乳酸菌耐鹽分子機制研究進展

林松洋，郝利民*，劉 鑫，魯來政，康巧珍，魯吉珂,*

乳酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物并產生乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱。乳酸菌的發(fā)酵作用可以改善產品風味，延長產品的貨架期等。因此乳酸菌作為一種重要的工業(yè)微生物，廣泛應用于食品發(fā)酵行業(yè)[1]。由于高濃度的鹽能夠抑制一些導致食品腐敗的微生物和一些病原微生物的生長，同時根據產品加工工藝要求，在醬油、熏肉、泡菜等發(fā)酵食品制備過程中通常會加入大量的食用鹽，既滿足了產品的風味要求，又可以延長食品的保質期。但高濃度鹽是乳酸菌發(fā)酵過程的不利因素，其會改變細胞外界滲透壓，引起菌體細胞體積縮小，導致胞內各種生理代謝活動紊亂甚至死亡。因此乳酸菌在高鹽環(huán)境下的生存能力對發(fā)酵食品的品質起著關鍵作用。為了開發(fā)耐鹽乳酸菌，或尋找合適的鹽脅迫保護物質，需要更深入地了解乳酸菌的耐鹽機制。本文對鹽脅迫下乳酸菌調節(jié)胞內滲透壓的機制進行了詳細闡釋，旨在尋找與乳酸菌鹽脅迫適應相關的代謝通路以及相應具有調節(jié)作用的保護物質，以期為采用基因工程、發(fā)酵工程和酶工程等手段提高鹽脅迫環(huán)境乳酸菌的存活率提供理論依據，進而為更有效地利用乳酸菌提供參考[2]。

1 國內外乳酸菌耐鹽文獻總結

在Web of Science分別以Lactobacillus salt tolerance（乳酸菌耐鹽）以及salt tolerance（耐鹽）為主題進行檢索（截止到2017年7月10日），文獻數如圖1所示。近20 年來，研究者對耐鹽相關的研究快速增多，自2011年以來，每年發(fā)表論文超過2 000 篇，生物耐鹽方向已逐漸成為研究熱點；乳酸菌耐鹽的報道相對較少，但是相關研究也受到越來越多人的關注，每年發(fā)表論文量也呈現遞增趨勢。目前乳酸菌耐鹽研究主要集中在耐鹽菌種和保護劑篩選，以及微生物耐鹽機制的研究。總體來說，關于乳酸菌耐鹽的報道只占細胞耐鹽機制研究總體中極少的一部分，而且研究還不夠深入，導致對于乳酸菌耐鹽機制的了解不夠。目前開發(fā)耐鹽乳酸菌的工作仍以傳統(tǒng)的從高鹽環(huán)境篩選耐鹽菌種為主，工作量大而繁瑣；而采用基因工程等新技術手段開發(fā)耐鹽乳酸菌具有效率高、周期短等優(yōu)點，因此研究乳酸菌的耐鹽分子機制具有十分重要的價值。

圖1 Web of Science分別以Lactobacillus salt tolerance以及salt tolerance為主題檢索到的文獻數Fig. 1 Number of publications searched in Web of Science database on Lactobacillus salt tolerance and salt tolerance, respectively

2 乳酸菌耐鹽機制

目前研究乳酸菌的耐鹽分子機制涉及到細胞內的許多調控系統(tǒng)，現將已報道的各種乳酸菌對應涉及到的各類耐鹽調控機制總結如表1所示，并圍繞此將國內外研究綜述如下。

表1 乳酸菌耐鹽機制相關研究Table 1 Summary of studies regarding salt tolerance mechanism of LAB

2.1 相容性溶質調控系統(tǒng)

