基于宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組的發(fā)酵食品微生物研究進(jìn)展

雷忠華，陳聰聰，陳 谷*

微生物的新陳代謝在發(fā)酵食品的色、香、味、態(tài)等特征及食品安全等方面發(fā)揮著重要作用。但是由于發(fā)酵食品中微生物種類繁多、群落演替變化復(fù)雜、代謝通路多樣、功能基因豐富多變，迄今為止很多傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)特征、演替變化規(guī)律和功能基因依舊是謎團(tuán)，科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)都急需揭開這層神秘的面紗。傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類繁多，如發(fā)酵乳制品、發(fā)酵谷物類（酒、醋）、發(fā)酵蔬菜（泡菜）、發(fā)酵豆制品（豆豉、醬油、腐乳）、發(fā)酵植物根或塊莖、發(fā)酵肉制品（火腿）、發(fā)酵海產(chǎn)品等[1]。在發(fā)酵過程中，原料中的糖類、脂類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)在各種微生物的參與下，降解為小分子的單糖、脂肪酸、氨基酸，并與微生物代謝產(chǎn)物一起決定最終產(chǎn)品的品質(zhì)風(fēng)味、安全性、穩(wěn)定性等特征[2-3]。但是，由于發(fā)酵過程中微生物體系復(fù)雜，其中包括大量的益生菌和部分有害微生物，而某些雜菌會產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物如生物胺等[4-5]。為了保證發(fā)酵食品安全、提高其品質(zhì)、減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生，必須了解發(fā)酵過程中的微生物群落構(gòu)成、群落演替以及各種微生物的代謝特性和它們對產(chǎn)品品質(zhì)的影響，從而使發(fā)酵過程可控化、現(xiàn)代化，進(jìn)而提升發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)，保障產(chǎn)品安全[6]。但因參與發(fā)酵的微生物種類繁多、相互作用關(guān)系復(fù)雜，全面解析發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)及其群落演替變化規(guī)律依舊極具挑戰(zhàn)[7]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)研究已不再完全依賴于傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)。因測序技術(shù)不斷更新，測序費用大大降低，測序通量急速擴(kuò)大，從而應(yīng)用直接測序可以對群落中所有微生物的DNA或RNA進(jìn)行微生物群落組成、分布及其動態(tài)演替的分析[3]。近年來，主要基于細(xì)菌16S rRNA基因及真菌rRNA基因間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）區(qū)域高通量測序的微生物多樣性分析，不僅省去了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的繁瑣過程，而且為大量不可培養(yǎng)微生物的研究提供了契機(jī)，使得在傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性研究中有了許多新的發(fā)現(xiàn)，成為發(fā)酵食品微生物研究的主要方法之一[1,3,8]。但是，基于rRNA基因片段或ITS區(qū)域高通量測序進(jìn)行微生物多樣性分析的方法本身的局限性，一方面只能依賴于基因庫中已知基因序列做出推斷，另一方面由于核糖體RNA基因片段的保守性較高，許多未知微生物往往只能鑒定到所在屬，因而只能在門、綱、目、科、屬這些級別進(jìn)行微生物群落進(jìn)化和種屬親緣關(guān)系分析；同時由于缺乏功能基因的具體信息，使進(jìn)一步深入研究面臨瓶頸。相比之下，基因組、宏基因組測序以及轉(zhuǎn)錄組、宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在一定程度上彌補了這些缺陷[9]，使得人們可以更系統(tǒng)深入地研究微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能基因，全面分析其組成、變化規(guī)律、親緣進(jìn)化并挖掘出潛力豐富的功能基因，從而得以進(jìn)一步揭開發(fā)酵食品微生物群落的神秘面紗。

