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    啤酒花廢棄枝葉多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

    2018-02-28 07:39:57白姍姍張瑩瑩劉玉梅
    食品科學(xué) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:啤酒花枝葉極性

    白姍姍,張瑩瑩,趙 強(qiáng),劉玉梅*

    啤酒花(Humulus lupulus L.)是啤酒釀造過程中不可缺少的原料之一,被譽(yù)為“啤酒的靈魂”,同時(shí)具有健胃、消食等功效,可用于治療癔病、膀胱炎、肺結(jié)核等[1-5],主要化學(xué)成分為樹脂類[6]、揮發(fā)油[7-8]、多酚類[9-10]、黃酮類[11]等,其中多酚和黃酮類化合物具有很強(qiáng)的抗菌、抗炎、抗氧化等作用,也是各種植物中的主要抗氧化活性成分[12]。中國(guó)啤酒花產(chǎn)量位居世界第3,僅次于美國(guó)、德國(guó),新疆則是我國(guó)啤酒花最大的產(chǎn)區(qū)[13-14]。啤酒花采摘期間會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄枝葉,對(duì)其活性成分的研究和開發(fā)對(duì)發(fā)展新疆的經(jīng)濟(jì)具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn),啤酒花廢棄枝葉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,并具有一定的抗氧化活性[15],但抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此,對(duì)啤酒花廢棄枝葉抗氧化活性成分的深入研究,可以為開發(fā)利用啤酒花廢棄枝葉提供理論依據(jù)。

    本實(shí)驗(yàn)以新疆大面積種植的香型花札一和高酸型花馬可波羅2 個(gè)品種的廢棄枝葉為原料,并根據(jù)采摘部位將其分為主枝、側(cè)枝和葉子,分別以乙醇提取其活性成分,后經(jīng)氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得不同極性部位,通過羥自由基(?OH)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除實(shí)驗(yàn)、β-胡蘿卜素-亞油酸法及磷鉬酸法4 個(gè)評(píng)價(jià)體系,研究其醇提取物及不同極性部位的抗氧化能力,結(jié)合樣品中多酚及黃酮含量的相關(guān)性分析,對(duì)啤酒花廢棄枝葉進(jìn)行綜合分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    札一、馬可波羅啤酒花廢棄枝葉由新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技有限公司提供,實(shí)驗(yàn)室分選為主枝、側(cè)枝和葉子3 類樣品,40 ℃烘干、粉碎、過40 目篩,備用。

    DPPH 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;沒食子酸中國(guó)藥品生物制品檢定所;蘆丁 北京化學(xué)試劑公司;2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(2,6-di-tert-butyl-p-cresol,BHT)、β-胡蘿卜素、吐溫40、亞油酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鉬酸銨、氯化鈉、濃硫酸、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    KQ-100VED型三頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;BS210S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司;DHP-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;UV-5300PC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Anke.TGL-16G型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 啤酒花廢棄枝葉浸膏的提取

    取札一、馬可波羅啤酒花的主枝、側(cè)枝及葉子(葉子預(yù)先以石油醚脫脂),用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaCl溶液脫蛋白,以料液比1∶30(m/V)加入50%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇溶液,超聲波輔助提取10 min后,在60 ℃條件下浸提50 min,重復(fù)上述操作2 次,合并濾液,濃縮得浸膏,各提取物的浸膏得率見表1。準(zhǔn)確稱取一定量的浸膏,加水分散得乙醇提取物(ethanol extract,EE),再依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,萃取液分別回收溶劑后,得氯仿萃取物(chloroform extracts,CE)、乙酸乙酯萃取物(ethyl acetate extracts,EAE)、正丁醇萃取物(n-butanol extracts,NBE)和水相萃取物(water extracts,WE),萃取流程見圖1。將上述各萃取物分別用50%乙醇溶解并定容至25 mL,冷藏,用于后續(xù)多酚、黃酮含量的測(cè)定及抗氧化實(shí)驗(yàn)(各測(cè)試樣品的質(zhì)量濃度可依據(jù)浸膏得率計(jì)算)。測(cè)試前將樣品恢復(fù)至室溫后根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)的稀釋處理。

