半胱氨酸控制鮮切蘋果褐變的生理機制

陳 晨，胡文忠*，姜愛麗，劉程惠，趙 蕾

鮮切蘋果是指新鮮蘋果經(jīng)分級、清洗、整修、去皮、切分、保鮮、包裝等處理，供消費者直接食用或餐飲業(yè)使用的一種新式蘋果加工產(chǎn)品，其清脆多汁，且富含抗氧化成分等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是餐飲業(yè)及零售業(yè)最受消費者喜愛的零食餐點之一，目前在歐洲、美國、日本等發(fā)達國家和地區(qū)已經(jīng)實現(xiàn)系統(tǒng)化、規(guī)范化生產(chǎn)，在鮮切市場中占有重要地位[1]。然而新鮮果蔬在去皮、切分等加工過程中，細胞組織結(jié)構(gòu)會受到傷害，使細胞組織與空氣直接接觸，呼吸速率升高，蒸騰作用加快，加速了產(chǎn)品的衰老進程，造成營養(yǎng)物質(zhì)流失，尤其是切割操作傷害引起酶促褐變反應(yīng)的迅速發(fā)生，造成品質(zhì)下降，貨架期縮短，這是包括鮮切蘋果在內(nèi)的許多鮮切果蔬產(chǎn)品加工與貯藏保鮮過程中面臨的主要問題之一，已成為鮮切果蔬研究的熱點問題[2]。

鮮切果蔬酶促褐變是一個復(fù)雜的過程，一般認為其產(chǎn)生機理是鮮切操作導(dǎo)致果蔬組織結(jié)構(gòu)和細胞空間區(qū)域化喪失，使原來多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）與底物多酚的分區(qū)定位遭到破壞，導(dǎo)致酶與底物接觸，誘發(fā)了酶促褐變反應(yīng)，即PPO在有氧的條件下催化酚類物質(zhì)形成鄰苯醌，后者通過復(fù)雜的醌聚合反應(yīng)形成褐色物質(zhì)是酶促褐變發(fā)生的直接原因[3]。當(dāng)前采用物理、化學(xué)等方法降低PPO活力、酚類物質(zhì)含量和氧濃度是控制鮮切果蔬酶促褐變的主要途徑[4-6]。半胱氨酸是一種天然的具有生理功能的氨基酸，作為食品添加劑應(yīng)用于食品加工中，同時在醫(yī)藥領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用[7]。許多學(xué)者將半胱氨酸作為抗褐變劑單獨或與其他保鮮劑聯(lián)合應(yīng)用于鮮切蘋果的貯藏保鮮[8,9-11]。Ali等[12]研究認為半胱氨酸是一種高效的PPO抑制劑，但其作用機理較為復(fù)雜。PPO在鮮切蘋果組織中主要以膜PPO和游離PPO兩種形式存在，膜PPO活力比游離PPO活力高，半胱氨酸對膜PPO活力具有很強的抑制作用[13]。但高愿軍等[14]研究認為半胱氨酸不直接作用于PPO，它對褐變反應(yīng)的抑制在于其能與醌類物質(zhì)反應(yīng)生成穩(wěn)定的無色化合物防止醌氧化成有色物質(zhì)。近年來，越來越多研究表明，酶促褐變不僅與酚類物質(zhì)含量以及PPO的活力有關(guān)，還受細胞膜透性以及膜脂過氧化等多因素影響[15]，而半胱氨酸控制鮮切蘋果褐變的生理機制仍缺乏系統(tǒng)研究。

本研究以鮮切蘋果為研究對象，采用0.5 g/L的半胱氨酸溶液浸泡處理1 min，分析在4 ℃貯藏過程中，鮮切蘋果PPO活力、抗氧化相關(guān)酶活力、抗氧化物質(zhì)含量以及抗氧化活力的變化，系統(tǒng)研究半胱氨酸對鮮切蘋果褐變控制的生理機制，為鮮切蘋果的貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果購于大連經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)樂購超市。