1 宏基因組與宏轉(zhuǎn)錄組

1.1 宏基因組

宏基因組（metagenome）一詞由Handelsman等[10]于1998年研究土壤微生物群落時首次提出。宏基因組技術(shù)通過收集環(huán)境樣品，提取樣品微生物（包括全部的可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)的微生物）的總DNA，構(gòu)建宏基因組文庫，從基因組文庫中篩選功能基因或直接進(jìn)行高通量測序分析，來研究群落中物種多樣性并挖掘功能基因[9]。早期的宏基因組研究以從基因組文庫中篩選獲得功能基因為主要策略，隨著高通量測序技術(shù)、生物信息學(xué)工具以及大數(shù)據(jù)分析平臺的日漸發(fā)展，主要基于測序的宏基因組廣泛應(yīng)用在微生物群落研究中，成為空氣、土壤、水、植物以及人體（如皮膚、消化道）等微生物群落研究的強(qiáng)有力工具[9,11-16]。例如在研究動物性膳食與植物性膳食對人腸道微生物群落結(jié)構(gòu)實時影響并重現(xiàn)因短期攝入營養(yǎng)素的改變而引發(fā)的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)變化時，揭示了動物性膳食引發(fā)腸道炎癥疾病的機(jī)制[16]。借由宏基因組，大量不可培養(yǎng)的微生物得以被發(fā)現(xiàn)，新的功能基因或新基因簇得以被認(rèn)知，極大地增加了人類對微生物群落組成、演替及其互作的認(rèn)識，同時對于開發(fā)具有應(yīng)用潛力的新基因也具有重要意義。近年來宏基因組開始應(yīng)用于食品微生物的研究[14,17-19]，但是，目前大量文獻(xiàn)報道是基于擴(kuò)增rRNA基因測序進(jìn)行的生物多樣性分析，而本文則主要側(cè)重于分析rRNA基因測序之外的宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組報道。

第二代測序技術(shù)依托的高通量測序平臺，包括Illumina公司的Solexa Genoma Analyzer測序平臺、羅氏公司的454GS FlX測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺[20]。這些測序平臺可以實現(xiàn)對DNA的高通量快速測序，極大地方便了對某一物種基因組的深度測序，也方便了對微生物群落中所有DNA的分析?；谶@些測序平臺，宏基因組既可以分析特定環(huán)境微生物基因，基于序列篩選或基于功能篩選分析某種功能基因，并進(jìn)一步對篩選到的基因進(jìn)行深度測序；又可以針對環(huán)境群落微生物中全部的DNA進(jìn)行深度測序，分析該群落中微生物的組成、演替及特定功能基因[9]。但是，宏基因組的局限在于不能揭示特定時空條件下微生物群落基因的動態(tài)表達(dá)與調(diào)控等問題，這部分的研究有賴于宏轉(zhuǎn)錄組。

1.2 宏轉(zhuǎn)錄組

基于RNA數(shù)據(jù)分析的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，主要用來揭示生物在特定生理階段或脅迫下，基因的動態(tài)表達(dá)與調(diào)控以及脅迫響應(yīng)，分析差異表達(dá)基因[21]。宏轉(zhuǎn)錄組是指在某個特定條件或特定時空，群落中所有微生物基因轉(zhuǎn)錄本的總和，可用于原位衡量微生物群落宏基因組的表達(dá)水平，篩選出高表達(dá)活性功能基因和微生物[22-23]。它以微生物群落的總RNA為研究對象，提取樣品總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)而對cDNA分析來反映特定時空下基因的表達(dá)情況。早期轉(zhuǎn)錄組研究主要運用微陣列芯片技術(shù)，但是設(shè)計和構(gòu)建微陣列芯片費用高且費時，還不能檢測到設(shè)計模板之外的基因的表達(dá)水平[24]。而測序技術(shù)較好地解決了這一困境，它針對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA進(jìn)行高通量測序，可全面快速地獲取特定樣品在某一特定狀態(tài)下的完整表達(dá)信息，普遍應(yīng)用于差異表達(dá)基因分析、功能基因挖掘、低豐度轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)錄圖譜繪制、可變剪接預(yù)測等各個方面。

近年來基于測序的宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在各種環(huán)境和人體微生物群落研究中被廣泛應(yīng)用[12,16,25-28]，不僅可以鑒定群落中微生物基因表達(dá)水平，比較不同微生物轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，進(jìn)而了解群落的演替變化；還可以分析群落中微生物的脅迫響應(yīng)，研究優(yōu)勢菌群的代謝途徑和篩選特定功能的基因。例如，關(guān)聯(lián)人體消化道微生物群落的宏基因組與宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)雖然有部分口腔優(yōu)勢微生物存在消化道末端，但它們的轉(zhuǎn)錄活性很低；不同的個體間，41%的消化道微生物轉(zhuǎn)錄本不受其基因組豐度影響，而轉(zhuǎn)錄受包括表達(dá)下調(diào)的孢子形成、氨基酸合成通路，以及表達(dá)上調(diào)的核糖體合成和甲烷生成通路[12]等的影響。又如Jiang Yue等[26]應(yīng)用宏轉(zhuǎn)錄組分析了來自小鼠大腸、奶牛瘤胃、泡菜、深海熱井和凍土的微生物群落，確定了參與氨基酸、能量、核苷酸代謝的592 種核心酶基因的表達(dá)，同時也鑒定了微生物的特定代謝途徑，如磷酸代謝途徑和多聚糖降解途徑等。近年來，宏轉(zhuǎn)錄組開始應(yīng)用于發(fā)酵食品[29-31]，用于探索各種微生物在發(fā)酵過程中的代謝途徑，并揭示它們特定的功能和對風(fēng)味的貢獻(xiàn)。

