乳酸菌降解草酸鹽活性及機(jī)制研究進(jìn)展

國(guó)立東，王麗群，于純淼,*，劉曉艷，焦月華，韓 華,*

原發(fā)性草酸鈣腎結(jié)石的形成通常與高鈣尿癥、高草酸尿癥和低枸櫞酸尿癥有關(guān)[1]，其中高草酸尿癥是草酸鈣腎結(jié)石形成的主要因素[2]，其主要由草酸鹽在體內(nèi)的產(chǎn)生、吸收與分泌失衡導(dǎo)致。機(jī)體內(nèi)的草酸鹽主要有兩方面的來(lái)源，即內(nèi)源和外源。內(nèi)源是通過(guò)哺乳動(dòng)物肝臟代謝產(chǎn)生；外源則是通過(guò)胃腸道對(duì)食源草酸鹽的吸收獲取，而草酸鹽是大多數(shù)食源性植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。哺乳動(dòng)物體內(nèi)缺乏分解利用草酸鹽的酶類，草酸鹽主要是通過(guò)尿液排出體外[3]。健康機(jī)體每天通過(guò)尿分泌的草酸為10～40 mg，如果超過(guò)40～45 mg，臨床診斷即為高草酸尿癥[4]。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腸道微生物的功能逐漸被揭示，例如腸道微生物菌群失衡可導(dǎo)致腎臟疾病，腎臟疾病患者腸道微生物組成也在發(fā)生改變，二者是相互的[5]。腸道菌群是影響腸道草酸鹽分解的一個(gè)重要因素，其中食草酸桿菌為研究最廣泛、最深入的草酸鹽降解菌[6]，并已有相應(yīng)商業(yè)化產(chǎn)品上市[7]。食草酸桿菌在腸道內(nèi)的定植與尿草酸濃度的降低存在直接相關(guān)性[8-11]，然而，這種細(xì)菌作為益生菌應(yīng)用時(shí)往往受到在腸道定植不穩(wěn)定和對(duì)抗生素敏感的限制[7,12]。近年來(lái)一系列體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)、人體臨床實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，乳酸菌有一定的潛在降解草酸鹽的能力，可降解草酸鹽的乳酸菌主要包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和腸球菌屬菌株[13-19]。其中，乳桿菌屬和雙歧桿菌屬為人體腸道內(nèi)固有的有益菌群，通常認(rèn)為其應(yīng)用于人體是安全的，因此被廣泛作為益生菌應(yīng)用。本文主要對(duì)可降解草酸鹽的乳酸菌種類、乳酸菌降解草酸鹽的能力以及乳酸菌降解草酸鹽的機(jī)理進(jìn)行綜述，為降解草酸鹽乳酸菌的篩選及其作用機(jī)理研究提供指導(dǎo)，也為預(yù)防和治療高草酸尿癥益生菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 具有降解草酸鹽功能的乳酸菌

乳酸菌在自然界中分布廣泛，傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動(dòng)物和人的口腔、腸道及陰道中均棲居著大量乳酸菌。國(guó)內(nèi)外研究人員已從自然環(huán)境中分離篩選到大量可降解草酸鹽的乳酸菌菌株，這些乳酸菌分離株主要來(lái)源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品（如酸奶）、人體糞便以及動(dòng)物糞便樣品等[20-24]。目前，已表現(xiàn)出可降解草酸鹽活性的乳酸菌主要包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬以及乳球菌屬等，其中已明確具有降解草酸鹽能力的乳桿菌屬中主要有嗜酸乳桿菌[21,25-27]、格氏乳桿菌[26]、植物乳桿菌[21,26]、干酪乳桿菌[26,28]、鼠李糖乳桿菌[26]、副干酪乳桿菌[29]、羅伊氏乳桿菌[24,29]、發(fā)酵乳桿菌[23]等，雙歧桿菌屬主要有動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種[20,30]、短雙歧桿菌[14]、腸球菌屬中的糞腸球菌[13]和屎腸球菌[31]、明串珠菌屬中的乳明串珠菌[21]和腸膜明串珠菌[31]，以及乳球菌屬中的乳酸乳球菌[31-32]和格氏乳球菌[31]，具體見(jiàn)表1。除此之外，嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、短乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌的個(gè)別菌株可能也具有降解草酸鹽的活性，主要是因?yàn)檫@些菌一般與其他乳酸菌聯(lián)合制成益生菌制劑應(yīng)用，如Oxadrop?和VSL#3?產(chǎn)品[33-34]。另外，魏斯氏菌屬內(nèi)的一些菌株也展現(xiàn)出了一定的草酸鹽降解活性[23]。乳酸菌降解草酸鹽的活性具有菌種特異性和菌株特異性。例如，F(xiàn)ederici等[20]研究了雙歧桿菌屬內(nèi)某些菌株的草酸鹽降解活性，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種DSM 10140的草酸鹽降解活性最高，能降解培養(yǎng)基中61%的草酸鹽；而長(zhǎng)雙歧桿菌MB 282和青春雙歧桿菌MB 238的草酸鹽降解率分別為35%和57%，同為短雙歧桿菌的MB 283菌株可降解38%的草酸鹽，而MB 151菌株的草酸鹽降解率僅為1%；此外，供試的5 株長(zhǎng)雙歧桿菌中僅有4 株能降解草酸鹽。

