水稻秈粳指數(shù)鑒定方法及亞種間雜交的分子輔助育種

季文杰 李陽生

摘要：秈粳交F1株高、生育期超親、結(jié)實(shí)率低、子粒充實(shí)度差是長(zhǎng)期困擾水稻（Oryza sativa L.）亞種間雜交育種的幾大難題。通過對(duì)水稻秈粳指數(shù)鑒定方法的發(fā)展、遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)系的研究進(jìn)行總結(jié)，并結(jié)合株高、抽穗期、育性基因及庫源關(guān)系等方面的研究進(jìn)展，討論分子標(biāo)記方法在水稻育種工作中的應(yīng)用前景，以期為水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)利用提供一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）;亞種間雜交;秈粳指數(shù);遺傳距離（GD）;分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）

中圖分類號(hào)：S512? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0041-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.011? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Tall culm，long growth period，low seed setting rate and bad grain filling are the main problems of indica-japonica inter-subspecific hybrid F1 progeny in rice.This article reviewed the advances of indica-japonica index identification technologies，the relationship between parents genetic distance and F1 heterosis，and the progress in research on plant hight，heading date，fertility genes，and source-sink relationship，to investigate the prospect of molecular markers in rice breeding，hoping to provide some references for the utilization of inter-subspecific heterosis.

Key words： rice（Oryza sativa L.）; inter-subspecific hybridization; indica-japonica index; genetic distance （GD）; molecular marker-assisted selection （MAS）

水稻（Oryza sativa L.）秈粳亞種間雜交有著顯著的雜種優(yōu)勢(shì)效應(yīng)，一直以來都是育種家關(guān)注的重點(diǎn)，然而普遍偏低的結(jié)實(shí)率成為限制其超高產(chǎn)潛力實(shí)現(xiàn)的主要因素之一。前人研究[1，2]表明，雜交水稻株高優(yōu)勢(shì)遵循秈粳交>秈爪交>粳爪交>秈秈交>粳粳交的規(guī)律，而結(jié)實(shí)率趨勢(shì)則正相反。如何掌握其中的平衡，仍需要大量的嘗試和摸索，而在此之前，鑒定試驗(yàn)材料的秈粳屬性是非常必要的。典型秈粳交組合的F1通常存在株高偏高、生育期偏長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率較低、谷粒充實(shí)度較差等問題。在此，結(jié)合最新的分子標(biāo)記技術(shù)和量化研究方法，明確材料秈粳指數(shù)，優(yōu)化親本遺傳距離，將有利于選育出優(yōu)良的亞種間雜交稻組合。

1? 秈粳指數(shù)鑒定方法

1.1? 形態(tài)標(biāo)記

對(duì)于田間應(yīng)用，中國(guó)主要采用程氏（六性狀）指數(shù)法[3];后由陳躍進(jìn)等[4]改進(jìn)，增加幼苗KClO3抗性指標(biāo)（表1、表2）。

1.2? 生理生化標(biāo)記

主要有同工酶法和維管束法。同工酶法，常用酯酶，已鑒別并應(yīng)用了10多個(gè)秈粳特異酯酶同工酶帶[5];維管束法，秈稻/粳稻穗頸大小維管束之比分別在1.0和0.5左右，倒二節(jié)間和穗頸大維管束之比分別在1.5和2.5左右[6]。

1.3? 分子標(biāo)記

從最開始應(yīng)用化學(xué)酶切方法的RFLP，到酶切與PCR相結(jié)合的AFLP、RAPD，及至后期SSR、ISSR、EST、CAPs、InDel、ILP、SRAP、TRAP、SNP等各種PCR標(biāo)記[7]。常運(yùn)用于水稻秈粳指數(shù)檢測(cè)的大致有以下幾種。

1.3.1? 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）? RFLP是最早采用的一類分子標(biāo)記方法。李任華等[8]采用42對(duì)秈粳特異RFLP探針，結(jié)合數(shù)學(xué)方法鑒定秈粳指數(shù)，計(jì)算公式為：