自Brown等[22]在1972年首次提出相容性溶質的概念以來，研究者已經發(fā)現了許多種類的相容性物質，如甘氨酸甜菜堿、海藻糖、脯氨酸、脯氨酸甜菜堿、四氫嘧啶、肉毒堿等[23-24]。這些溶質通常是水溶性物質，結構類似，存在較多的氫鍵，能夠取代水與蛋白質等胞內生物大分子結合，減少細胞失水從而穩(wěn)定這些大分子的天然構象[12]。當細胞外滲透壓升高時，乳酸菌能夠通過積累相容性溶質來維持細胞正常的滲透壓；當胞外的滲透壓降低時，這些相容性物質又能夠迅速地釋放出來。盡管大部分乳酸菌會采用吸收相容性物質這種機制來維持細胞的正常滲透壓，而且它們所采用的結合底物的能量耦合機制基本相同，但是不同乳酸菌積累的相容性分子類型以及積累機制是不同的[25-28]。已報道的主要涉及植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等菌株。

圖2 Lactobacillus plantarum的滲透調節(jié)模式[27]Fig. 2 Osmoregulation modes of Lactobacillus plantarum[27]

在高滲透壓條件下，L. plantarum細胞質中積累的主要相容性物質是甘氨酸甜菜堿。L. plantarum自身不能合成或代謝產生甘氨酸甜菜堿，因此細胞對甘氨酸甜菜堿吸收和外排的相對速率決定了其胞內甘氨酸甜菜堿的最終積累水平。甘氨酸甜菜堿的吸收和外排由多個系統(tǒng)介導[3]。QacT是其中最重要的一個轉運系統(tǒng)，屬于ATP結合盒（ATP binding cassette，ABC）轉運子超家族的一員。該系統(tǒng)由ATP驅動，對甘氨酸甜菜堿的親和性較強，對脯氨酸和其他類似物的親和性較弱[29]。如圖2所示，在正常滲透壓狀態(tài)下，L. plantarum通過QacT攝取和SES排出甘氨酸甜菜堿，二者之間維持在一個平衡狀態(tài)。當細胞處于高滲透壓情況下，甘氨酸甜菜堿攝入量增加，而外排則受到抑制。當細胞外界滲透壓低于正常細胞滲透壓時，QacT轉運系統(tǒng)被抑制，而外排系統(tǒng)被激活，甘氨酸甜菜堿首先通過一個機械力敏感通道，即SES，以較快的速度被排出胞外；接著通過一個單向EC，以緩慢速度外排，用于調整細胞膨壓；當滲透壓低于一定程度時這些通道被關閉[4,30]。這些與相容性物質運輸相關的調控系統(tǒng)在L. plantarum鹽脅迫應答中起到了重要作用。

研究表明L. lactis在面臨鹽脅迫時采用甜菜堿轉運系統(tǒng)（betaine uptake system，BusA），即OpuA，運輸甘氨酸甜菜堿，維持細胞正常滲透壓[31]。BusA作為一個操縱子編碼BusA轉運蛋白，屬于ABC轉運系統(tǒng)家族的一員，由2 個亞基組成，其中一個亞基由2 個相同的核苷酸結合位點（nucleotide binding domain，NBD）結合在β-胱硫醚合成酶（beta-cystathionine synthase，CBS）上形成；另外一個亞基由鑲嵌在跨膜區(qū)域的兩個相同的底物結合域組成，兩個亞基分別為OpuAA和OpuABC[5,32-33]。Patzlaff等[34]通過酶動力學方法研究發(fā)現在OpuA轉運系統(tǒng)中，甘氨酸甜菜堿首先結合到底物結合域，然后通過兩步ATP與ATP酶亞基的結合反應，實現對甘氨酸甜菜堿的轉運吸收。其中一個ATP水解釋放能量將OpuA從順式變成反式構象，從而允許底物在細胞質膜內表面釋放；第二個ATP用于重置系統(tǒng)，即將OpuA從反式轉變回順式狀態(tài)，從而構成一個轉運循環(huán)。當細胞外滲透壓變化時，BusA轉運甘氨酸甜菜堿的能力被激活，且其轉運活力受到細胞質膜兩側的離子強度和膜的物理性質變化的影響。Bouvier等[6]研究表明BusA轉運蛋白表達受到一個由busR基因編碼的調控子的調節(jié)，busR能夠與busA啟動子的一個序列重復區(qū)域結合，抑制busA基因的轉錄，進而影響細胞對甘氨酸甜菜堿的吸收；同時busR基因能夠增強細胞對滲透壓變化的敏感性。在細胞面臨鹽脅迫同時培養(yǎng)基中甘氨酸甜菜堿匱乏的情況下，L. lacits會通過積累BusA轉運蛋白在細胞質中迅速積累甘氨酸甜菜堿，但是過多的甘氨酸甜菜堿又會抑制busA基因的轉錄；當胞外甘氨酸甜菜堿濃度飽和時，busA基因的轉錄水平迅速提高，使細胞內BusA轉運蛋白的合成水平與細胞質內積累的甘氨酸甜菜堿水平相一致；這也說明了busA操縱子能夠調節(jié)外界滲透壓，同時也能夠感受外界滲透壓的變化。這種調節(jié)機制與大腸桿菌中proU操縱子的調節(jié)機制類似。研究還發(fā)現，細胞外滲透壓升高會使busA啟動子上的BusR蛋白被取代，緩解BusR蛋白對busA基因轉錄的抑制，從而增強細胞對甘氨酸甜菜堿的轉運能力[7,35-37]。