過氧化氫、福林-酚試劑、苯丙氨酸、抗壞血酸、硝普鈉、聚乙烯吡咯烷酮、亞油酸鈉、三聚乙酸、硫代巴比妥酸、無水乙醇、丙酮、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚等（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；L-半胱氨酸（食品級） 上海富源生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR400/CR410型色差計 日本Konica Minolta公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋、DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司；AL240電子分析天平瑞士Mettler Toledo公司；UV-9200紫外-可見分光光度計北京瑞利分析儀器有限公司；T-25勻漿機 德國IKA公司；BR4i臺式高速冷凍離心機 法國Jouan公司；BCD-257DVC冰箱 青島海爾股份有限公司；SiM-F140制冰機 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

蘋果經(jīng)自來水清洗后，在滅菌砧板上用滅菌的削皮刀削皮去除果核，切割成約1 cm×1 cm×1 cm的小塊，將鮮切蘋果采用0.5 g/L的半胱氨酸溶液浸泡處理1 min，取蒸餾水浸泡1 min作為對照。將處理后的樣品瀝干后均勻放入一次性托盤中并用聚乙烯保鮮膜包好，置于4 ℃冷庫中貯藏。定期取樣用于分析生理生化變化。

1.3.2 褐變指數(shù)的測定

采用色差計測定L*、a*、b*值，L*值表示明亮度，a*值表示紅/綠，b*值表示黃/藍。褐變指數(shù)（browning index，BI）根據(jù)公式（1）、（2）進行計算[16]。

1.3.3 抗壞血酸和總酚含量的測定

抗壞血酸含量的測定采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[17]。總酚含量的測定采用福林-酚法[18]。

1.3.4 相關(guān)酶活力的測定

過氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的測定參考閆媛媛等[19]的方法，PPO和過氧化物酶（peroxidase，POD）活力測定參考Chen Chen等[20]的方法，谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力測定參考Zhang Jie等[21]的方法。

1.3.5 抗氧化活性的測定

抗氧化活性評價采用測定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） ammonium salt，ABTS）自由基（ABTS＋·）清除能力兩種方法[22]，測定結(jié)果以每克鮮切蘋果相當(dāng)于標準抗氧化物質(zhì)水溶性VE（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）的物質(zhì)的量表示。

1.3.6 丙二醛質(zhì)量摩爾濃度測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）質(zhì)量摩爾濃度的測定參考Ren Yalin等[23]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 半胱氨酸對鮮切蘋果褐變的控制效果

圖1 半胱氨酸處理后鮮切蘋果的BIFig. 1 Effect of cysteine on browning index of fresh-cut apples during storage

BI值越大，表示褐變程度越嚴重。如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，對照組和半胱氨酸處理組的鮮切蘋果褐變程度均逐漸上升，半胱氨酸處理組樣品BI值在貯藏過程中均顯著低于對照組（P＜0.05），說明半胱氨酸處理能夠有效抑制鮮切蘋果的褐變。

2.2 半胱氨酸對鮮切蘋果抗壞血酸含量的影響

圖2 半胱氨酸處理對鮮切蘋果抗壞血酸含量的影響Fig. 2 Effect of cysteine on ascorbic acid content of fresh-cut apples during storage

抗壞血酸是鮮切水果中重要的抗氧化物質(zhì)，由圖2可知，對照組和半胱氨酸處理組鮮切蘋果貯藏過程中抗壞血酸含量均呈下降的趨勢。但是半胱氨酸處理組的抗壞血酸含量整體高于對照組（P＜0.05），且下降速率較慢，在貯藏第10天時，與第0天相比其含量下降了32%，而對照組下降了48%。說明半胱氨酸處理能夠有效抑制抗壞血酸在鮮切蘋果貯藏過程中的氧化損失，更好地保持了其抗氧化能力，可保護細胞組織免受氧化損害而延緩果實衰老。