式中，Dj表示單位點(diǎn)粳性指數(shù)，F(xiàn)i、Fj分別是此位點(diǎn)某等位基因在秈、粳類群中的基因頻率。

式中，TDj表示品種總粳性指數(shù)。

此方法采用酶切手段，存在技術(shù)繁瑣、多態(tài)性低等缺點(diǎn)，后續(xù)出現(xiàn)了RAPD、AFLP等改進(jìn)。

1.3.2? 簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）? 又稱STR、SSLP、微衛(wèi)星DNA標(biāo)記。毛艇等[9]以典型秈稻七山占和典型粳稻秋光及其RILs為對(duì)象，以28對(duì)秈粳特異SSR標(biāo)記可以很好地鑒定材料的秈粳特性。計(jì)算公式為：

Dj=B位點(diǎn)數(shù)/（A位點(diǎn)數(shù)+B位點(diǎn)數(shù)）×100%

式中，Dj表示偏粳系數(shù)，A、B分別表示與七山占或秋光帶型相同的位點(diǎn)。并定義Dj>50%為粳型，Dj<50%為秈型。

SSR標(biāo)記因其共顯性、高信息量與可重復(fù)性以及較低的技術(shù)難度和試驗(yàn)成本得到了很多研究者的青睞，經(jīng)過多次改進(jìn)之后，已成為目前最常用的水稻秈粳特性鑒定方法之一。

1.3.3? 插入/缺失標(biāo)記（InDel）? Lu等[10]利用基于9311（典型秈稻）和日本晴（典型粳稻）全基因組序列比對(duì)獲得的34對(duì)秈粳特異性InDel標(biāo)記進(jìn)行水稻秈粳指數(shù)研究（InDel分子指數(shù)法）。計(jì)算方法為：

Fi、Fj分別表示品種秈性指數(shù)和粳性指數(shù);Xii、Xjj、Xij各代表純合秈、粳以及雜合型位點(diǎn)，是計(jì)為1，否計(jì)為0。

根據(jù)計(jì)算得到的Fi、Fj值劃分秈粳屬性，其分類標(biāo)準(zhǔn)見表3。此方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高，并且計(jì)算方式科學(xué)、秈粳分類細(xì)致，是一種較有前景的秈粳指數(shù)鑒定手段。

1.3.4? 單核苷酸多態(tài)性（SNP）? 隨著測(cè)序技術(shù)的普及，獲得秈、粳稻全基因組序列變得越來越容易，通過全基因組范圍比對(duì)通?？梢园l(fā)現(xiàn)數(shù)以百萬計(jì)的單堿基替換（SNP），是目前密度最大、應(yīng)用范圍最廣的分子標(biāo)記。SNP標(biāo)記可結(jié)合基因芯片、測(cè)序技術(shù)，運(yùn)用生物信息學(xué)手段實(shí)現(xiàn)數(shù)字化分析，這些標(biāo)記在分子輔助育種、基因克隆工作中很有應(yīng)用潛力[11]，必將成為未來最有希望的分子標(biāo)記及秈粳指數(shù)鑒定方法之一。

1.3.5? 細(xì)胞質(zhì)類型鑒定? 有研究[12]表明，與粳稻相比，多數(shù)秈稻品種的葉綠體DNA（cpDNA）在ORF100內(nèi)有69 bp缺失，可作為秈粳葉綠體分型的標(biāo)記;孫傳清等[13]使用17種內(nèi)切酶組合的RFLP標(biāo)記將118份普通野生稻和76份亞洲栽培稻線粒體DNA（mtDNA）分成5類，并證實(shí)秈粳分化依然是其中的主流。

以上結(jié)果表明，除核基因組以外，水稻在細(xì)胞質(zhì)水平上同樣存在著秈粳分化，為研究亞洲栽培稻的起源、亞種間雜交工作提供了新的思路。

2? 遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)