2 宏基因組與宏轉(zhuǎn)錄組在發(fā)酵食品微生物群落研究中的應(yīng)用

2.1 奶酪

奶酪是一種重要的發(fā)酵乳制品，世界各地有多種風(fēng)味獨特的奶酪成品。奶酪的微生物群落是由各種細(xì)菌、酵母菌和霉菌等組成，它們相互作用并經(jīng)一系列生化反應(yīng)后形成奶酪獨特的感官性能和風(fēng)味。Wolfe等[32]應(yīng)用宏基因組揭示了3 類（新鮮奶酪、花皮奶酪、洗浸奶酪）共137 種不同奶酪表皮的微生物群落結(jié)構(gòu)及其在發(fā)酵中的功能，他們從中分離培養(yǎng)出24 株優(yōu)勢菌株（包括細(xì)菌和真菌），并研究了它們之間的相互作用。這是首次如此多種類的奶酪微生物被同時研究，并且該研究揭示出部分微生物的某些特殊功能與奶酪的表皮特性形成相關(guān)，假交替單胞菌（Pseudoalteromonas spp.）可產(chǎn)生參與奶酪表皮硫化物形成的甲硫氨酸γ-裂解酶。作者還通過原位和體外重構(gòu)重現(xiàn)了奶酪發(fā)酵的過程，提供了一種簡單的模型來研究奶酪發(fā)酵過程中真菌和細(xì)菌間的作用機(jī)制[33]。Almeida等[34]則是對從奶酪制品中分離出的142 株細(xì)菌（分屬于137 個不同的種和67 個屬）進(jìn)行了大規(guī)模的基因組和宏基因組測序，通過大規(guī)模測序，他們獲得了117 個基因組草圖，使奶酪中已知細(xì)菌的基因組序列增加了1 倍，并建立了1 個奶酪細(xì)菌功能基因組數(shù)據(jù)庫。他們還依據(jù)新測序建立的基因組數(shù)據(jù)庫，分析了不同傳統(tǒng)奶酪表面上存在的微生物群落結(jié)構(gòu)，觀察到一些微生物物種大量存在，表明一些微生物如靜止嗜冷桿菌（Psychrobacter immobilis）和假單胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）最初并沒有被接種，卻是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種。Escobar-Zepeda等[35]利用宏基因組學(xué)揭示了Cotija奶酪中獨特的微生物群落組成。Cotija奶酪在墨西哥當(dāng)?shù)鬲毺氐牡乩憝h(huán)境中自然發(fā)酵成熟，其獨特的感官特性及其安全性由微生物及其代謝產(chǎn)物共同影響。高通量測序結(jié)果揭示了微生物的多樣性、優(yōu)勢菌群以及代謝潛力，結(jié)果表明乳桿菌、明串珠菌和魏斯菌屬是3 個主要的優(yōu)勢菌群，另外還有屬于31 個門，共達(dá)500多種的細(xì)菌和古細(xì)菌；致病菌如沙門氏菌、單增李斯特菌、布魯氏桿菌、分枝桿菌均未發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明與Cotija奶酪多種風(fēng)味形成有關(guān)的微生物代謝活動主要涉及支鏈氨基酸和游離脂肪酸的代謝，同時還發(fā)現(xiàn)了一些與細(xì)菌素的產(chǎn)生及免疫相關(guān)的基因。這些基于宏基因組數(shù)據(jù)的發(fā)現(xiàn)可以解釋微生物群落在發(fā)酵奶酪感官特性及安全性中的作用，同時也提供了尋找新的酶應(yīng)用于生物技術(shù)的可能性。

