水稻秈粳性特異分子標(biāo)記的篩選與判別體系的建立

董景芳，李學(xué)忠,2，張少紅，劉斌，趙均良，楊梯豐

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/ 廣東省水稻育種新技術(shù)重點實驗室/ 廣東省水稻工程實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南優(yōu)質(zhì)稻遺傳育種重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225）

【研究意義】水稻（Oryza sativaL.）是世界上最重要的糧食作物之一，目前全球超過一半以上人口以水稻為主食［1］。水稻在漫長的馴化過程中，形成了明顯的遺傳分化，其中秈粳亞種分化是其分化的主流。探究水稻品種（系）的秈粳屬性是研究水稻亞種起源以及秈粳亞種雜交利用的基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】目前，水稻的秈粳性主要從形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記等方面進(jìn)行區(qū)分。在國內(nèi)由程侃聲［2］創(chuàng)立的亞洲稻秈粳亞種“程式指數(shù)鑒別法”是當(dāng)前鑒定水稻亞種最為流行的方法，但該法不僅需要植株成熟，還需考察許多農(nóng)藝性狀，較繁瑣和復(fù)雜，且植株長勢和長相受生長環(huán)境影響較大。此外，現(xiàn)在許多水稻品種（系）都滲入了秈/粳成分，單純利用“程式指數(shù)鑒別法”已經(jīng)很難精確判別其秈粳性。相比于形態(tài)學(xué)和生化方法，分子標(biāo)記直接反映核苷酸序列上的變異，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、不受環(huán)境影響等優(yōu)勢，因此在水稻秈粳分類［3-9］以及分子育種［10-12］等方面都發(fā)揮重要作用。其中，SSR 標(biāo)記［13-18］和InDel 分子標(biāo)記［19-23］具有基因組分布廣泛、檢測技術(shù)簡單和費用低等特點，已被廣泛應(yīng)用于水稻秈粳屬性鑒定。

【本研究切入點】目前雖然已經(jīng)公布了一批可用來進(jìn)行秈粳性判別的分子標(biāo)記［13-16,23］，但這些秈粳性判別分子標(biāo)記在進(jìn)行秈粳性判別試驗中所用的試材往往較少或遺傳背景較狹窄［21-22］，這些分子標(biāo)記在遺傳背景多樣的試材中，是否仍然表現(xiàn)出秈粳特異性是未知的。此外，目前秈粳性的判別多是基于與2 個對照品種9311（秈稻）和日本晴（粳稻）的比較，無法準(zhǔn)確反映待測品系與秈（粳）亞種群體的秈粳相似性，從而無法準(zhǔn)確區(qū)分偏秈（粳）水稻品種（系）?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選出一套能特異判別秈粳性的分子標(biāo)記，并采用代表秈稻和粳稻亞種的組群為參照計算待測品系的秈粳相似性，可以更準(zhǔn)確判別檢測品系的秈粳性。為篩選出秈粳性特異分子標(biāo)記，并構(gòu)建一套基于秈粳組群的水稻秈粳性的判別體系，本研究在能代表世界水稻遺傳多樣性的水稻多樣性種質(zhì)平臺2（RDP2）中，根據(jù)覆蓋全基因組的7 萬個SNP 分子標(biāo)記的基因型選取了保留群體多樣性的92 份水稻品種（系）為供試材料［24］，用已經(jīng)公布的51 對秈粳特異分子標(biāo)記進(jìn)行檢測［13-16,23］。根據(jù)檢測結(jié)果，篩選出24 對能特異地判別秈粳性的分子標(biāo)記；根據(jù)24 對分子標(biāo)記的秈粳性聚類結(jié)果，選取其中10 份品種（系）（5份秈稻、5 份粳稻）分別組成秈性和粳性判別組，根據(jù)待測品系與判別組的相似度客觀判定待測品系的秈粳性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在水稻多樣性種質(zhì)平臺2（RDP2），根據(jù)70 萬個SNP 標(biāo)記基因型，從12 條染色體中均勻選取7 萬個SNP 標(biāo)記，對保留了水稻遺傳多樣性的377 份稻種進(jìn)行聚類分析［24］，根據(jù)聚類結(jié)果選取保留了群體遺傳多樣性的92 份水稻品種（系）為供試材料，其中秈稻47 份，粳稻45 份（表1）；于2016 年晚季種植于大豐農(nóng)場，成熟后按株系收獲種子，取30 粒發(fā)芽種子提取DNA進(jìn)行試驗。

