組”，是控制人體健康的“人體第二基因組”。隨著研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在消化過程發(fā)揮作用，還與人體健康有著極為密切的聯(lián)系，腸道菌群不僅參與宿主的消化、吸收、代謝、營養(yǎng)和免疫等生理過程，且與機體形成相互依存、相互收益、相互協(xié)調(diào)又相互制約的動態(tài)平衡。腸道菌群的平衡分布對人體健康尤為重要，與胃腸道疾病、阿爾茲海默癥、肥胖、糖尿病、心血管疾病及自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[1]。

小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要場所，小腸黏膜結(jié)構(gòu)是抵抗有害菌入侵的堅固壁壘，同時腸道菌群形成一道生物保護屏障，對外來致病菌的侵入、定植起到拮抗作用，并且有助于腸道微絨毛的產(chǎn)生。小腸絨毛（A）可在環(huán)形皺襞的基礎(chǔ)上進一步增大小腸吸收的面積，同時也起到過濾物質(zhì)的作用，其對應(yīng)的隱窩（V）深度越淺，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力更強，二者的比值（A/V）是衡量小腸消化吸收功能的重要指標。此外，人體腸道雙歧桿菌等厭氧菌的繁殖，以及對乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生豐富短鏈脂肪酸，導(dǎo)致腸道pH不斷下降，抑制潛在致病菌生長，但當腸道菌群失衡時，腸道優(yōu)勢菌下降，產(chǎn)酸能力下降，導(dǎo)致pH上升，因此腸道內(nèi)環(huán)境pH與腸道菌群的結(jié)構(gòu)與數(shù)目息息相關(guān)[2]。

低聚半乳糖能使腸道益生菌大量增殖，形成數(shù)量優(yōu)勢，然后促進分泌更多的短鏈脂肪酸，形成酸性環(huán)境，抑制致病菌的正常生長，并且能夠促進腸道蠕動，從而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，具有公認的調(diào)節(jié)腸道菌群作用[3,4]。然而，越來越多的中草藥或其制劑調(diào)節(jié)胃腸道功能的研究結(jié)果表明，中草藥能夠抗腹瀉、扶植正常菌群生長，調(diào)節(jié)失調(diào)菌群，提高益生菌的定植能力，是理想的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑[5,6]。進一步的研究表明中草藥與微生態(tài)制劑在調(diào)節(jié)腸道菌群方面作用相同，殊途同歸，二者聯(lián)用效果更佳[7,8]。

本研究將低聚半乳糖與祛濕降濁、保健脾胃類中藥組方聯(lián)用，即復(fù)方蒼術(shù)方，觀察該配方對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、腸道微環(huán)境、腸粘膜屏障的影響，綜合評價其對胃腸功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 受試物

復(fù)方蒼術(shù)方；深褐色懸濁液，口服液體玻璃瓶密封包裝，10 mL/支，主要成分為蒼術(shù)1 g、薏苡仁1.5 g、蒲公英0.5 g，山楂1 g及低聚半乳糖漿2.25 g，由中南大學(xué)藥學(xué)院提供。低聚半乳糖為無色透明狀糖漿；250 mL/瓶，純度為43%，質(zhì)量標準符合新食品原料的規(guī)定，批號709387，購自戴緯林國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 實驗動物

雄性Balb/c小鼠60只（SPF級），平均體重21.2 g，體重范圍19.2～22.9 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。實驗動物質(zhì)量合格證號：No.43004700 028802。雄性ICR小鼠60只（SPF級），平均體重23.4 g，體重范圍為20.5～24.9 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號：No.430047 00028716。