目前奶酪表皮微生物群落的參考基因組序列較為豐富，為宏轉(zhuǎn)錄組分析奶酪成熟過程中表皮微生物群落提供了更大的可能性，奶酪持續(xù)成為發(fā)酵食品微生物研究對象的熱點。Monnet等[36]應(yīng)用宏轉(zhuǎn)錄組分析探究奶酪表皮的微生物活動，被研究的奶酪是由2 種乳酸菌（嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種）、1 種陳化細(xì)菌（金橙黃短桿菌）和2 種酵母（漢遜德巴利酵母和假絲地霉酵母）參與發(fā)酵而成熟。從第5、14、19、35天的奶酪表皮提取RNA進(jìn)行測序，結(jié)果顯示除金橙黃短桿菌轉(zhuǎn)錄本讀數(shù)極低外，其他菌種均被檢測到。宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，5～35 d假絲地霉酵母最活躍，乳酸菌的轉(zhuǎn)錄水平只發(fā)生了輕微的變化。作者分析比較了兩株酵母參與乳糖、半乳糖、乳酸、氨基酸以及游離脂肪酸分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在成熟過程中氨同化相關(guān)基因和半乳糖代謝相關(guān)基因下調(diào)；在假絲地霉酵母的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，參與氨基酸代謝的基因在14～35 d上調(diào)，而在漢遜德巴利酵母中上調(diào)主要發(fā)生在第35天，這表明漢遜德巴利酵母比假絲地霉酵母更晚參與氨基酸的代謝。此外，在第35天涉及電子傳遞鏈的基因表達(dá)普遍下調(diào)，表明成熟后期細(xì)胞活性較低。de Filippis等[37]應(yīng)用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了不同溫度和濕度條件下意大利奶酪成熟過程中微生物群落的演替和相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示提高奶酪成熟溫度會促進(jìn)蛋白質(zhì)水解、氨基酸和脂類分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)，并顯著加速奶酪的成熟速率；此外溫度升高導(dǎo)致的微生物代謝途徑變化與奶酪中蛋白質(zhì)和揮發(fā)性有機(jī)物的代謝譜變化一致；在奶酪成熟過程中表皮中糖代謝（磷酸戊糖途徑和糖酵解）和細(xì)胞分裂相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本豐度較高，而在奶酪中心氨基酸和脂類代謝顯著上調(diào)。這些宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果對工業(yè)生產(chǎn)中通過合理調(diào)控溫度來調(diào)節(jié)微生物的代謝，從而優(yōu)化生產(chǎn)效率并提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重要指導(dǎo)意義。

隨著組學(xué)技術(shù)的成熟和成本的降低，研究者們正試圖用多種組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合分析來更好地揭示發(fā)酵過程中微生物的功能及其相互作用機(jī)制，以期獲得突破性的研究成果。如Dugat-Bony等[38]應(yīng)用宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和生化分析，研究9 種微生物組成的奶酪表皮在為期4 周的成熟過程中的變化。在發(fā)酵早期乳酸球菌和乳酸克魯維酵母快速消耗乳糖產(chǎn)生大量乳酸，隨后檢測到漢遜德巴利酵母和假絲地霉酵母高水平的乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)錄本，表明隨后乳酸被它們利用。大多數(shù)的RNA測序片段匹配到假絲地霉酵母的基因，這表明假絲地霉酵母與酪氨酸和脂肪降解密切相關(guān)。在奶酪成熟末期，測序數(shù)據(jù)表明與氨基酸降解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本源于假絲地霉酵母、對酸敏感的干酪棒桿菌和蜂房哈夫尼亞菌，這一數(shù)據(jù)結(jié)果與假絲地霉酵母、干酪棒桿菌和蜂房哈夫尼亞菌在后期奶酪表皮旺盛生長相符。在這篇報道中作者結(jié)合不同的數(shù)據(jù)分析，獲得了奶酪成熟過程中各種微生物的代謝產(chǎn)物及其可能的相互作用機(jī)制；此外，采用差異表達(dá)分析選擇出的一組生物標(biāo)志物基因，為監(jiān)控奶酪制作過程提供了有價值的工具。