    表1 啤酒花廢棄枝葉浸膏得率Table 1 Yields of ethanol extracts from abandoned hop branches and leaves

    1.3.2 總多酚含量的測(cè)定

    采用福林-酚比色法[16-18],以干燥至恒質(zhì)量的沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,以A760nm對(duì)沒食子酸質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A760nm=0.011 8ρ-0.053 6,R=0.997 8,線性范圍為8.86~106.32 mg/L。

    1.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

    采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[19-20],以干燥至恒質(zhì)量的蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,以A510nm對(duì)蘆丁質(zhì)量濃度(ρ)作圖,得線性回歸方程A510nm=15.164 5ρ-0.002 0,R=0.999 3,線性范圍為8.73~69.82 mg/L。

    1.3.4 清除?OH活性測(cè)定

    采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法評(píng)價(jià)樣品清除?OH能力[21],以BHT(0.06~0.24 mg/mL)為對(duì)照。

    式中:E為?OH清除率/%;A樣是加樣品時(shí)溶液的吸光度;A損是以重蒸水代替樣品溶液時(shí)溶液的吸光度;A未是以重蒸水代替樣品和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01% H2O2時(shí)溶液的吸光度。

    1.3.5 清除DPPH自由基活性測(cè)定

    DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[22-23]的方法,以BHT(0.06~0.60 mg/mL)為對(duì)照。

    式中:D為DPPH自由基清除率/%;A1為加樣品時(shí)溶液的吸光度;A0為未加樣品時(shí)溶液的吸光度。

    1.3.6 β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化活性測(cè)定

    根據(jù)文獻(xiàn)[24]的方法,以BHT(0.10×10-4~0.10 mg/mL)為對(duì)照,以抗氧化指數(shù)(antioxidant activity index,AAI)的大小來(lái)反映抗氧化劑總抗氧化能力的強(qiáng)弱。

    式中:A樣t、A空t分別表示120 min時(shí)樣品和空白的吸光度;A樣0、A空0分別表示0 min時(shí)樣品和空白的吸光度。

    1.3.7 磷鉬酸體系抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

    按文獻(xiàn)[25]方法,以0.75 mg/mL的VC為對(duì)照,以抗氧化能力(antioxidant activity,AA)的大小來(lái)反映抗氧化劑總抗氧化能力的強(qiáng)弱。

    式中:A0和A1分別表示VC和樣品在820 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用OriginPro 8.6或SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù),并用ANOVA和鄧肯氏多重差異分析(P<0.05)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 啤酒花枝葉中多酚、黃酮含量

    多酚和黃酮類化合物在自然界中分布廣泛,且具有較強(qiáng)的抗氧化活性。該兩類化合物的極性范圍較寬,可以從不同極性的溶劑中萃取得到。因此,不同極性部位所得到的多酚、黃酮類化合物的種類及含量也會(huì)有所差異。札一和馬可波羅啤酒花不同極性部位的多酚、黃酮含量分別見表2、3。

    表2 各樣品多酚的含量Table 2 Contents of polyphenols in different solvent extracts

    表3 各樣品黃酮的含量Table 3 Contents of ぼavonoids in different solvent extracts

    由表2、3可知,啤酒花枝葉中均含有一定量的多酚和黃酮類化合物。札一枝干中多酚、黃酮含量均高于馬可波羅,而葉子中的含量均較低。同一樣品中EAE的多酚、黃酮含量均高于CE、NBE和WE,這與張強(qiáng)等[26]對(duì)杜仲葉提取物不同極性部位多酚含量研究的結(jié)果一致。不同極性部位相比較發(fā)現(xiàn),EAE的多酚、黃酮含量均顯著高于EE(P<0.05),札一枝干和馬可波羅主枝的NBE中多酚、黃酮含量也高于EE,表明經(jīng)不同極性溶劑萃取后多酚、黃酮物質(zhì)在EAE部位和札一枝干、馬可波羅主枝的NBE部位得到富集。