對P. pentosaceus滲透保護研究只涉及到不同相容性物質保護效果考察，而沒有涉及到轉運系統(tǒng)調節(jié)等方面的深入研究。Baliarda等[8]研究發(fā)現，在含有0.8 mol/L NaCl的特定培養(yǎng)基中分別添加甘氨酸甜菜堿、二甲基乙酸噻亭（硫代甜菜堿）、膽堿、脯氨酸或肉毒堿，均能夠緩解鹽脅迫P. pentosaceus生長的抑制。在細胞轉運這5 種相容性物質時，其他4 種化合物和甘氨酸甜菜堿之間能夠產生轉運競爭，因此推測P. pentosaceus中可能存在一種轉運蛋白能夠同時轉運這5 種物質。研究還發(fā)現P. pentosaceus和L. plantarum在特定培養(yǎng)基中的耐鹽能力相差不大，且二者在鹽脅迫下細胞內積累的相容性溶質種類也相似，不同的是肉毒堿對P. pentosaceus在鹽脅迫下生長的影響相對L. plantarum較弱。對P. pentosaceus相容性物質的轉運機制有待更深一步的研究。

2.2 糖酵解關鍵酶調控系統(tǒng)

乳酸菌主要通過相對簡單的代謝途徑使底物磷酸化產生細胞代謝所需要的能量（ATP）：糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑和磷酸酮解酶（phosphoketolase，PK）途徑。對于乳酸桿菌屬，根據其不同的代謝發(fā)酵方式，可以將其分為3 種類型。Ⅰ型乳酸桿菌是專一性的同型乳酸發(fā)酵，通過EMP途徑將己糖（如葡萄糖）發(fā)酵形成乳酸鹽，但不能代謝戊糖和葡萄糖酸鹽。Ⅱ型乳酸桿菌是兼性異型乳酸發(fā)酵，可通過EMP將己糖轉化為乳酸，也可被誘導產生磷酸酮酶，催化戊糖產生乳酸和乙酸。Ⅲ型乳酸桿菌是專一性的異型乳酸發(fā)酵，通過PK途徑將己糖代謝形成乳酸、乙醇或乙酸和二氧化碳。EMP反應是這些代謝途徑中最重要的第一步反應[38]。代謝途徑中的關鍵酶為磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、果糖二磷酸醛縮酶（fructosediphosphate aldolase，FBA）、磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceric kinase，PGK）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）[9]。另外，乳酸菌從胞外吸收糖分子，進行EMP時，糖類物質必須經過磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvate phosphotransferase system，PTS），被磷酸化后才能被菌體轉運到細胞質中參與糖代謝，其中的某些組分在細胞面臨滲透脅迫、調節(jié)胞內代謝、減少細胞損傷等過程中發(fā)揮了重要作用[10,39]。