表1 92 份水稻品種（系）試材Table 1 92 rice varieties for test

1.2 用于篩選的分子標(biāo)記

根據(jù)前期相關(guān)研究，選擇可區(qū)分秈粳性的SSR 引物17 對［13-16］和InDel 標(biāo)記34 對［23］，這些標(biāo)記在水稻12 條染色體上都有分布，詳細(xì)信息見表2。

1.3 DNA 提取、PCR 反應(yīng)及帶型檢測

取適量嫩芽，一一對應(yīng)放入96 孔培養(yǎng)板，加入600 μL 蔗糖提取液（成分：6.1 g/L Tris、17.5 g/L NaCl、102.7 g/L 蔗糖、pH 8.0），在組織研磨儀中打碎組織（1 200 r/min，40 s），95 ℃水浴30 min 后，2 000 r/min 離心10 min，上清液即為DNA 模板。

PCR 反應(yīng)體系：2×Es Taq MasterMix 7.5 μL，10 μmol/L 引物0.5～0.8 μL，DNA 模板2.0 μL，補滅菌水至15.0 μL。

PCR 反應(yīng)流程：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、51～60℃退火30 s、72℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72℃延伸8 min。

PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，在電壓為105 V 的情況下，進(jìn)行8.0% PAGE 膠電泳，電泳結(jié)束后將PAGE膠放入純水溶解的10-4GoldView 溶液中染色10～15 min，然后用凝膠成像系統(tǒng)檢測帶型。

1.4 專一帶型頻率計算

以對照品種9311 和日本晴的帶型為標(biāo)準(zhǔn)，與9311 帶型一致的為秈型條帶，與日本晴帶型一致的為粳型條帶。

秈型專一帶型頻率=〔2×純合秈型條帶數(shù)＋秈性條帶數(shù)（雜合帶型）〕/（2×秈稻數(shù)）；

粳型專一帶型頻率=〔2×純合粳型條帶數(shù)＋粳型條帶數(shù)（雜合帶型）〕/（2×粳稻數(shù)）

1.5 聚類分析

利用NTSYS-pc Version 2.1e 進(jìn)行測試品種（系）秈粳聚類分析。把每個標(biāo)記的秈粳特異帶型轉(zhuǎn)化為二進(jìn)制數(shù)據(jù)（1 為有帶，0 為無帶），先通過SIMQUAL 程序，利用SM 系數(shù)計算相似性矩陣，再通過SHAN 程序，根據(jù)UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析［25］。

1.6 秈性判別值計算

式中，Di為秈性判別值，Si（Sj）為待測系與秈（粳）型測驗群的平均相似系數(shù)，SKi（SKj）為待測系與各秈（粳）型測驗種的相似系數(shù)，其中Ki（Kj）=1……Ni（Nj），Ni（Nj）為秈（粳）型測驗種的個數(shù)；S為指采用DICE 方法（2×共有帶型數(shù)目/〔2×共有帶型數(shù)目+品系1 特有帶型數(shù)目+品系2 特有帶型數(shù)目〕）計算出2 個品系的相似系數(shù)。計算出的秈性判別值對應(yīng)秈粳屬性，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：Di≤0.25 為粳，0.25＜Di≤0.5 為偏粳，0.5＜Di≤0.75 為偏秈，0.75＜Di為秈［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選出24 對秈粳特異分子標(biāo)記

利用92 份來自世界各地的秈稻和粳稻品種（系），對51 對秈粳分化分子標(biāo)記進(jìn)行特異性檢測，發(fā)現(xiàn)27 對分子標(biāo)記判別秈粳性的特異性不高（表2）。主要有以下3 種情況：如R1M37 在檢測群體中出現(xiàn)偏態(tài)分布，在檢測群體中傾向出現(xiàn)秈型條帶；R12M27 擴(kuò)增條帶模糊，且在檢測群體中傾向出現(xiàn)粳型條帶；RM240 的多態(tài)性很高，在檢測群體中出現(xiàn)多種帶型，不具備秈粳特異性（圖1）。

表2 51 對用于秈粳判別的分子標(biāo)記Table 2 51 pairs of molecular markers for indica-japonica discrimination