2.2 發(fā)酵蔬菜

作為一種傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品，泡菜發(fā)酵過程中微生物種類復(fù)雜，近年來宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組已應(yīng)用于泡菜發(fā)酵過程中微生物群落的研究。Jung等[17]研究泡菜29 d發(fā)酵過程的宏基因組，其中源自宏基因組的16S rRNA基因數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明泡菜中優(yōu)勢菌屬為明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）。在基因功能注釋方面，采用宏基因組快速注釋技術(shù)，揭示了一系列碳水化合物異養(yǎng)乳酸發(fā)酵的相關(guān)基因，這與檢測到發(fā)酵產(chǎn)物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯、乙醇等相吻合。將宏基因組序列與不同菌屬微生物基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，大部分的宏基因組序列數(shù)據(jù)與腸明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）的基因序列具有高度相似性，表明泡菜發(fā)酵過程中這兩種菌很可能發(fā)揮了重要作用。從宏基因組數(shù)據(jù)中還發(fā)現(xiàn)了大量噬菌體DNA序列，這表明泡菜發(fā)酵過程中許多細(xì)菌受到了噬菌體感染。這些結(jié)果不僅深入揭示泡菜發(fā)酵微生物的功能，也揭示了復(fù)雜的微生物群落對發(fā)酵過程的影響。

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在泡菜發(fā)酵微生物研究中亦有應(yīng)用，如Jung等[29]對泡菜中6 種主要微生物在發(fā)酵過程中的宏轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)圖譜進(jìn)行了研究。在為期29 d的發(fā)酵過程中，來自其中5 個時間點樣本中提取的總RNA中，97.7%的基因序列與GenBank中已知的6 個菌屬一致。研究結(jié)果表明，在前期發(fā)酵過程中腸明串珠菌是最活躍的菌株，而在之后的過程中沙克乳桿菌和韓國魏斯氏菌（Weissella Koreensis）基因呈高表達(dá)；在第25天時沙克乳桿菌的基因表達(dá)急劇下降，可能與乳酸桿菌噬菌體感染有關(guān)。大量與碳水化合物運輸、水解及乳酸發(fā)酵相關(guān)的基因表達(dá)活躍，呈現(xiàn)出典型的異養(yǎng)乳酸發(fā)酵。所有的明串珠菌屬都含有甘露醇脫氫酶編碼基因（mannitol dehydrogenase，mdh），尤其是腸明串珠菌，它具有3 個mdh拷貝，其中2 個在染色體上，1 個在質(zhì)粒上，它們具有不同的表達(dá)模式。這些結(jié)果有助于人們更好地認(rèn)識各種微生物在泡菜發(fā)酵過程中發(fā)揮的重要作用。

中國各地有豐富多樣的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，近年來的研究報道有不少基于rRNA基因片段或ITS區(qū)測序的微生物多樣性分析。如佟婷婷等[39]發(fā)現(xiàn)四川老壇泡菜發(fā)酵中魏斯氏菌屬是啟動菌，關(guān)鍵菌是乳桿菌屬，同時還有乳球菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬等；Chen Peng等[40-41]報道甘肅漿水菜中除了乳酸菌外，還有子囊菌和擔(dān)子菌等真菌；Wu Rina等[42]發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬、明串菌屬、芽孢桿菌、假單胞菌、酵母、念珠菌、展青霉菌等與東北酸菜特殊風(fēng)味形成相關(guān)。未來對宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組的深入研究將有利于我們對中國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜更多的了解和進(jìn)一步的開發(fā)利用。

2.3 發(fā)酵普洱茶

普洱熟茶屬典型的發(fā)酵茶，它區(qū)別于普洱生茶是在于其經(jīng)“渥堆”工藝制作而成。“渥堆”是多種微生物參與的以茶葉為基質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵過程，參與發(fā)酵的微生物種群結(jié)構(gòu)對普洱熟茶品質(zhì)的形成發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。有不少基于分離培養(yǎng)或基于rRNA基因測序的“渥堆”過程微生物多樣性的報道除發(fā)現(xiàn)黑曲霉等優(yōu)勢菌株[43-45]外，還發(fā)現(xiàn)了其他優(yōu)勢菌株。Lü Changyong等[46]首次應(yīng)用宏基因組測序研究了普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)為3 個優(yōu)勢的細(xì)菌門（變形菌門、放線菌門和厚壁菌門）和1個處于主導(dǎo)地位的真菌門即子囊菌門；功能基因注釋表明與該過程萜類、酮類化合物代謝以及其他次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的69 種酶基因分布于16 個代謝途徑中。這些宏基因組數(shù)據(jù)表明普洱茶發(fā)酵的主要微生物包含細(xì)菌和酵母，功能基因的挖掘和代謝途徑的分析有利于在分子水平上對普洱茶發(fā)酵機(jī)理作進(jìn)一步研究。