2.3 半胱氨酸對鮮切蘋果總酚含量的影響

蘋果富含的多酚類物質(zhì)是蘋果中重要的抗氧化成分；同時，多酚也作為多酚氧化酶的底物，參與蘋果的褐變反應(yīng)[20]。如圖3所示，對照組和半胱氨酸處理組鮮切蘋果的總酚含量在貯藏的最初6 d內(nèi)快速下降，第8天以后無顯著變化。半胱氨酸處理組總酚含量在貯藏最初2 d顯著高于對照組，在隨后的貯藏過程中，除第8天外，兩組無顯著差異（P＞0.05）。在貯藏過程中，鮮切蘋果中多酚類物質(zhì)不斷被PPO催化消耗，其含量逐漸降低，但半胱氨酸處理誘導(dǎo)鮮切蘋果多酚類物質(zhì)的合成，使總酚含量增加，但隨著貯藏時間的延長，多酚合成能力逐漸減弱；因此，半胱氨酸處理組鮮切蘋果的總酚含量僅在貯藏初期高于對照組。

2.4 半胱氨酸對鮮切蘋果PPO活力的影響

PPO是引起鮮切蘋果組織褐變的關(guān)鍵酶，半胱氨酸對鮮切蘋果PPO活力的影響如圖4所示。對照組鮮切蘋果的PPO活力隨貯藏時間延長，呈先上升后下降的趨勢，在貯藏第6天時達到最大值，這與胡文忠等[24]的研究結(jié)果一致，半胱氨酸處理能夠延遲鮮切蘋果PPO活力的上升，其PPO活力在貯藏初期受到抑制，逐漸降低，在第4天時達到最低，隨后逐漸升高。鮮切蘋果貯藏期間PPO活力的增加可能由多種因素造成，如可能是結(jié)合態(tài)酶的釋放所致，也可能是由酶前體的轉(zhuǎn)化而來，或是由于機械傷害促使合成了新的PPO，也有可能是這些因素相互影響的作用結(jié)果。在貯藏的0～6 d，半胱氨酸處理組樣品PPO活力顯著低于對照組（P＜0.05），而從第8天開始顯著高于對照組（P＜0.05），說明半胱氨酸處理能夠在貯藏初期抑制鮮切蘋果的PPO活力，對延緩其褐變起到很大作用。

2.5 半胱氨酸對鮮切蘋果POD活力的影響

圖5 半胱氨酸處理對鮮切蘋果POD活力的影響Fig. 5 Effect of cysteine on POD activity of fresh-cut apples during storage

POD是植物體內(nèi)普遍存在的一種抗氧化酶，可以清除植物體內(nèi)過量的自由基，保持膜系統(tǒng)的完整性，維持正常代謝；但另一方面POD可以利用H2O2釋放出的O2氧化酚類物質(zhì)，引發(fā)褐變反應(yīng)[25]。如圖5所示，對照組鮮切蘋果的POD活力在貯藏最初6 d無明顯變化，從第8天開始逐漸升高，而半胱氨酸處理組樣品在貯藏過程中POD活力呈上升趨勢，且顯著高于對照組（P＜0.05）。機械傷害誘導(dǎo)半胱氨酸處理組鮮切蘋果POD活力提高，有助于及時清除因氧化和機械損傷而產(chǎn)生的過量H2O2，對延緩鮮切蘋果衰老具有積極的作用[26]。

2.6 半胱氨酸對鮮切蘋果CAT活力的影響

圖6 半胱氨酸處理對鮮切蘋果CAT活力的影響Fig. 6 Effect of cysteine on CAT activity of fresh-cut apples during storage