有24 對分子標(biāo)記的秈粳特異性好，適用于水稻的秈粳性判別（圖2）。這些標(biāo)記在秈（粳）稻群中出現(xiàn)專一帶型的頻率均高于69.5%，其中12對分子標(biāo)記（R1M7、RM104、R2M10、R2M24、R2M50、R3M10、RM130、R5M30、R7M37、R8M46、R9M42、R12M43）在秈（粳）稻群中出現(xiàn)專一帶型的頻率均高于0.900（表3）。R2M50在粳稻群體出現(xiàn)專一帶型頻率為1；15 對分子標(biāo)記在粳稻群體出現(xiàn)專一帶型頻率均高于0.950。R1M7 和R9M42 在秈稻群體出現(xiàn)專一帶型頻率均為0.989；8 對分子標(biāo)記在秈稻群體出現(xiàn)專一帶型頻率均高于0.950。

表3 秈粳專一標(biāo)記在秈稻和粳稻群體中出現(xiàn)的頻率Table 3 Occurrence frequency of indica-japonica specific molecular markers in indica and japonica rice populations

24 對分子標(biāo)記均勻分布在水稻的12 條染色體上，其中在第1、2、3、4 號染色體上各有3對秈粳性特異的分子標(biāo)記；在第6、7、8、11 號染色體上各有2 對秈粳性特異的分子標(biāo)記；其余4 條染色體上各有1 對秈粳性特異的分子標(biāo)記（表2）。

2.2 基于24 對秈粳特異分子標(biāo)記的水稻秈粳性聚類分析

根據(jù)秈粳專一分子標(biāo)記的帶型結(jié)果，對92份水稻品種（系）進(jìn)行秈粳性聚類分析。聚類結(jié)果（圖3）顯示，92 份品種（系）可分為秈稻和粳稻2 個組群，其中秈稻47 份、粳稻45 份，與這些品種（系）已知的秈粳屬性完全吻合。

通過聚類發(fā)現(xiàn)，在秈稻群中各品種（系）秈粳性的相似系數(shù)仍有較大差異，如482I、1400I、656I、1203I、933I、621I、1052I，它們與秈稻群中其他品種（系）秈粳性的相似系數(shù)低于0.85；類似地，在粳稻群中各品種（系）秈粳性的相似系數(shù)也有較大差異，如919J、1226J、1222J、1003J、846J、1089J，它們與秈稻群中其他品種（系）秈粳性的相似系數(shù)也低于0.85。說明在亞群中存在秈（粳）和偏秈（粳）屬性的差異，只有對水稻的秈粳性進(jìn)行量化，才能客觀準(zhǔn)確地評價亞群中水稻的秈（粳）和偏秈（粳）屬性。

2.3 用秈性判別值量化水稻的秈粳性

為構(gòu)建一套高效準(zhǔn)確的秈粳性判別體系，根據(jù)24 對秈粳特異分子標(biāo)記的聚類結(jié)果，按照各品種（系）的相似系數(shù)選擇5 份秈稻（44I、541I、1365I、1400I、9311）和5份粳稻（50J、973J、1226J、1255J、NIP），分別作為秈性判別組（包括典型秈稻和偏秈品系）和粳性判別組（包括典型粳稻和偏粳品系）。隨機選取其他10 份品種（系）（5 份秈稻、5 份粳稻），對其秈性判別值進(jìn)行計算，結(jié)果（表4）顯示其中1 份偏秈品系、1 份偏粳品系、4 份秈稻品系、4 份粳稻品系，高效準(zhǔn)確地實現(xiàn)了對它們秈粳性的量化判別。

表4 檢測品系的秈性度及秈粳屬性Table 4 Indica quality degree and indica-japonica nature of the tested lines