    2.2 啤酒花枝葉提取物對(duì)?OH清除活性的比較

    由圖2可知,各樣品對(duì)?OH均有一定的清除能力,且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。在枝干中,清除?OH的能力均為EAE最強(qiáng),WE最弱;而在葉子中,EAE、CE的清除能力最強(qiáng),NBE次之,但均顯著高于WE。

    圖2 各樣品清除?OH能力Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging capacity of different solvent extracts

    表4 各樣品清除?OH的IC50值Table 4 IC50 for hydroxyl radical scavenging activity

    清除?OH的能力通常以50%清除率時(shí)的樣品質(zhì)量濃度,即IC50值來(lái)衡量,IC50值越小,樣品抗氧化活性越強(qiáng)。由表4的IC50值可知,對(duì)2種啤酒花葉子極性部位提取物而言,除WE對(duì)?OH清除能力較差外,其他極性部位對(duì)?OH清除能力的差異不顯著(P>0.05),略低于對(duì)照品BHT(IC50值為(0.18±0.01)mg/mL)??傮w而言,EAE部位清除?OH能力較強(qiáng),該結(jié)論與王春景等[27]研究雞眼草和劉瓊等[28]研究傣藥竹葉蘭的結(jié)果類似。

    2.3 啤酒花枝葉提取物對(duì)DPPH自由基清除作用的比較

    圖3 各樣品清除DPPH自由基能力Fig. 3 DPPH radical scavenging activity of different solvent extracts

    由圖3可知,各樣品對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力。當(dāng)枝干樣品質(zhì)量濃度為0~5 mg/mL時(shí),清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大,超過5 mg/mL時(shí),清除率趨于平緩,說(shuō)明測(cè)試體系內(nèi)DPPH自由基已基本清除完全。

    表5 各樣品清除DPPH自由基的IC50值Table 5 IC50 for DPPH radical scavenging activity

    由表5的IC50值可知,樣品枝葉中EAE清除DPPH自由基的能力均最強(qiáng),主枝中CE最弱,側(cè)枝和葉子中WE最弱,且均低于對(duì)照組BHT(IC50值為(0.25±0.01)mg/mL)。對(duì)同一樣品的同一極性部位而言,枝干部分清除DPPH自由基的能力顯著高于葉子。上述結(jié)論與黃一泓等[29]研究藏紅花的結(jié)果相似,但在相同的質(zhì)量濃度下,枝干部分的EAE和NBE清除DPPH自由基能力遠(yuǎn)高于藏紅花萃取物。

    2.4 啤酒花枝葉提取物在β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系中總抗氧化能力的比較

    圖4 各樣品在β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系中的抗氧化能力Fig. 4 Total antioxidant activity in β-carotene-linoleic acid model

    由圖4可知,各樣品均有一定的抗氧化能力,當(dāng)質(zhì)量濃度為0~3 mg/mL時(shí),AAI值迅速增大,繼續(xù)增大質(zhì)量濃度,AAI值逐漸趨于平緩。樣品總抗氧化能力依次為EAE>NBE>CE>W(wǎng)E,略小于BHT(IC50值為3.82×10-3mg/mL)。

    表6 β-胡蘿卜素-亞油酸體系中各樣品IC50值Table 6 IC50 for total antioxidant activity in β-carotene-linoleic acid model

    由表6的IC50值可知,枝干中札一各極性部位的抗氧化活性略高于馬可波羅,葉子中則相反;而札一和馬可波羅兩個(gè)品種枝干部分的抗氧化活性區(qū)別不大。祁英等[30]對(duì)新疆紫草不同極性部位總抗氧化活性的研究顯示,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),EAE和NBE部位的AAI值分別為98%、28%,此結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)中EAE的總抗氧化活性接近,但NBE的活性遠(yuǎn)小于本實(shí)驗(yàn)的啤酒花枝葉提取物。