表1 具有降解草酸鹽活性乳酸菌的主要種屬Table 1 Major genera and species of lactic acid bacteria with oxalate-degrading activity

2 乳酸菌降解草酸鹽的特性

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

體外實(shí)驗(yàn)通常作為篩選具有益生功能乳酸菌的首要步驟。研究乳酸菌草酸鹽降解活性的實(shí)驗(yàn)是將供試乳酸菌菌株培養(yǎng)在含草酸鹽的培養(yǎng)基中，通過(guò)培養(yǎng)前后培養(yǎng)基中草酸鹽含量變化計(jì)算降解率進(jìn)而評(píng)價(jià)其草酸鹽降解活性。2000年，Hokama等[13]首次報(bào)道了乳酸菌具有降解草酸鹽的能力，分離到11 株可降解草酸鹽的糞腸球菌，其中有4 株菌培養(yǎng)2 d后，其培養(yǎng)基中草酸鹽（2.0 g/L）全部被降解，同時(shí)發(fā)現(xiàn)糞腸球菌需要一種貧瘠的營(yíng)養(yǎng)生境且重復(fù)傳代培養(yǎng)才能維持其降解草酸鹽的活性。隨后，研究人員通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)篩選到許多其他種屬的乳酸菌也具有草酸鹽降解活性，如廣泛用于乳制品和藥品的12 株雙歧桿菌在含有5 mmol/L草酸鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，供試菌株中動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種DSM 10140菌株草酸鹽降解活性最強(qiáng)，可降解培養(yǎng)基中61%的草酸鈉[20]。Weese等[21]對(duì)來(lái)自犬糞便樣品的37 株乳酸菌進(jìn)行體外降解草酸鹽活性研究，發(fā)現(xiàn)降解率為0%～65%，其中4 株菌無(wú)草酸鹽降解活性。同樣來(lái)源于犬糞便的47 株乳酸菌中，49%菌株無(wú)草酸鹽降解活性，34%菌株對(duì)草酸鹽的降解率低于5%[31]。13 株乳桿菌和5 株雙歧桿菌在含10 mmol/L草酸銨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)供試乳桿菌的草酸鹽降解活性高于雙歧桿菌[29]。由此說(shuō)明，乳酸菌降解草酸鹽的能力具有菌株特異性。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌降解草酸鹽的能力明顯低于食草酸桿菌，食草酸桿菌幾乎可100%降解培養(yǎng)基中的草酸鹽[20,29]。為了更接近人體內(nèi)真實(shí)情況，研究人員通過(guò)模擬人體結(jié)腸微生態(tài)條件評(píng)價(jià)了格氏乳桿菌Gasser AM63T的草酸鹽降解活性，發(fā)現(xiàn)其在構(gòu)建的三階段連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的第一個(gè)階段（即近端結(jié)腸）就出現(xiàn)了草酸鹽降解活性[22]。此外，甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶（formyl-CoA transferase，F(xiàn)rc）和草酰輔酶A脫羧酶（oxalyl-CoA decarboxylase，Oxc）作為人體內(nèi)草酸鹽降解的2 個(gè)關(guān)鍵酶，其編碼基因和功能在乳酸菌中已得以鑒定[13,20,25,35]。因此，具有Frc基因frc和Oxc基因oxc一度成為體外分離篩選可降解草酸鹽乳酸菌菌株的依據(jù)之一[26]。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物模型數(shù)據(jù)尤其是人體臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果能最直接證明乳酸菌益生功能在體內(nèi)能否真正發(fā)揮作用。目前已有大量研究證實(shí)了乳酸菌在體內(nèi)具有抑制腸道草酸鹽吸收的作用。

