再談乙型肝炎病毒反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)/表面抗原區(qū)基因變異的臨床發(fā)生特點(diǎn)及意義

劉妍，徐東平

我國(guó)有9300萬(wàn)慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者，慢性HBV感染可引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌。當(dāng)前，核苷(酸)類似物(NAs)是臨床最常用的抗HBV藥物，通過直接靶向抑制HBV多聚酶/反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性發(fā)揮抗病毒作用，但因其對(duì)肝細(xì)胞中HBV復(fù)制的原始模板cccDNA沒有直接抑制作用，需要長(zhǎng)期用藥[1-2]。由于HBV復(fù)制過程中HBV的高復(fù)制率和HBV RT缺乏校對(duì)功能，決定了HBV的高變異特性[3-4]，在長(zhǎng)期應(yīng)用NAs后可使對(duì)藥物壓力適應(yīng)性強(qiáng)的變異病毒獲得選擇性擴(kuò)增，從而產(chǎn)生病毒耐藥，導(dǎo)致治療失敗，已成為臨床棘手的問題。

同時(shí)，由于HBV基因組RT區(qū)/表面抗原(HBsAg)S區(qū)基因高度重疊，NAs引起的耐藥變異會(huì)同時(shí)造成S區(qū)基因變異，產(chǎn)生的截短或非截短型HBsAg可能與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]；另一方面，發(fā)生在HBsAg主要親水區(qū)(MHR)的免疫逃逸相關(guān)變異(包括新增N-糖基化變異)常見于HBsAg陰性、HBV DNA陽(yáng)性的隱匿性HBV感染患者以及HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性的HBV感染患者，也均有進(jìn)展為肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[6]。本文將重點(diǎn)針對(duì)真實(shí)臨床實(shí)踐中恩替卡韋耐藥變異的特點(diǎn)和挽救治療策略、HBsAg截短或非截短型rtA181T/sW172變異以及HBsAg MHR區(qū)免疫逃逸相關(guān)變異的臨床檢出和體外表型特點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1 我國(guó)恩替卡韋耐藥HBV的發(fā)生特點(diǎn)與挽救治療策略

1.1 NAs簡(jiǎn)介及耐藥變異類型 抗HBV核苷類藥物包括拉米夫定(lamivudine，LAM)、替比夫定(telbivudine，LdT)和恩替卡韋(entecavir，ETV)，核苷酸類藥物包括阿德福韋酯(adefovir dipivoxil，ADV)和富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)。NAs耐藥的產(chǎn)生和耐藥率的高低除了與HBV的變異特性有關(guān)外，還涉及病毒(耐藥基因屏障、突變對(duì)病毒適應(yīng)力的影響)，藥物(抗病毒效力)和患者(治療依從性、體內(nèi)的藥效動(dòng)力學(xué))等多種因素[7-8]。此外，我國(guó)臨床實(shí)踐中存在NAs不規(guī)范治療現(xiàn)象，如單藥隨意序貫、頻繁換藥或加藥等，也增加了發(fā)生耐藥的可能性[9]。

耐藥基因屏障指的是病毒基因組上能引起病毒對(duì)藥物敏感性下降所需突變的數(shù)目。LAM、ADV和LdT是低耐藥基因屏障藥物，只需1個(gè)基因突變即可產(chǎn)生耐藥。研究顯示，最早被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的LAM耐藥發(fā)生率最高(5年耐藥率高達(dá)60%～70%)，經(jīng)典耐藥變異形式為YMDD變異(rtM204I/V)；ADV的5年耐藥率為42%(HBeAg陽(yáng)性患者)或29%(HBeAg陰性患者)，rtN236T和(或)rtA181V替換是公認(rèn)的ADV耐藥變異位點(diǎn)；LdT與LAM相似且交叉耐藥，2年耐藥率為25%(HBeAg陽(yáng)性患者)或11%(HBeAg陰性患者)，主要耐藥位點(diǎn)為rtM204I[10]。