EMP是乳酸菌生成乳酸的主要途徑，基因pfk、fba、pgk、ldh對應所編碼的蛋白酶均是乳酸菌EMP途徑中的關鍵酶。有研究表明基因pfk、fba、pgk、ldh均受培養(yǎng)基中NaCl的誘導而表達上調，并且NaCl濃度越高，基因受誘導表達上調越顯著。乳酸菌培養(yǎng)基（de Man，Rogosa and Sharpe broth，MRS）中的NaCl造成菌體外部滲透壓變大，這會對基因pfk、fba、pgk、ldh編碼的蛋白分子結構有一定破壞作用[9]。為保護自身不受破壞，乳酸菌中與EMP相關的一系列關鍵酶受到高滲透壓脅迫的誘導，相應基因表達上調，保證了EMP途徑高效進行，以適應不利環(huán)境[11]。Prasad等[12]對高滲條件處理后的細胞提取物進行液質分析，與對照組對比發(fā)現，細胞內的甘油量較少，而單糖、二糖、三糖等小分子糖的量較多，說明細胞內的許多大分子的還原性末端被甘油基團修飾。在脫水條件下，甘油分子修飾多糖將增加糖類等大分子中可用的羥基數，增強細胞大分子之間（通過氫鍵）的相互作用進而保護大分子，可提高高滲條件下菌體細胞的穩(wěn)定性[40]。

2.3 熱休克蛋白調控系統(tǒng)

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是細胞中普遍存在的ATP依賴性分子伴侶，在細胞中的蛋白質質量控制中起關鍵作用。HSP能夠防止各種非天然底物蛋白質的聚集或失活，通過自身或在其他ATP依賴性分子伴侶的幫助重新折疊這些底物，修復受損的蛋白質分子，在細胞脅迫應答中扮演了重要角色。在Lactobacillus rhamnosus中應激蛋白GroEL和DnaK可作為分子伴侶，以短暫的非共價方式與蛋白底物結合，阻止蛋白前體折疊，促進體內蛋白正確合成[41-42]。同時GroEL能夠作為RNA分子伴侶保護mRNA，防止其被核酸酶降解[43-44]；GroEL和DnaK上調后能夠保護細胞內蛋白和其他大分子，防止由環(huán)境脅迫誘導造成的細胞大分子損傷和降解[13-14]。

在L. lactis中，編碼DnaK的結構基因位于orf1-grpE-dnaK操縱子上[16]。DnaK操縱子的啟動子區(qū)域中存在兩個與分子伴侶表達相關的反向重復序列（controling inverted repeat of chaperone expression，CIRCE）調控元件，其中一個CIRCE元件位于GroEL操縱子的啟動子區(qū)域中[15]。在各種革蘭氏陽性細菌和藍細菌的熱休克基因的啟動子區(qū)域中已經發(fā)現CIRCE元件，例如DnaK、GroEL和GroES[45]。研究已經發(fā)現，枯草芽孢桿菌的orf39-grpE-dnaK操縱子中的orf39編碼阻遏蛋白，結合CIRCE元件，并且負責基因的熱休克控制[46-47]。目前尚不清楚阻遏物的DNA結合活性如何隨溫度的升高而改變。負責CIRCE元件的熱應激調控基因HrcA與L. lacits的DnaK操縱子中orf1基因同源[16]。因此，研究者推測在L. lactis中的DnaK，GroEL和GroES的表達會受到由orf1基因編碼阻遏物的控制。在乳球菌的鹽脅迫應答反應過程中，高滲透壓會使細胞質壁分離，水分活度降低，從而導致變性蛋白的積累，進而誘導HSP調控系統(tǒng)來保護細胞內蛋白和其他大分子，防止由鹽脅迫造成的細胞損傷[48]。