高草酸尿癥及相關(guān)腎臟疾病實(shí)驗(yàn)的模型動(dòng)物通常以大鼠、小鼠以及犬最為常見(jiàn)。Kwak等[28]研究了乳桿菌對(duì)大鼠尿路結(jié)石形成的預(yù)防作用，與對(duì)照組相比，體外具有降解草酸鹽活性的干酪乳桿菌HY2743和HY7201菌株可明顯降低大鼠尿草酸的分泌，并且可使模型大鼠腎臟內(nèi)晶體形成量明顯減少。Klimesova等[36]研究了一株雙歧桿菌對(duì)原發(fā)性高草酸尿癥小鼠模型尿草酸分泌的影響，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種DSM 10140可降低模型小鼠尿草酸分泌，不同于食草酸桿菌通過(guò)促進(jìn)腸道草酸分泌來(lái)降低尿草酸的分泌量[37]，這種作用是該菌株通過(guò)降解飲食草酸鹽從而限制腸道對(duì)草酸鹽的吸收來(lái)完成的。Gomathi等[16]以富含草酸鉀的飲食誘導(dǎo)大鼠構(gòu)建高草酸尿和草酸鈣結(jié)石模型，以體外具有降解草酸鹽活性的乳酸菌為受試對(duì)象，發(fā)現(xiàn)5×108CFU/mL劑量的供試發(fā)酵乳桿菌AB1、TY5菌株和唾液乳桿菌AB11菌株組成的三聯(lián)菌（活菌數(shù)之比為1∶1∶1）灌胃給予模型大鼠21 d后，模型大鼠的尿草酸水平明顯降低。鐘文婷[32]研究了一株乳酸乳球菌對(duì)食源性草酸過(guò)多導(dǎo)致的犬尿石癥的預(yù)防作用，發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌處理第15天時(shí)模型犬尿草酸分泌量降低了21%，但差異不顯著，而在處理第30天時(shí)模型犬尿草酸分泌量下降了33%，且差異顯著（P＜0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)處理30 d后，犬尿鈣含量降低了10%，且差異顯著（P＜0.05）；說(shuō)明該菌株具有潛在的降低尿草酸和尿鈣分泌的能力。