1.3 主要試劑與儀器

主要試劑：0.01M pH 7.2磷酸鹽緩沖液；伊紅美藍瓊脂（EMB，批號3105410，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；BBL瓊脂（批號20161109，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；LBs瓊脂（批號160525，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；胰?-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂（TSC，批號160601，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；腸球菌（疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷）瓊脂（批號160512，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；D-環(huán)絲氨酸（批號161020，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；檸檬酸鐵銨（批號160728，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；復(fù)方地芬諾酯片（每片含鹽酸地芬諾脂2.5 mg，批號1507013，常州康普藥業(yè)有限公司，有效期至2018.06）；阿拉伯樹膠（批號20160104，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。主要儀器：BSC-1100ⅡA2-X型生物安全柜（濟南鑫貝西生物有限公司）；PYL-230型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市萊伯特瑞）；BX43型生物顯微鏡+MD50型數(shù)碼成像系統(tǒng)（奧林巴斯）；PHSJ-5型pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.4 實驗方法[9,10]

1.4.1 劑量設(shè)計

復(fù)方蒼術(shù)方人體擬食用量為20 mL/日，成人體重按60 kg計，該試驗將復(fù)方蒼術(shù)方人體推薦食用量的5倍、10倍、20倍，分別設(shè)置為低、中、高劑量組；陽性對照品低聚半乳糖糖漿人體推薦食用量為4.5 g/日，該試驗采用人體推薦食用量的10倍進行試驗，即給樣劑量為0.75 g/kg（即1.74 mL原液/kg）。

1.4.2 分組及給藥

選取檢疫合格的雄性Balb/c小鼠60只（SPF級），體重范圍19.2～22.9 g，實驗動物按體重隨機分為5組，即溶媒對照組、陽性對照組、復(fù)方蒼術(shù)方低劑量組、復(fù)方蒼術(shù)方中劑量組、復(fù)方蒼術(shù)方高劑量組，每組12只，按20 mL/kg灌胃給予相應(yīng)受試物（溶媒對照組灌胃給予等量蒸餾水），每日一次，連續(xù)給樣30 d。給予受試物前及末次給樣24 h后檢測腸道菌群、盲腸內(nèi)容物pH，并對十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸做病理切片，測量小腸絨毛長度、隱窩深度以及二者的比值。

選取檢疫合格的雄性ICR小鼠60只（SPF級），體重范圍為20.5～24.9 g，實驗動物按體重隨機分為6組，即溶媒對照組、模型對照組、復(fù)方蒼術(shù)方低劑量組、復(fù)方蒼術(shù)方中劑量組、復(fù)方蒼術(shù)方高劑量組、陽性對照組，每組10只，按20 mL/kg灌胃給予相應(yīng)受試物，溶媒對照組、模型對照組、陽性對照組灌胃給予等量蒸餾水或低聚半乳糖溶液，每日一次，連續(xù)給樣30 d，用于檢測小腸推進率。

1.4.3 腸道菌群培養(yǎng)計數(shù)

雄性Balb/c小鼠給予受試物前及末次給樣后24 h，按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》2003版規(guī)定檢測腸道菌群菌落數(shù)，連續(xù)兩只小鼠的糞便放入同一無菌離心管，結(jié)果以菌落數(shù)的對數(shù)值（lg CFU）表示，并按規(guī)范規(guī)定的結(jié)果判定標準對實驗結(jié)果進行分析。

1.4.4 盲腸內(nèi)容物pH值

末次給樣24 h后，取盲腸內(nèi)容物于離心管內(nèi)，稱重，用單蒸水以1:9稀釋樣品，渦旋、超聲混勻，3000 r離心5 min，取上清液測定pH值，每個樣品重復(fù)測三次，計算平均值。

1.4.5 腸道病理形態(tài)學(xué)分析及粘膜結(jié)構(gòu)觀察

取小鼠胃腸組織，用10%福爾馬林溶液固定后，分別取十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸進行常規(guī)石蠟包埋、切片、染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察小腸粘膜結(jié)構(gòu)，每段小腸取3張切片，每張切片選2～5個視野拍照，應(yīng)用Leica照相處理軟件拍照，每張照片測量5根最長腸絨毛的長度（以腸腺絨毛連接處到絨毛頂端為準）及對應(yīng)的隱窩深度（以腸腺絨毛連接處到腸腺基部為準），并計算二者的比值（A/V）。