    2.5 啤酒花枝葉提取物在磷鉬酸體系中總抗氧化能力的比較

    圖5 各樣品在磷鉬酸體系中的抗氧化能力Fig. 5 Total antioxidant activity in phosphomolybdenum model

    由圖5可知,各樣品抗氧化的AA值隨樣品質(zhì)量濃度的增大而增大,表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性。樣品主枝和葉子中各部位的抗氧化能力以EAE最強(qiáng),其次是NBE、CE和WE;側(cè)枝中各部位的抗氧化能力依次為EAE、CE、NBE和WE。

    表7 磷鉬酸體系中各樣品IC50值Table 7 IC50 in phosphomolybdenum model

    由表7可知,磷鉬酸體系中樣品抗氧化能力與β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系的結(jié)果類似,枝干中札一各極性部位的抗氧化活性高于馬可波羅,而葉子中相反,且不同極性部位存在顯著差異(P<0.05)。

    由表4~7的數(shù)據(jù)可知,所有抗氧化體系中,EAE的抗氧化能力均高于EE,與黃酮、多酚含量的研究結(jié)果一致,說(shuō)明多酚、黃酮為其主要的抗氧化活性成分。啤酒花枝葉提取物在β-胡蘿卜素-亞油酸體系的IC50最小,在0.04~0.32 mg/mL之間,磷鉬酸體系最大,達(dá)到20.24~143.23 mg/mL。

    2.6 啤酒花枝葉不同極性部位多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

    大量研究表明,植物活性成分的抗氧化能力可能與其多酚、黃酮的含量有關(guān)[18]。為了進(jìn)一步研究上述提取物的抗氧化活性與多酚、黃酮含量的相關(guān)性,對(duì)不同極性部位抗氧化的IC50值與多酚、黃酮含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,4 種抗氧化體系與啤酒花主枝、側(cè)枝和葉子中的多酚、黃酮含量的相關(guān)性分析見表8。

    多酚和黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性差異較大。在枝干中,多酚和黃酮含量與抗氧化能力均為極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)在-0.652~-0.917之間(P<0.01),在葉子提取物中,除多酚含量與?OH清除能力的相關(guān)系數(shù)為-0.493(顯著相關(guān)(P<0.05)),在其他抗氧化體系中均為極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)在-0.728~-0.934(P<0.01)之間,說(shuō)明啤酒花枝葉樣品中的多酚、黃酮為其主要抗氧化成分。多酚和黃酮結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu),使得多酚和黃酮具有較強(qiáng)捕捉自由基的能力和抗氧化活性,并且抗氧化活性強(qiáng)弱與其多酚和黃酮類物質(zhì)含量的高低、種類、結(jié)構(gòu)有關(guān),這也說(shuō)明啤酒花枝葉提取物中多酚、黃酮的種類多樣。

    3 結(jié) 論

    札一和馬可波羅啤酒花枝葉提取物中含有多酚、黃酮類化合物,且具有一定的抗氧化能力。因多酚、黃酮類化合物種類多,極性范圍較寬,而經(jīng)不同溶劑萃取后,EAE的多酚、黃酮含量和抗氧化活性均高于EE,說(shuō)明啤酒花枝葉提取物主要以極性較低的黃酮苷元類物質(zhì)為主,經(jīng)過初步分離后,乙酸乙酯對(duì)這些成分有效富集。相關(guān)性分析也表明,除個(gè)別樣品外,所有抗氧化活性體系與多酚、黃酮含量的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均大于0.650,說(shuō)明多酚和黃酮是啤酒花枝葉抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。而對(duì)于啤酒花枝葉的抗氧化成分及其活性的構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步深入探明。

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