2.4 胞內離子平衡

高滲透壓條件下，細菌內Na＋的調節(jié)主要依賴于Nha。該蛋白屬于次級轉運子，位于原核生物的細胞質膜上，能夠促進Na＋的排出和質子的進入，同時參與維持胞內正常滲透壓和酸堿環(huán)境。從反向轉運蛋白結構上分，Na＋轉運可以分為2 類系統(tǒng)：一類為由6 個或7 個基因編碼的異源低聚體，另一類為單基因編碼形成的轉運蛋白。NhaA即為大腸桿菌中主要的Na＋/H＋轉運蛋白，由單基因編碼，負責Na＋和Li＋的運輸，對于pH值變化極其敏感，每2 個質子可以交換轉運2個Na＋或Li＋，能夠提高細胞的高滲透壓耐性[49-51]。NhaB是另外一個對細胞生長非常重要的反向轉運蛋白，每3 個質子可以交換2 個Na＋。NhaC和NhcD是另外2 個單基因產物家族的反向轉運蛋白，其初級結構與NhaA和NhaB相差較大，相關生理功能還有待進一步研究[52]。另外有研究發(fā)現在海洋紅嗜熱鹽球菌（Rhodothermus marinus）中存在一個新的Na＋/H＋反向轉運蛋白NhaE，位于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）-醌氧化還原酶（NADH-quinone oxidoreductase，Nqo）復合物中，是呼吸鏈的一部分，在Nqo參與呼吸作用時可將胞內的Na＋轉運至胞外[53]。

當細胞受到鹽脅迫時，除了外排Na＋，細胞通常還會增加對K＋的吸收，恢復Na＋/K＋比，從而恢復胞內水和離子平衡。K＋跨細胞膜運動涉及到維持細胞滲透壓和調節(jié)細胞pH值，可以激活細胞生理代謝過程中的各種酶類，參與蛋白質合成代謝過程[54]。綠膿桿菌中存在的Ktr依賴于兩種K＋轉運蛋白。一種是由PA5021基因編碼的PA5021蛋白，在高鹽環(huán)境下細胞向外轉運Na＋和K＋過程中起到了重要作用，同時K＋的轉運可能也與依賴于呼吸作用的Na＋轉運相關；另一種是由PA1207基因編碼的PA1207蛋白，參與細胞對K＋的吸收過程[55]。同時，Nakamura等[56]發(fā)現溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）中存在Ktr，KtrA是一個結合在細胞質膜外周的一個膜亞基結構單位，KtrB是一個完整的膜亞基結構單位，參與K＋的運輸。而之后又在枯草芽孢桿菌中發(fā)現了分別與KtrA和KtrB同源的蛋白KtrA、KtrC和KtrB、KtrD，相應地組成了與K＋親和性比較高的KtrAB和與K＋親和性相對較低的KtrCD轉運系統(tǒng)，在二者協(xié)同作用下幫助細胞抵抗外界滲透壓[57]。

目前與乳酸菌中K＋轉運相關的研究罕有報道。在海氏腸球菌（Enterococcus hirae）中報道的K＋轉運機制有KtrⅠ和KtrⅡ兩種。KtrⅠ能夠結合并轉運K＋和Rb＋，但是二者的運輸都需要跨細胞膜形成的質子勢和ATP驅動。而KtrⅡ不依賴于質子勢，只在高濃度Na＋存在下被激活。研究發(fā)現KtrⅡ轉運系統(tǒng)中，K＋的吸收與Na＋-ATP酶形成Na＋電化學勢能有關，能夠特異性的轉運K＋[17,58]。這些Na＋、K＋轉運系統(tǒng)能夠使乳酸菌在滲透脅迫時迅速恢復胞內的離子平衡，降低鹽脅迫對細胞造成損傷。