CAT能催化植物體內(nèi)積累的H2O2分解為H2O和O2，從而減輕H2O2對組織產(chǎn)生的氧化損傷[27]。圖6表示鮮切蘋果在貯藏期間的CAT活力變化情況，對照組樣品在貯藏過程中CAT活力逐漸下降，這可能是因為隨著貯藏時間的延長，蘋果組織衰老進程加劇，組織中了產(chǎn)生大量活性氧，從而抑制了CAT的活性。半胱氨酸處理樣品的CAT活力在貯藏第2天時有所提高，隨后也逐漸下降，在貯藏過程其活力顯著高于對照組（P＜0.05）。半胱氨酸處理使鮮切蘋果CAT活力得到增強，有利于組織中H2O2的清除，減輕了自由基引起的氧化損傷，進而抑制鮮切蘋果的褐變程度。

2.7 半胱氨酸對鮮切蘋果APX活力的影響

圖7 半胱氨酸處理對鮮切蘋果APX活力的影響Fig. 7 Effect of cysteine on APX activity of fresh-cut apples during storage

APX通過催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)，清除果蔬體內(nèi)的H2O2，從而降低其對細胞產(chǎn)生損傷[19]。對照組和半胱氨酸處理組鮮切蘋果的APX活力在貯藏過程中均呈下降趨勢（圖7），在貯藏的第2天和第8天，半胱氨酸處理組樣品APX活力顯著高于對照組（P＜0.05），除此之外，二者無顯著差異（P＞0.05）。鮮切蘋果貯藏過程中的APX活力快速下降，導(dǎo)致其對H2O2清除能力大幅降低，使鮮切蘋果內(nèi)部的活性氧大量積聚，從而引發(fā)細胞膜脂過氧化反應(yīng)，最終加劇褐變反應(yīng)。

2.8 半胱氨酸對鮮切蘋果GR活力的影響

圖8 半胱氨酸處理對鮮切蘋果GR活力的影響Fig. 8 Effect of cysteine on GR activity of fresh-cut apples during storage

GR能夠?qū)⒀趸凸入赘孰模╫xidized glutathione，GSSG）還原成還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），維持細胞內(nèi)充足的GSH水平，是果蔬組織中重要的抗氧化酶之一[21]。如圖8所示，兩組鮮切蘋果的GR活力變化趨勢大體一致，均呈先上升后下降的趨勢，在第2天時二者GR活力達到最大值，其中半胱氨酸處理組樣品GR活力下降速率較快，其活力僅在第2天和第4天時顯著高于對照組（P＜0.05），貯藏至8 d以后，半胱氨酸處

理組樣品的GR活力顯著低于對照組（P＜0.05）；因此，半胱氨酸處理僅能夠在貯藏初期提高鮮切蘋果的GR活力，增強其抗氧化能力。在植物體內(nèi)GR活力受到還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）與GSSG的雙重調(diào)控，同時也受細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)[28]。半胱氨酸處理組鮮切蘋果在貯藏后期可能積累了大量活性氧，改變了蘋果組織內(nèi)的氧化還原電位，或者是半胱氨酸處理對鮮切蘋果的NADPH和GSSG產(chǎn)生了不利影響，從而引起GR活力的迅速降低，后續(xù)還應(yīng)進一步深入研究揭示半胱氨酸處理對鮮切蘋果GR活力的影響機理。

2.9 半胱氨酸對鮮切蘋果抗氧化活性的影響

圖9 半胱氨酸處理對鮮切蘋果DPPH自由基（A）和ABTS＋ ·（B）清除能力的影響Fig. 9 Effect of cysteine on DPPH (A) and ABTS＋· (B) radical scavenging activity of fresh-cut apples during storage