有關(guān)親本分化遠(yuǎn)近或稱遺傳距離（Genetic distance，GD）與雜種優(yōu)勢(shì)大小關(guān)系的研究很早就已經(jīng)開始了。對(duì)秈型雜交稻的標(biāo)記分析[14]表明，其親本遺傳距離狹窄（0.059 8～0.391 3，平均0.2左右），而汕優(yōu)63所表現(xiàn)出的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)很可能起因于其親本明恢63帶有部分粳型血緣、雙親間GD較大，選擇遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的品種進(jìn)行雜交顯得尤為必要。甬優(yōu)系列超級(jí)稻的開創(chuàng)者通過對(duì)甬優(yōu)6號(hào)親本的分析[15]發(fā)現(xiàn)，母本含有89.5%粳稻組分、父本含有84.2%秈稻組分，證明秈粳成分按一定比例配組可以克服F1育性障礙，繼而育成高產(chǎn)超級(jí)雜種。

另一方面，有很多研究者一直在致力于尋找秈粳親本最優(yōu)遺傳距離，并希望給出一個(gè)數(shù)量范圍。李亞莉等[16]利用SSR標(biāo)記對(duì)滇型雜交稻的分析認(rèn)為，親本遺傳距離與雜種產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)無線性關(guān)系，但適中的差異容易產(chǎn)生正向極端組合，便于篩選強(qiáng)優(yōu)勢(shì)品種。嚴(yán)欽泉等[17]以程氏指數(shù)法為標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建包含15個(gè)不同秈粳指數(shù)父母本的不完全雙列雜交群組，結(jié)果顯示，親本程氏指數(shù)差值為9時(shí)（典型粳稻滿分24），產(chǎn)量超親優(yōu)勢(shì)有一峰值。Li等[18]使用42對(duì)RFLP探針，以培矮64s為母本（夏士健等[19]確定其秈性指數(shù)為0.76），認(rèn)為父本總粳性指數(shù)在20～25（換算為百分值50%～60%）時(shí)，F(xiàn)1結(jié)實(shí)率與產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)出現(xiàn)極大值。Dan等[20]采用34對(duì)InDel分子標(biāo)記，檢測(cè)并選出12種不同來源的秈粳稻親本，組建完全雙列雜交群組，結(jié)合表型分析數(shù)據(jù)，認(rèn)為當(dāng)雙親遺傳分化指數(shù)（GDI）在0.37左右時(shí)，F(xiàn)1單株產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)最高。于亞輝等[21]選取142對(duì)SSR標(biāo)記引物，用一套秈粳RILs與粳型兩用不育系GB028S（Dj=0.875）進(jìn)行雜交，對(duì)親本偏粳系數(shù)及雜種表型進(jìn)行分析，結(jié)果表明父本（RILs）Dj在0.55～0.65時(shí)，F(xiàn)1有形成較高產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)的潛力。以上研究中F1出現(xiàn)產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)峰值的雙親遺傳距離均分布在0.3～0.4（略有一些浮動(dòng)），在育種實(shí)踐中或可借鑒。

當(dāng)然，也有一些研究者持有不同觀點(diǎn)。分子標(biāo)記可分為一般性標(biāo)記（隨機(jī)標(biāo)記）和特異性標(biāo)記（與產(chǎn)量等QTL連鎖）。Zhang等[22]根據(jù)混合標(biāo)記的分析結(jié)果，認(rèn)為F1雜種優(yōu)勢(shì)與標(biāo)記的一般雜合度相關(guān)性不顯著，與特殊雜合度相關(guān)顯著;倪先林等[23]的結(jié)論則正相反。羅小金等[24]研究顯示，不同親本材料、遺傳距離范圍內(nèi)，GD與F1單株產(chǎn)量及產(chǎn)量相關(guān)性狀的雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)聯(lián)性各不相同，關(guān)系復(fù)雜，缺乏可統(tǒng)一的模式。

秈粳交親本遺傳距離與F1產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)的平衡是一個(gè)十分復(fù)雜的問題，值得投入更多人力物力進(jìn)行研究。同時(shí)，也可以利用已有成果進(jìn)行一些嘗試，大膽假設(shè)，小心求證。