3 討論

3.1 24 對秈粳特異性分子標(biāo)記能準(zhǔn)確區(qū)分水稻的秈粳性

前期已有不少研究利用SSR 和InDel 分子標(biāo)記分析水稻的秈粳性。本研究選取的51 對用于秈粳判別的分子標(biāo)記，在已報道的測驗群體中都具有較高的秈粳識別性［14-24］。我們選用來自世界各地遺傳多樣性豐富的92 份品系，利用分子標(biāo)記進(jìn)行秈粳判別時，發(fā)現(xiàn)一半以上的標(biāo)記判別秈粳性的能力不強，主要表現(xiàn)為多態(tài)性高、容易出現(xiàn)偏態(tài)分布等（圖1）。這可能是由于選材不同，導(dǎo)致判別秈粳性的能力出現(xiàn)差異。但我們也發(fā)現(xiàn)有24 對分子標(biāo)記在多個遺傳背景豐富的群體中，仍然表現(xiàn)較好的秈粳識別性（圖2）?？梢灶A(yù)見，這些標(biāo)記將在水稻秈粳判別中具有普適性，能突破遺傳材料的制約，準(zhǔn)確判別水稻的秈粳性。

在水稻的基因組上，存在一些多態(tài)性很高的位點，這類位點適用于水稻品系分子身份證的構(gòu)建識別。類似地，在水稻的基因組上也存在一些相對保守的變異位點，如在秈稻或粳稻中特異存在的基因組變異。本研究篩選出的24 對分子標(biāo)記，檢測帶型專一，屬于這類變異位點，便于通過電泳檢測，準(zhǔn)確識別秈粳屬性。當(dāng)然，單一位點的判別，不足以代表整個基因組的信息，因此我們挑選的這24 對秈粳識別度高的分子標(biāo)記，均勻地分布在水稻的12 條染色體上，較全面地代表了水稻全基因組的信息，從而更有利于準(zhǔn)確判別水稻的秈粳性。

3.2 秈性判別值可以客觀地評價水稻品系的秈粳性

對水稻品種（系）秈粳屬性的準(zhǔn)確評價，特別是偏秈和偏粳材料的判別在秈粳亞種雜種優(yōu)勢利用中顯得尤其重要。以往研究通常以單個材料為秈型或者粳型對照，無法準(zhǔn)確反映待測品系與秈（粳）亞種的相似性。這就可能造成秈粳性的誤判，特別是無法準(zhǔn)確反映待測品種（系）的偏秈（粳）性。本研究提出通過計算“平均相似系數(shù)”，即某一被測系與各秈型測驗種或粳型測驗種相似系數(shù)的平均值，這能夠反映某被測系與秈亞種或粳亞種間的遺傳相似性。在此基礎(chǔ)上用“秈性判別值”（Di）可以度量某被測系與秈亞種間的相對遺傳相似性。

在進(jìn)行待測品系的秈（粳）判別時，往往選取的參照材料越豐富多樣，越能全面反映秈（粳）稻屬性的客觀情況。但是，如果選取的試材多，顯然會增加檢測時間和成本；而只選取單個的參照材料又無法反映待測品系與秈（粳）亞種的相似性。在本研究中，我們依據(jù)秈粳特異分子標(biāo)記的聚類結(jié)果挑選了5 份秈稻和5 份粳稻組成秈性判別組和粳性判別組，包括典型的秈（粳）稻和偏秈（粳）稻，能較好地代表水稻秈（粳）稻亞種群體內(nèi)的秈（粳）性真實屬性。通過計算待測系與判別組群內(nèi)品系的相似系數(shù)客觀反映待測品系與秈（粳）稻亞種群體的相似性，從而準(zhǔn)確判別待測系的秈粳性。該體系對水稻品種（系），特別是偏秈（粳）水稻品種（系）的秈粳性有更加客觀的評判，有助于提高秈粳亞種雜種優(yōu)勢利用的效率。

4 結(jié)論

本研究以92 份來自世界各地、具有遺傳多樣性的水稻品種（系）為材料，利用已公布的51對秈粳特異分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，篩選出均勻分布在水稻12 條染色體上的24 對能特異地判別秈粳性的分子標(biāo)記，其中有12 對分子標(biāo)記在秈（粳）稻群中出現(xiàn)專一帶型頻率均高于90.0%；根據(jù)這24 對秈粳特異分子標(biāo)記的秈粳性聚類結(jié)果，選取其中10 份品種（系）分別組成秈性（包括典型秈稻和偏秈品系）和粳性（包括典型粳稻和偏粳品系）判別組，然后根據(jù)待測品系與判別組的相似度客觀判定了待測品系的秈粳性。可見，本研究基于秈粳特異分子標(biāo)記建立了一套高效準(zhǔn)確判別水稻秈粳性的體系。