1.4.6 小腸推進率測定

ICR小鼠末次給樣前禁食不禁水14 h，按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》2003版規(guī)定檢測推進率。

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學(xué)意義的水平設(shè)定為p<0.05，計量資料采用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，用Leven’s test方法檢驗正態(tài)性和方差齊性，如果符合正態(tài)性和方差齊性（p>0.05），用單因素方差分析（ANOVA）和LSD test進行統(tǒng)計分析；如果不符合正態(tài)性和方差齊性（p≤0.05），則用Kruskal-Wallis檢驗。

如果Kruskal-Wallis檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義（p≤0.05），則用Dunnett’s Test（非參數(shù)方法）進行比較分析；重復(fù)測量資料，滿足球?qū)ΨQ和齊性時，采用單樣本重復(fù)測量資料方差分析或成組重復(fù)測量資料方差分析，不符合球?qū)ΨQ時，要校正F界值；評價時考慮統(tǒng)計學(xué)差異和生物學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 復(fù)方蒼術(shù)方對小鼠體重的影響

如表1～2所示，與溶媒對照組相比，調(diào)節(jié)腸道菌群試驗和小腸推進試驗各給樣組動物在各稱重時間點的平均體重均未見統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。

表1 復(fù)方蒼術(shù)方對調(diào)節(jié)腸道菌群試驗小鼠體重的影響(±SD，n=12)Table 1 Effects of Atractylodes Decoction prescription on the body weight of Balb/c mice in intestinal flora experiment

表1 復(fù)方蒼術(shù)方對調(diào)節(jié)腸道菌群試驗小鼠體重的影響(±SD，n=12)Table 1 Effects of Atractylodes Decoction prescription on the body weight of Balb/c mice in intestinal flora experiment

注：與溶媒對照組相比，*p<0.05。

組別體重/g第0周 第1周 第2周 第3周 第4周溶媒對照組 21.1±1.0 24.1±1.2 25.3±1.1 25.7±1.4 26.5±1.2陽性對照組 20.7±0.9 23.0±0.9 24.7±1.1 24.8±1.0 25.9±1.0復(fù)方蒼術(shù)方低劑量組 20.9±0.7 23.2±1.1 24.2±1.2 24.8±1.3 26.0±1.3復(fù)方蒼術(shù)方中劑量組 20.8±1.0 23.2±1.7 24.0±1.7 24.7±1.2 25.7±1.3復(fù)方蒼術(shù)方高劑量組 20.9±1.2 23.4±1.5 24.4±1.6 24.8±1.6 26.0±1.7

表2 復(fù)方蒼術(shù)方對小腸推進試驗小鼠體重的影響(X±SD，n=10)Table 2 Effects of Atractylodes Decoction prescription on the body weight of Balb/c mice in intestine propulsion experiment

2.2 腸道菌群菌落數(shù)

試驗結(jié)果表明：按lg CFU計，給樣前各組間小鼠糞便腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異。給樣后，與溶媒對照組相比，陽性對照組腸桿菌數(shù)顯著降低（p<0.01），復(fù)方蒼術(shù)方中、高劑量組雖具有降低趨勢，但未見統(tǒng)計學(xué)差異；復(fù)方蒼術(shù)方高劑量組及陽性對照組腸桿菌菌落數(shù)與同組給樣前相比均明顯或顯著降低（p<0.05或p<0.01），lg CFU降低率分別為8.17%、11.86%（圖1）。與溶媒對照組相比，復(fù)方蒼術(shù)方低、高劑量組及陽性對照組腸球菌數(shù)均明顯降低（p<0.05）；復(fù)方蒼術(shù)方中、高劑量組腸球菌菌落數(shù)與同組給樣前相比均明顯降低（p<0.05），lg CFU降低率分別為6.35%、5.69%（圖2）。

圖1 復(fù)方蒼術(shù)方對小鼠糞便腸桿菌的影響(C-復(fù)方蒼術(shù)方)Fig.1 Effects of Atractylodes decoction prescription on the Escherichia coli of faeces in mice