3? 分子標(biāo)記輔助育種

典型秈粳亞種間雜交存在四大難題，針對(duì)這幾個(gè)方面已經(jīng)逐漸形成一些技術(shù)思路，而分子標(biāo)記的發(fā)展則提供了更多選擇。

3.1? 株高偏高與矮稈基因的克隆

水稻株高的建成主要與赤霉素（GA）、油菜素內(nèi)酯（BR）、獨(dú)腳金內(nèi)酯（SL）等植物激素有關(guān)，形成一個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)[25]。水稻中第一個(gè)被克隆的株高控制基因是“綠色革命”基因sd1[26]，編碼赤霉素GA20氧化酶，與另一個(gè)主效基因D18[27]的產(chǎn)物GA3氧化酶，是水稻株高調(diào)控的兩個(gè)主要靶標(biāo)。目前水稻中克隆赤霉素通路基因近20個(gè)，加上其他相關(guān)的生長(zhǎng)因子通路，則克隆株高調(diào)控基因已達(dá)70余個(gè)[28]，而理想株型基因IPA1[29]同樣被證明會(huì)影響株高。已經(jīng)有人嘗試設(shè)計(jì)并應(yīng)用了sd1位點(diǎn)的分子標(biāo)記[30]對(duì)其他非等位矮稈基因進(jìn)行選擇和聚合，相信將會(huì)越來越多應(yīng)用于秈粳交品種的株高控制。

3.2? 生育期偏長(zhǎng)與抽穗期相關(guān)基因

水稻的生育期，即從播種到成熟的整個(gè)生育進(jìn)程，可以分為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、生殖生長(zhǎng)期、成熟期3個(gè)階段，其中生殖生長(zhǎng)期和成熟期時(shí)間比較固定，受光溫等環(huán)境因素影響較小。因此，對(duì)水稻生育期控制的研究大多集中在播種到始穗之前，即所謂抽穗期（Heading date）階段。

水稻中有3條獨(dú)立的光周期調(diào)控路徑，分別為OsGI-Hd1-Hd3a[31]、Ghd7-Ehd1-Hd3a/RFT1[32]、DTH2-Hd3a/RFT1[33]，感知日照長(zhǎng)短對(duì)開花時(shí)間進(jìn)行著精細(xì)的調(diào)控。關(guān)于秈粳交F1生育期超親的問題，很多研究都提到了可以利用不同生態(tài)類型水稻的感光等位基因來控制，部分育種家已經(jīng)做出了有益的嘗試[34]。據(jù)吳子帥[35]總結(jié)，截至2016年，已克隆水稻抽穗期調(diào)控基因24個(gè)、定位QTL逾700個(gè)。結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）和遺傳工程手段對(duì)這些基因位點(diǎn)進(jìn)行合理搭配與運(yùn)用是未來的主要研究方向之一。

3.3? 結(jié)實(shí)率低與廣親和材料的應(yīng)用

水稻亞種間雜交F1結(jié)實(shí)率低起因于雜種不育現(xiàn)象，而以雌/雄配子敗育最為常見。水稻中第一個(gè)定位的雜種不育基因是廣親和基因S5n[36]，之后一系列育性相關(guān)位點(diǎn)陸續(xù)被報(bào)道，其中部分基因已被克隆并得到了較為深入的研究[37]。

關(guān)于如何利用親和基因提高秈粳雜交F1結(jié)實(shí)率，一般有3種策略。第一種是培育含有S5n（及其他中性基因位點(diǎn)）的廣親和不育系、恢復(fù)系，與高配合力秈/粳品種雜交，得到產(chǎn)量性狀優(yōu)良的雜種后代。其典型應(yīng)用首推以兩優(yōu)培九為代表的兩系超級(jí)雜交稻（分別以培矮64s、Y58s等優(yōu)秀廣親和不育系為母本）[38]，以及采用“粳不秈恢”育種策略的優(yōu)良三系雜交稻組合，包括甬優(yōu)系列、浙優(yōu)系列等（使用具有廣親和特性的秈粳中間型恢復(fù)系作為父本）[39]。第二種是通過導(dǎo)入Si或Sj基因培育粳型親秈系或者秈型親粳系，這樣育成的品種如育種常用廣親和不育系509s[40]。第三種是利用RNAi技術(shù)抑制雜種不育相關(guān)基因的表達(dá)。