乳酸菌的草酸鹽降解活性在人體臨床實(shí)驗(yàn)上也取得了較好的效果，尤以商業(yè)化的可降解草酸鹽的乳酸菌產(chǎn)品Oxadrop?和VSL#3?研究報(bào)道最多[33-34,38-39]。Campieri等[38]以原發(fā)性草酸尿路結(jié)石癥或弱高草酸尿癥患者為研究對(duì)象，每次給予活菌數(shù)為8×1011個(gè)的凍干乳酸菌混合物Oxadrop?（嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嬰兒雙歧桿菌的活菌數(shù)之比為1∶1∶1∶1∶1），每天2 次，重懸于冷水中，飯前服用，連續(xù)服用4 周后，患者24 h的尿草酸分泌量從55.5 mg降到33.5 mg，下降了40%，實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 個(gè)月后，尿草酸分泌量繼續(xù)下降到28.3 mg，下降了49%。隨后，Lieske等[33]同樣以O(shè)xadrop?為研究對(duì)象，考察了其對(duì)腸源性高草酸尿癥人群的影響，但使用的Oxadrop?產(chǎn)品菌種組成及比例（嗜酸乳桿菌、短乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嬰兒雙歧桿菌活菌數(shù)之比為1∶1∶4∶4）與Campieri等[38]所使用的略有不同，受試人群每天服用1 次該產(chǎn)品（活菌數(shù)8×1011個(gè)），服用1 個(gè)月后尿草酸分泌量下降了19%，第2個(gè)月改為每天服用2次，尿草酸分泌量下降了24%，第3個(gè)月改為每天服用3 次，尿草酸分泌量相比于初始值僅下降了2%，而且停藥1 個(gè)月后，尿草酸分泌量仍下降了20%，這說(shuō)明乳酸菌在人體腸道內(nèi)發(fā)生定植并繼續(xù)發(fā)揮作用。Okombo等[39]研究了VSL#3?產(chǎn)品對(duì)健康人體消化道草酸鹽吸收的影響，VSL#3?產(chǎn)品由嗜熱鏈球菌、短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種8 種活性乳酸菌組成，受試個(gè)體每天攝取含相同量的低草酸鹽的食物，并口服80 mg草酸鹽，同時(shí)給予VSL#3?產(chǎn)品（8×1011個(gè)活菌），發(fā)現(xiàn)服用產(chǎn)品4 周后，總草酸鹽在22 h內(nèi)的吸收率從30.8%降到11.6%，并且停用產(chǎn)品4 周后，22 h內(nèi)的吸收率仍能維持在11.5%水平，但對(duì)于6 h內(nèi)的吸收率，與服用4 周后、服用前均無(wú)顯著差異；由此推測(cè)，VSL#3?產(chǎn)品對(duì)草酸鹽的降解作用可能發(fā)生在結(jié)腸部位。Al-Wahsh等[34]考察了VSL#3?產(chǎn)品對(duì)人體消化道對(duì)草酸鹽吸收的影響，以11 名健康個(gè)體為研究對(duì)象，對(duì)照組口服草酸鈉，低劑量組和高劑量組除口服草酸鈉外分別口服1 粒和2 粒VSL#3?膠囊，每粒VSL#3?膠囊中含有4.5×1011個(gè)活菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該產(chǎn)品可明顯降低受試個(gè)體尿草酸水平，但高低兩個(gè)劑量組在草酸鹽吸收上沒(méi)有明顯差異。然而，Goldfarb等[40]在一項(xiàng)隨機(jī)控制臨床實(shí)驗(yàn)中，考察了Oxadrop?產(chǎn)品對(duì)原發(fā)性高草酸尿癥人群的影響，與Lieske等[33]研究中使用Oxadrop?產(chǎn)品相比，該臨床實(shí)驗(yàn)所用的Oxadrop?產(chǎn)品的菌種組成和比例不變，患者每天服用劑量（活菌數(shù)1.08×1012個(gè)）略高但無(wú)實(shí)質(zhì)性差異，服用該產(chǎn)品4 周后，患者在24 h內(nèi)的尿草酸分泌量雖然降低了6%，但與服用前的差異并不顯著，與此類似的結(jié)果也出現(xiàn)在Siener等[41]的研究報(bào)道中。由此說(shuō)明，Oxadrop?產(chǎn)品在人體臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道中并不都是積極的結(jié)果，這可能是源于人體臨床實(shí)驗(yàn)相比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在飲食上往往難于控制，同時(shí)受試個(gè)體數(shù)量有限且個(gè)體之間差異較大。

3 乳酸菌降解草酸鹽的機(jī)理

目前，草酸鹽降解菌研究最為清楚的是食草酸桿菌，草酸鹽是其生長(zhǎng)代謝的唯一或主要碳源，因此被稱為“專性草酸營(yíng)養(yǎng)型”[42]，其對(duì)草酸鹽的降解首先是利用草酸鹽-甲酸鹽反向轉(zhuǎn)運(yùn)體OxlT（oxlT基因編碼）將胞外草酸鹽吸收到細(xì)胞內(nèi)，然后再利用Frc（frc基因編碼）將胞內(nèi)草酸鹽轉(zhuǎn)化成草酰輔酶A，草酰輔酶A再通過(guò)Oxc（oxc基因編碼）的作用脫羧形成甲酸鹽和CO2，最后再利用OxlT將胞內(nèi)甲酸鹽運(yùn)輸?shù)桨猓瑥亩瓿蓪?duì)草酸鹽的降解作用[43]。