姜姝等[47]提取普洱茶發(fā)酵前期和中期樣本中微生物菌群的總mRNA，對其進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組對比分析。測序結(jié)果注釋表明黑曲霉（Aspergillus niger）在發(fā)酵前期和中期兩個階段都占有絕對優(yōu)勢；對前期和中期轉(zhuǎn)錄本中的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因的本體論（gene ontology，GO）功能注釋聚類分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，結(jié)果表明適應(yīng)“渥堆”發(fā)酵環(huán)境變化的微生物（如黑曲霉等）對普洱茶發(fā)酵過程起到了決定性的作用。

2.4 發(fā)酵可可豆

可可豆是生產(chǎn)巧克力的重要原材料，采收后的可可豆經(jīng)發(fā)酵、干燥和焙烤形成巧克力特有的風(fēng)味和口感，其中發(fā)酵階段主要是由酵母菌、乳酸菌、醋酸菌將糖轉(zhuǎn)化為酸的一系列生化過程。近年來已有采用宏基因組學(xué)對可可豆發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的研究，宏基因組學(xué)被Illeghems等[48]于2012年首次應(yīng)用于可可豆發(fā)酵過程中微生物的研究，相對于僅依賴于個別基因序列的分析，宏基因組數(shù)據(jù)揭示了更豐富的微生物多樣性。此次發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌和真菌的種類比之前多，優(yōu)勢菌株包括葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）和巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）；病毒主要包括肌尾噬菌體（Myoviridae）和長尾噬菌體（Siphoviridae），且乳桿菌是它們主要的宿主。隨后Illeghems等[49]基于宏基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的多通路分析拓展了人們對可可豆發(fā)酵過程中主要微生物功能特性的認(rèn)知，揭示了群落微生物間的代謝通路的分布。其中與乳酸菌代謝關(guān)系最密切的是乳酸發(fā)酵和檸檬酸同化途徑；而腸桿菌（Enterobacteriaceae）通過混合酸發(fā)酵和丙酮醛解毒途徑參與底物轉(zhuǎn)化，具有降解果膠和同化檸檬酸的潛在功能。基于宏基因組數(shù)據(jù)重構(gòu)了醋酸菌的部分代謝途徑，尤其是脅迫應(yīng)激響應(yīng)，在酸脅迫下醋酸菌細(xì)胞內(nèi)乙醇同化和乙酸過氧化通路活躍使得醋酸菌得以繼續(xù)生存。Illeghems所在的團(tuán)隊還陸續(xù)對可可豆發(fā)酵過程中分離到的特定菌株（如巴氏醋酸桿菌386B[50]、發(fā)酵乳桿菌222、植物乳桿菌80[51]、加納假尾孢醋酸桿菌（Acetobacter ghanensis）、塞內(nèi)加爾醋酸桿菌（Acetobacter senegalensis）[52]等）進(jìn)行基因組和功能比較基因組的分析。這些研究深入剖析了可可豆發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)以及多種優(yōu)勢微生物的基因組和代謝途徑特性，為今后可可豆發(fā)酵選取更優(yōu)的發(fā)酵菌劑提供了有效的依據(jù)。