3.4? 子粒充實(shí)度差與“源-庫-流”關(guān)系理論

對(duì)水稻子粒充實(shí)過程的研究一般分為3個(gè)部分，分別為干物質(zhì)生產(chǎn)能力、收獲潛力及實(shí)際產(chǎn)量，即“源-庫-流”的關(guān)系。秈粳雜交多數(shù)源、庫比較充足，抽穗期物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙是導(dǎo)致充實(shí)度差的主要原因[41]。

對(duì)子粒灌漿與內(nèi)源激素關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，秈粳交水稻存在強(qiáng)烈的穗尖頂端優(yōu)勢(shì)，中下部穗粒發(fā)育受到抑制，呈現(xiàn)階梯式灌漿現(xiàn)象;對(duì)子粒灌漿化學(xué)基礎(chǔ)的研究發(fā)現(xiàn)，秈、粳基因的不協(xié)調(diào)性（相對(duì)于親和性而言）導(dǎo)致雜種小穗中內(nèi)源激素、ATP及淀粉合成酶等含量少且活性低，即子粒生理活性的下降，使得淀粉合成緩慢、胚乳發(fā)育不良，是引起穗部物質(zhì)轉(zhuǎn)入率低、谷粒充實(shí)度差的最主要原因[42]。關(guān)于育種，根據(jù)袁隆平“以飽攻飽”的原則[43]，應(yīng)當(dāng)選擇子粒充實(shí)度高、一般配合力好的親本配組;同時(shí)，對(duì)于子粒充實(shí)性相關(guān)互補(bǔ)基因的發(fā)掘和利用仍是最有前途的方向之一。

4? 展望

秈粳亞種間超高雜種優(yōu)勢(shì)的利用一直以來都是育種家努力追求的方向，但由于F1結(jié)實(shí)率低以及其他一些問題使得典型秈粳交雜種優(yōu)勢(shì)的直接利用難以實(shí)現(xiàn)。中國(guó)水稻學(xué)界先后提出部分利用秈粳有利性狀[44]、秈粳架橋[45]、利用廣親和基因等多種方案，而對(duì)秈粳交親本遺傳距離與F1產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)系的研究也是其中比較有希望的方向之一。根據(jù)對(duì)前人研究的總結(jié)，作者在此提出一個(gè)0.3～0.4的雙親最優(yōu)遺傳距離范圍，以供各位指正與討論，并希望為今后的秈粳雜交育種親本選擇工作提供一些借鑒。

在秈粳指數(shù)鑒定過程中應(yīng)用了多種分子標(biāo)記方法，結(jié)合對(duì)水稻株高、抽穗期、育性、灌漿活化基因的克隆與深入研究，利用分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）方法，相信亞種間雜種優(yōu)勢(shì)利用的障礙將會(huì)逐步解決。

隨著水稻基因組和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，正進(jìn)入一個(gè)數(shù)字化分析的全新時(shí)代。利用測(cè)序數(shù)據(jù)，一些軟件已經(jīng)可以做到初步秈粳聚類[46-48]，另有一些研究則開始嘗試應(yīng)用程序手段開發(fā)和優(yōu)化分子標(biāo)記[49，50];下一步要做的就是解放雙手，使用計(jì)算機(jī)代替PCR和電泳，直接實(shí)現(xiàn)全基因組范圍內(nèi)分子標(biāo)記基因型的自動(dòng)化分析，快速、準(zhǔn)確、高效地鑒定材料秈粳指數(shù)，并結(jié)合最新的基因工程技術(shù)，實(shí)現(xiàn)水稻亞種間甚至是種間雜種優(yōu)勢(shì)的直接利用。

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