2.5 其他胞內代謝途徑

乳酸菌在受到鹽脅迫時，菌體除了通過各種代謝途徑對滲透壓的變化作出反應，同時必須調節(jié)胞內代謝平衡，維持細胞的正常生長。鹽脅迫條件也會對細胞造成氧化損傷，造成細胞內代謝紊亂。已知NaCl是一種有效的促氧化劑，可以誘導與非典型條件相適應的蛋白質的表達。Belベore等[19]在Lactobacillus sakei CRL1756中研究發(fā)現，涉及非典型條件（假定的類鐵蛋白樣DNA結合蛋白，LSA1782）以及與無機離子轉運和解毒過程（含鐵染料脫色過氧化物酶，LSA1831）有關的2 種蛋白質在0.1 g/mLNaCl環(huán)境中是過表達的。類鐵蛋白樣DNA結合蛋白是饑餓細胞DNA結合蛋白（DNA-binding protein from starved cells，Dps）家族的成員，可以形成DNA-Dps共晶體，以保護DNA免受損傷環(huán)境的影響，而染料脫色過氧化物酶參與鐵轉運蛋白酶以及過氧化氫解毒過程的調節(jié)[59-60]。由于腌肉等肉制品是富含鐵的底物，活性氧可以通過酶促反應或自發(fā)產生[18]，因此L. sakei CRL1756在這些肉制品上生長過程中，類鐵蛋白樣DNA結合蛋白會被誘導來應對高鹽對細胞造成的氧化脅迫[19]。

鹽脅迫也誘導了L. sakei CRL1756中的腺苷酸琥珀酸合酶purA的合成，參與核苷酸代謝，核苷酸的積累可用于進一步合成DNA、RNA和ATP，確保細菌在脅迫條件下的存活。類似地，L. lacits中涉及嘌呤代謝的一種蛋白（bifunctional purine biosynthesis protein，PurH）在5 mol/LNaCl條件下表達上調，L. lacits在滲透脅迫條件下完成了從糖酵解到嘌呤生物合成的碳轉移[20]。在L. sakei CRL1756鹽脅迫還觀察到基因fab1（負責編碼烯酰基載體蛋白）和argS（負責編碼參與脂肪酸和氨基酰-tRNA生物合成的精氨酰RNA合成酶）的下調，這些基因在L. lacits中也被報道在高滲條件下受到抑制，這些與脂肪酸代謝途徑相關的基因也參與了高滲條件下細胞膜結構的調節(jié)[19,21]。

Li Yu等[61]研究發(fā)現在培養(yǎng)基中添加外源性的轉谷氨酰胺酶，能夠提高乳酸乳球菌對NaCl等許多脅迫環(huán)境的抗性，而對細胞生長沒有負面影響。進一步分析發(fā)現，外源添加的轉谷氨酰胺酶參與了細胞壁的合成，并且這種產生多種抗性表型的菌株是特異性的，它只發(fā)生在肽聚糖中存在谷氨酰胺與賴氨酸基團相連接的細菌中。此外，細胞面對不同的環(huán)境脅迫可能會產生交叉性應激反應，比如在酸脅迫下干酪乳桿菌中表達量顯著上調的DNA修復蛋白RecO，通過重組質粒轉入L. Lactis并且在細胞內過表達后，能夠提高重組菌株耐鹽等特性[62]；Gonzalez等[63]研究報道用一些溫和的高溫、過氧化氫或乙醇脅迫條件預處理乳酸乳球菌后能夠提高其在含有0.05 g/mL NaCl培養(yǎng)基中的存活率，但均未涉及到耐鹽機制方面的研究。

3 結 語

乳酸菌耐鹽機制的研究是目前食品科學領域研究的熱點之一。迄今為止，研究者分別從相容性溶質調控系統(tǒng)、糖酵解關鍵酶調控系統(tǒng)、HSP調控系統(tǒng)、胞內離子平衡和其他一些代謝系統(tǒng)，詳細地闡釋了不同來源的乳酸菌在高鹽脅迫下的調節(jié)機制，這對于開發(fā)耐鹽乳酸菌和尋找合適的鹽脅迫保護物質具有重要的意義，為乳酸菌能更好地應用到發(fā)酵食品工業(yè)提供了理論依據。但由于乳酸菌種類繁多，生存環(huán)境復雜多變，乳酸菌在鹽脅迫下的滲透調節(jié)機制有待更全面深入的研究。隨著科學技術的發(fā)展，大數據時代的來臨，運用基因組學、轉錄組學、蛋白質組學與代謝組學相結合的方法，通過生物信息學分析，將使乳酸菌耐鹽機制得到全方位的闡釋，并更好地服務于發(fā)酵食品生產。

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