與食草酸桿菌不同，乳酸菌屬于兼性草酸營(yíng)養(yǎng)型微生物，即不以草酸鹽作為其生長(zhǎng)的主要碳源，僅能利用草酸鹽作為碳源[38]。乳酸菌對(duì)草酸鹽的降解機(jī)理與食草酸桿菌類似，最早是在一株糞腸球菌中被闡述[13]。研究人員通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)到可降解草酸鹽的糞腸球菌中存在2 種蛋白，可以同抗食草酸桿菌源的Frc和Oxc蛋白的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)；由此說(shuō)明，糞腸球菌中降解草酸鹽的酶類與食草酸桿菌中的酶相似[13]，但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)草酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在，糞腸球菌降解草酸鹽的確切機(jī)制尚未完全明確。Federici等[20]以已公布的食草酸桿菌oxc基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，在一株具有草酸鹽降解活性的動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種中通過(guò)PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增出同源體，其氨基酸序列與食草酸桿菌Oxc的氨基酸序列同源性為47%，在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)的蛋白能夠與抗食草酸桿菌的Oxc抗體發(fā)生雜交，并通過(guò)酶活性分析證實(shí)了動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種源oxc基因的Oxc功能活性。隨后，Turroni等[30]在動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種中鑒定出了oxc和frc基因，細(xì)胞預(yù)適應(yīng)于亞抑制濃度草酸鹽條件后，將其暴露于pH 4.5條件下，發(fā)現(xiàn)其草酸鹽降解率顯著提高，證實(shí)了酸性條件是動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種產(chǎn)生較高草酸鹽降解率的前提。乳桿菌屬的草酸鹽降解機(jī)制同樣是圍繞Frc和Oxc提出，Azcarate-Peril等[25]在嗜酸乳桿菌NCFM中鑒定了編碼降解草酸鹽的Frc和Oxc的基因，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因只有在細(xì)菌細(xì)胞適應(yīng)亞抑制濃度草酸鹽并且在弱酸性條件下（pH 5.5）才能發(fā)揮功能。在格氏乳桿菌Gasser AM63T中，同樣檢測(cè)到了frc和oxc基因，也需要在弱酸性、同時(shí)有草酸鹽存在的條件下才能夠被誘導(dǎo)表達(dá)[22]。Turroni等[26]發(fā)現(xiàn)草酸鹽降解率超過(guò)50%的所有供試嗜酸乳桿菌和格氏乳桿菌中均存在oxc和frc基因。Kullin等[44]對(duì)一株羅伊氏乳桿菌100-23C進(jìn)行全基因組分析，發(fā)現(xiàn)其基因組中存在緊鄰的oxc和frc基因，預(yù)測(cè)的Oxc和Frc產(chǎn)物分別與格氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種中的Oxc和Frc具有高度的同源性，但該菌株野生型并不能降解培養(yǎng)基中的草酸鹽，這可能是由于其缺少草酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體。由此說(shuō)明，細(xì)菌的基因組中含有oxc和frc基因并不足以證明其一定具有降解草酸鹽的能力。除了Oxc和Frc之外，還需草酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體將草酸鹽由胞外轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)，而Turroni等[30]在動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能與草酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的編碼透性酶的開(kāi)放閱讀框，并且存在于已公布的全基因組序列中，這種透性酶基因也存在于許多可降解草酸鹽的乳桿菌屬菌株中；然而，在羅伊氏乳桿菌100-23C全基因組中并不存在該透性酶基因，這可能是該菌株不能降解草酸鹽的主要原因。

綜上所述，乳酸菌通過(guò)透性酶將胞外草酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，通過(guò)Frc將草酸鹽轉(zhuǎn)化為草酰輔酶A，再通過(guò)Oxc脫羧產(chǎn)生甲酸鹽和CO2完成對(duì)草酸鹽的降解。

4 結(jié) 語(yǔ)

不論是體外實(shí)驗(yàn)還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，乳酸菌的草酸鹽降解活性無(wú)法與食草酸桿菌相媲美。食草酸桿菌的生長(zhǎng)需要以草酸鹽作為其生長(zhǎng)代謝的唯一或主要碳源，因此，食草酸桿菌對(duì)治療高草酸尿癥非常有效。此外，腸道內(nèi)草酸鹽濃度的高低受飲食組成影響較大，這也是食草酸桿菌在腸道內(nèi)定植不穩(wěn)定的根本原因。相比之下，乳酸菌能夠利用草酸鹽但不以其作為主要碳源，在腸道內(nèi)的定植不受腸道草酸鹽水平的限制，可穩(wěn)定定植于腸道內(nèi)。因此，乳酸菌在預(yù)防高草酸尿癥方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。可降解草酸鹽的乳酸菌主要分布于乳桿菌屬、雙歧桿菌屬以及腸球菌屬，且具有菌種和菌株特異性，其降解草酸鹽的作用受3個(gè)基因調(diào)控，即oxc、frc及編碼透性酶的基因，但關(guān)于透性酶的遺傳信息及發(fā)揮功能的確切機(jī)制仍需更深入的研究加以證實(shí)?？傊?，乳酸菌的草酸鹽降解活性是明確的，在預(yù)防與治療草酸鹽相關(guān)的腎臟疾病上具有較好的應(yīng)用前景。

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