分別采用DPPH自由基清除能力和ABTS＋·清除能力兩種方法評價鮮切蘋果的抗氧化活性。如圖9所示，鮮切蘋果具有較高的抗氧化活性，其對ABTS＋·清除能力大于對DPPH自由基清除能力。對照組鮮切蘋果對DPPH自由基的清除能力在貯藏最初4 d下降速率較快，隨后趨于平緩，半胱氨酸處理組樣品從第2天開始緩慢下降，在貯藏的2～8 d內(nèi)，其DPPH自由基清除能力均顯著高于對照組（P＜0.05），而貯藏至第10天時，與對照組無顯著差異（P＞0.05）。對照組鮮切蘋果對ABTS＋·清除能力在貯藏過程呈下降趨勢，而半胱氨酸處理組呈先上升后下降的趨勢，且在貯藏4 d后無顯著變化，在貯藏10 d內(nèi)半胱氨酸處理組鮮切蘋果對ABTS＋·清除能力顯著高于對照組（P＜0.05）。半胱氨酸處理激發(fā)了鮮切蘋果中抗氧化物質(zhì)的合成和積累，抑制了鮮切蘋果ABTS＋·和DPPH自由基清除能力的下降，很大程度上提升了鮮切蘋果的活性氧代謝能力，減輕活性氧對組織產(chǎn)生的氧化損傷。

2.10 半胱氨酸對鮮切蘋果MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

圖10 半胱氨酸處理對鮮切蘋果MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig. 10 Effect of cysteine on MDA content of fresh-cut apples during storage

MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量的高低可表示細胞膜脂質(zhì)過氧化程度[24]。由圖10可見，隨著貯藏時間的延長，對照組與半胱氨酸處理組鮮切蘋果的MDA質(zhì)量摩爾濃度均呈上升趨勢，說明在貯藏過程中鮮切蘋果的膜脂過氧化程度逐漸增加。在貯藏初期（0～4 d），對照組與半胱氨酸處理組樣品的MDA質(zhì)量摩爾濃度無顯著差異（P＞0.05），貯藏至第6天以后，半胱氨酸處理可以顯著抑制鮮切蘋果MDA的積累，說明半胱氨酸可以在貯藏后期降低鮮切蘋果的膜脂過氧化程度，減輕細胞膜的氧化損傷，保持膜的完整性。

2.11 相關(guān)性分析

表1 鮮切蘋果褐變指標的相關(guān)性分析Table 1 Pearson correlation coefベcients of BI, PPO activity, MDA content and antioxidant capacity

如表1所示，鮮切蘋果對D P P H自由基和ABTS＋·清除能力與其總酚和抗壞血酸含量呈極顯著或顯著正相關(guān)，這許多研究結(jié)果一致，鮮切水果的非酶抗氧化能力與總酚和抗壞血酸含量相關(guān)[6,18]。鮮切蘋果貯藏期間褐變程度（BI值）與抗壞血酸含量、CAT和APX活力以及DPPH自由基、ABTS＋·清除能力呈極顯著（P＜0.01）或顯著負相關(guān)（P＜0.05），與MDA質(zhì)量摩爾濃度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與PPO活力相關(guān)性較弱（R＝0.269）。