圖2 復(fù)方蒼術(shù)方對小鼠糞便腸球菌的影響（C-復(fù)方蒼術(shù)方）Fig.2 Effects of Atractylodes decoction prescription on the enterococcus of faeces in mice

與溶媒對照組相比，除復(fù)方蒼術(shù)方中劑量組乳桿菌外，各劑量組及陽性對照組雙歧桿菌、乳桿菌菌落數(shù)均明顯或顯著增加（p<0.05或p<0.01）；復(fù)方蒼術(shù)方中、高劑量組雙歧桿菌、乳桿菌菌落數(shù)與同組給樣前相比亦均明顯或顯著增加（p<0.05或p<0.01），lg CFU增加率分別為6.99%、8.10%、7.04%及6.74%；與陽性對照組相比，復(fù)方蒼術(shù)方高劑量組乳桿菌菌落數(shù)及中、高劑量組雙歧桿菌菌落數(shù)均明顯增加（p<0.05），lg CFU增加率分別為3.03%、2.00%及2.33%（圖3～4）。給樣后復(fù)方蒼術(shù)方各劑量組及陽性對照組產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)未見統(tǒng)計學(xué)差異（圖5）。

圖3 復(fù)方蒼術(shù)方對小鼠糞便乳桿菌的影響（C-復(fù)方蒼術(shù)方）Fig.3 Effects of Atractylodes decoction prescription on the lactobacillus of faeces in mice

圖4 復(fù)方蒼術(shù)方對小鼠糞便雙歧桿菌的影響（C-復(fù)方蒼術(shù)方）Fig.4 Effects of Atractylodes decoction prescription on the bifidobacteria of faeces in mice

圖5 復(fù)方蒼術(shù)方對小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌的影響（C-復(fù)方蒼術(shù)方）Fig.5 Effects of Atractylodes decoction prescription on the clostridium perfringens of faeces in mice

2.3 盲腸內(nèi)容物pH

圖6 復(fù)方蒼術(shù)方對小鼠盲腸內(nèi)容物pH值影響（C-復(fù)方蒼術(shù)方）Fig.6 Effects of Atractylodes decoction prescription on pH value

如圖6所示，與溶媒對照組相比，復(fù)方蒼術(shù)方中、高劑量組小鼠盲腸內(nèi)容物pH值均顯著降低（p<0.01），陽性對照組盲腸內(nèi)容物pH值具有降低趨勢，但未見統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 腸道粘膜結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

給樣30 d后，與溶媒對照組相比，復(fù)方蒼術(shù)方各劑量組十二指腸、空腸、回腸絨毛長度均不同程度的增長，高劑量組十二指腸絨毛長度顯著增長（p<0.01）；其對應(yīng)的隱窩深度均不同程度變淺，中劑量組十二指腸、高劑量組回腸以及中、高劑量組空腸隱窩深度均明顯或顯著變淺（p<0.05或p<0.01）。

與陽性對照組相比，中劑量組十二指腸以及低、中、高劑量組回腸隱窩深度亦明顯或顯著變淺（p<0.05或p<0.01）。低劑量組十二指腸、回腸及中、高劑量組十二指腸、空腸、回腸A/V比值明顯或顯著增加（p<0.05或p<0.01），增加率分別為29.84%、17.47%、56.01%、31.18%、20.09%、46.51%、30.52%和20.09%，與陽性對照組相比復(fù)方蒼術(shù)方中、高劑量組空腸、回腸A/V比值亦明顯或顯著增加（p<0.05或p<0.01），增加率分別為12.08%、11.51%、15.06%和15.06%（如表3～5所示）。

表3 復(fù)方蒼術(shù)方對Balb/c小鼠十二指腸粘膜結(jié)構(gòu)的影響(X±SD，n=6)Table 3 Effects of Atractylodes Decoction prescription on the duodenal mucosal structure in Balb/c mice