2.5 其他

宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組還應(yīng)用在其他多種發(fā)酵食品研究中，如醬油、酒類。醬油是亞洲食品中的一種重要的釀造調(diào)味品，其質(zhì)量取決于發(fā)酵過程中微生物的種群結(jié)構(gòu)及相互代謝調(diào)控。傳統(tǒng)醬油的濃厚風(fēng)味依賴于天然微生物發(fā)酵，而非大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中使用的特定發(fā)酵菌劑，因而明確傳統(tǒng)醬油生產(chǎn)過程中微生物的種類及其群落演替和代謝機(jī)理對于中國傳統(tǒng)釀造醬油工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。在對醬油鹵水發(fā)酵過程中微生物的演替及其功能的研究中，Sulaiman等[53]通過宏基因組研究傳統(tǒng)醬油發(fā)酵過程的微生物群落演替和基因功能，并分析了優(yōu)勢菌群代謝與鹵水特性變化的關(guān)聯(lián)。該研究發(fā)現(xiàn)鹵水在0～6 個月的發(fā)酵過程中以魏斯菌屬為主，后期的優(yōu)勢真菌為念珠菌屬；通過宏基因組序列的代謝重建，揭示了蛋白質(zhì)和碳水化合物異養(yǎng)發(fā)酵的特征，與檢測到乙醇和pH值下降相符。在印度米酒酒曲的研究中，Bora等[54]首次應(yīng)用宏基因組學(xué)揭示了更為全面的微生物群落特征，其中微生物包括以乳酸菌為主的細(xì)菌、根霉、毛霉和曲霉等產(chǎn)淀粉酶菌株，季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）、威克漢姆西弗酵母（Wickerhamomyces ciferrii）、釀酒酵母等產(chǎn)乙醇菌株；但對于所獲宏基因組數(shù)據(jù)，作者僅報道了分類學(xué)研究的結(jié)果，并沒有進(jìn)一步分析功能基因組和重構(gòu)代謝途徑。

目前，對傳統(tǒng)釀造醬油、酒類和醋的深入研究（如通過整合代謝組與微生物多樣性分析對鎮(zhèn)江香醋、山西陳醋等食醋的研究[55-58]；對釀酒酵母和酒球菌不同株系的基因組和比較基因組研究分析[59-64]）中，大多是通過rRNA基因片段測序分析發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，而采用宏基因組或宏轉(zhuǎn)錄組系統(tǒng)研究的報道還較少。宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用將有助于人類進(jìn)一步了解這些食品發(fā)酵過程中微生物的具體種系和功能基因，將該技術(shù)與代謝組數(shù)據(jù)整合，可以加深人們對傳統(tǒng)釀造醬油、醋和酒類中微生物的群落演替和風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制的認(rèn)識，也將有利于挖掘出更多的有益菌株和潛在的功能基因應(yīng)用于未來的工業(yè)生產(chǎn)。

3 結(jié) 語

如上所述，近年來主要基于高通量測序技術(shù)的宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組在發(fā)酵食品微生物研究中取得了一些進(jìn)展，但仍存在許多局限：1）二代測序的讀長較短，對宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝僅能達(dá)到Scaffold水平，尤其是對復(fù)雜的基因組，高含量的重復(fù)序列使得基因組大小出現(xiàn)“縮水”現(xiàn)象；2）測序數(shù)據(jù)的拼接很大程度上依賴現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中已知的微生物序列，這不利于微生物新品種的及時發(fā)現(xiàn)，并會浪費部分測序的數(shù)據(jù)[9,65]；3）宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)量較大，分析有一定的難度，且生物信息分析對數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)要求較高，不同的算法可能結(jié)果差異甚大[3]；4）對低豐度基因的檢測較困難[3,24]；5）費用較高導(dǎo)致目前測序所使用的重復(fù)樣本較少，降低了結(jié)果的可靠性和再現(xiàn)性。

隨著測序技術(shù)不斷進(jìn)步，具有更多優(yōu)勢的三代測序技術(shù)應(yīng)運而生，如PacBio RS具有超長讀取長度（10 kb）和極低的鳥嘌呤核酸和胞嘧啶核酸（guanylic acid and cytidylic acid，GC）偏好性，有利于基因組的組裝；二代測序和光學(xué)圖譜技術(shù)的結(jié)合使用在高等動植物基因組和

轉(zhuǎn)錄組研究中已有應(yīng)用[66-68]，為發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)的研究提供了更加準(zhǔn)確的方法。日益完善的微生物特別是發(fā)酵食品微生物物種的基因組數(shù)據(jù)庫，為宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接和注釋提供了越來越多堅實的支撐。宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的交叉運用將有助于我們更清晰地了解發(fā)酵食品中微生物的群落結(jié)構(gòu)演替、相互作用以及各菌株對風(fēng)味的貢獻(xiàn)，并挖掘出新的功能基因。未來微生物學(xué)、食品化學(xué)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科理論知識以及新的測序技術(shù)、更加完善的基因數(shù)據(jù)庫、先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析工具以及多種組學(xué)方法的結(jié)合必將給發(fā)酵食品微生物的研究帶來新的曙光。

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