3 討 論

酶促褐變是影響鮮切果蔬貯藏品質(zhì)的重要因素之一，在完整的果實中，PPO主要存在于細胞質(zhì)、細胞膜和細胞壁上，而酚類物質(zhì)通常貯存和積累在液泡中，鮮切機械操作破壞了PPO和酚類物質(zhì)區(qū)域化分布，同時切割傷害誘導(dǎo)PPO活力逐漸上升，在貯藏過程中PPO不斷催化多酚類物質(zhì)氧化成醌類，使多酚類物質(zhì)含量逐漸降低，加劇鮮切果蔬組織褐變[29]。本研究中，對照組鮮切蘋果的總酚含量在貯藏前6 d下降速率較快，這可能與PPO活力的升高有關(guān)；而半胱氨酸處理后鮮切蘋果的PPO活力呈先下降后上升的趨勢。因此貯藏初期其總酚消耗較慢，且總酚含量顯著高于對照組，說明半胱氨酸對鮮切蘋果PPO活力的抑制具有時效性。相關(guān)性分析顯示鮮切蘋果的BI值與PPO活力和總酚含量相關(guān)性較小，半胱氨酸處理僅能在貯藏初期抑制鮮切蘋果的PPO活力，并且抑制總酚含量降低，由此可見半胱氨酸可能還通過其他途徑抑制鮮切蘋果的褐變。Cantos等[30]研究表明鮮切馬鈴薯褐變速率與PPO、酚類物質(zhì)濃度無關(guān)，細胞膜的完整性才是控制褐變速率的關(guān)鍵因素。保持膜的完整性是控制鮮切梨褐變的主要因素[31]。細胞膜的破壞除了是由于鮮切操作帶來的直接機械損傷外，更主要的是由于機械損傷引發(fā)大量活性氧的產(chǎn)生，直接或間接啟動膜脂的過氧化作用，引起細胞膜的氧化損傷，最終導(dǎo)致細胞膜的區(qū)室化功能喪失，從而加快酶促反應(yīng)的發(fā)生[15,32-33]。這與本研究鮮切蘋果褐變程度（BI值）與膜脂過氧化程度（MDA質(zhì)量摩爾濃度）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）的結(jié)果一致。

活性氧積累引起的膜脂過氧化能夠加劇酶促褐變，但果蔬體內(nèi)具備一套精確和完整的抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)：酶促活性氧自由基清除系統(tǒng)（包括SOD、CAT、APX、GR、POD等）和非酶促活性氧自由基清除系統(tǒng)（抗壞血酸、多酚、谷胱甘肽等），當(dāng)植物遭受機械傷害脅迫后，其體內(nèi)便產(chǎn)生一系列的傷信號分子（茉莉酸、乙烯、水楊酸、脫落酸等），激活局部損傷部位和未損傷部位或遠離傷害部位內(nèi)的抗氧化防御基因的轉(zhuǎn)錄與表達，從而提高鮮切果蔬的抗氧化能力，清除自由基，減輕氧化損傷[34-35]。而半胱氨酸處理后鮮切蘋果的CAT和GR活力在貯藏最初2 d升高，隨后逐漸下降，說明半胱氨酸誘導(dǎo)提高其抗氧化酶活力，從而抵御逆境脅迫傷害，隨著貯藏時間延長，鮮切蘋果抗氧化酶活力逐漸降低，因而氧化損傷逐漸加劇，細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，進而加速酶促褐變反應(yīng)。相關(guān)性分析也表明鮮切蘋果的膜脂過氧化程度（MDA質(zhì)量摩爾濃度）與抗氧化酶（CAT、APX、GR）活力、抗氧化物質(zhì)（總酚）含量以及抗氧化活力（DPPH自由基和ABTS＋·清除能力）呈極顯著（P＜0.01）或顯著負相關(guān)（P＜0.05），褐變程度（BI值）與抗氧化酶活力、抗壞血酸含量和抗氧化能力呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01）。半胱氨酸處理后鮮切蘋果抗氧化酶活力和抗氧化物質(zhì)含量得到顯著提高，抗氧化能力得到增強，并且在貯藏后期MDA的積累得到抑制。因此，推斷半胱氨酸可能通過提高鮮切蘋果的抗氧化能力，減緩自由基引起的氧化損傷，降低鮮切蘋果的膜脂過氧化程度，進而減緩鮮切蘋果的褐變反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，半胱氨酸可能是通過提高鮮切蘋果內(nèi)部抗氧化酶活力和抗氧化物質(zhì)的含量，增強其抗氧化能力，降低膜脂過氧化程度，減少MDA對細胞膜的損傷，同時抑制PPO活力，延緩鮮切蘋果貯藏期間的組織褐變，提高其貯藏品質(zhì)。因此，半胱氨酸可以作為一種安全的食品添加劑用于鮮切蘋果的貯藏保鮮。

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