表4 復(fù)方蒼術(shù)方對Balb/c小鼠空腸粘膜結(jié)構(gòu)的影響(X±SD，n=6)Table 4 Effects of Atractylodes Decoction prescription on the jejunal mucosal structure in Balb/c mice

表5 復(fù)方蒼術(shù)方對Balb/c小鼠回腸粘膜結(jié)構(gòu)的影響(X±SD，n=6)Table 5 Effects of Atractylodes Decoction prescription on the ileal mucosal structure in Balb/c mice

2.5 墨汁推進率

圖7 復(fù)方蒼術(shù)方對小鼠小腸墨汁推進率影響（C-復(fù)方蒼術(shù)方）Fig.7 Effects of Atractylodes decoction prescription on the intestinal propulsion rates in mice

如圖7所示，與溶媒對照組相比，模型對照組墨汁推進率顯著降低（p<0.01）。與模型對照組相比，復(fù)方蒼術(shù)方各劑量組動物墨汁推進率呈劑量依賴性顯著增加（p<0.01），增加率分別為43.92%、69.93%和98.31%，陽性對照組墨汁推進率亦明顯增加（p<0.05）；與陽性對照組相比，復(fù)方蒼術(shù)方中、高劑量組墨汁推進率顯著增加（p<0.01），增加率分別為30.31%和52.07%。

3 討論

腸道菌群與機體形成相互依存、相互收益、相互協(xié)調(diào)又相互制約的動態(tài)的統(tǒng)一平衡體，稱為腸道微生態(tài)平衡?，F(xiàn)有研究表明多種胃腸道疾病、肥胖、糖尿病、心血管疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展的過程中均伴有腸道菌群失衡現(xiàn)象[1]。益生菌制劑通過補充有益菌達到菌群平衡的狀態(tài)，而中藥可以通過抑制某些致病菌或者促進有益菌的增殖來維持菌群平衡。中藥的這種雙向調(diào)節(jié)功能對于嚴重疾病的治療方面明顯優(yōu)于益生菌制劑。

隨著人們對腸道菌群與疾病發(fā)生及人體健康之間相關(guān)性認識的日益深入，中藥對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用也日益受到研究者的關(guān)注。研究表明多種中藥及其活性成分如四君子湯[11]、黨參多糖[12]等均能促進腸道益生菌的生長，中藥對人腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，也可能是其發(fā)揮藥效作用的重要環(huán)節(jié)之一。復(fù)方蒼術(shù)方組方合理，山楂消食開胃，蒲公英清熱解毒，蒼術(shù)燥濕健脾，薏苡仁滲濕健脾[13]，配伍使用具有健脾開胃、行氣消食及清熱解毒之功效。將公認的益生元低聚半乳糖與祛濕降濁、健脾開胃類中藥配伍聯(lián)用形成復(fù)方蒼術(shù)方（原料為低聚半乳糖、蒼術(shù)、薏苡仁、蒲公英、山楂），觀察該配方對腸道菌群功能和胃腸蠕動的調(diào)節(jié)作用。

本研究按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中調(diào)節(jié)腸道菌群試驗、小腸推進試驗方法的規(guī)定及相關(guān)文獻資料報道的檢測腸道pH值和腸道粘膜結(jié)構(gòu)等研究方法，綜合評價復(fù)方蒼術(shù)方對腸道菌群、腸道pH值及胃腸蠕動功能的調(diào)節(jié)作用。試驗結(jié)果表明復(fù)方蒼術(shù)方能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善腸道微環(huán)境，增強腸道粘膜屏障作用，促進胃腸蠕動功能，且效果優(yōu)于單用低聚半乳糖。上述結(jié)果提示，復(fù)方蒼術(shù)方可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)改善腸道微環(huán)境，且效果優(yōu)于單用低聚半乳糖。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方蒼術(shù)方具有改善腸道菌群的作用，同時對腸道微環(huán)境具有一定的調(diào)節(jié)作用，且效果優(yōu)于單用低聚半乳糖，提示復(fù)方蒼術(shù)方可用于改善腸道菌群保健食品的開發(fā)。

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