與LAM、ADV和LdT相比，ETV和TDF具有更高的耐藥基因屏障，是美國(guó)肝病學(xué)會(huì)、歐洲肝病學(xué)會(huì)和亞太肝病學(xué)會(huì)指南共同推薦的治療慢性乙型肝炎的一線藥物[1]。ETV是在TDF上市之前抗病毒作用最強(qiáng)的高耐藥基因屏障藥物，除了預(yù)先存在的LAM耐藥位點(diǎn)rtM204V/I，還需要同時(shí)出現(xiàn)rtT184、rtS202或rtM250任意位點(diǎn)變異。在NAs初治患者中ETV長(zhǎng)期單藥治療耐藥發(fā)生率較低(6年累積耐藥率僅1.2%)，但由于與LAM有部分交叉耐藥，當(dāng)針對(duì)LAM耐藥患者進(jìn)行挽救治療時(shí)，即患者在ETV治療前已有LAM耐藥位點(diǎn)變異背景時(shí)，耐藥發(fā)生率明顯增高(6年累積耐藥率接近60%)[11]。TDF作為最晚(2014年)在我國(guó)臨床上市的強(qiáng)效高耐藥基因屏障抗HBV藥物，患者病毒學(xué)應(yīng)答率良好，8年隨訪研究暫未發(fā)現(xiàn)TDF相關(guān)耐藥[12]。

上述變異可直接引起病毒對(duì)藥物的敏感性降低，稱為原發(fā)耐藥變異(primary resistance mutations)。有一些變異不直接引起病毒對(duì)藥物的敏感性下降，但可以恢復(fù)原發(fā)耐藥變異病毒受損的復(fù)制力，被稱為補(bǔ)償耐藥變異(compensatory resistance mutations)，主要有rtV173L、rtL180M(常與rtM204V共同出現(xiàn))和rtL80I(常與rtM204I共同出現(xiàn))[10]。

1.2 我國(guó)臨床ETV耐藥特點(diǎn) 由于存在共同的交叉耐藥位點(diǎn)，ETV耐藥病毒對(duì)其他核苷類藥物(LAM、LdT及恩曲他濱)均耐藥。在ETV耐藥基礎(chǔ)上，還有可能進(jìn)一步出現(xiàn)對(duì)核苷類藥物和核苷酸類藥物均耐藥的多重耐藥病毒[13]。由于歷史和經(jīng)濟(jì)原因，我國(guó)臨床已經(jīng)累積了相當(dāng)數(shù)量的LAM耐藥患者，這些LAM經(jīng)治患者在換用ETV挽救治療后很容易產(chǎn)生ETV耐藥。本課題組前期通過臨床大樣本測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在26 553例NAs經(jīng)治并接受耐藥檢測(cè)的慢性HBV感染患者中，共1565例檢出ETV耐藥變異，且臨床ETV耐藥患者呈逐年遞增趨勢(shì)，8年(2007－2015)檢出率依次為1.91%、2.23%、3.54%、3.96%、4.77%、6.79%、7.72%和8.12%。分析發(fā)現(xiàn)，在LAM耐藥基礎(chǔ)上的rt184、rt202、rt250單個(gè)位點(diǎn)變異以及rt184/rt202/rt250中雙位點(diǎn)變異檢出率分別為47.9%、31.4%、12.3%和8.4%；分別有81% (1270/1565)、16%(245/1565)和3%(50/1565)的患者檢出基于rtM204V、rtM204I和rtM204V/I的ETV耐藥變異。與相應(yīng)野生株比較，各種ETV耐藥病毒株的復(fù)制力呈不同程度降低，其中，基于rtM204V的ETV耐藥變異毒株比基于rtM204I的毒株體外復(fù)制力更高但對(duì)ETV耐藥性更強(qiáng)[14]。

隨著臨床上ETV耐藥患者逐年增加，耐藥變異形式也復(fù)雜多樣，除了經(jīng)典的耐藥變異形式，HBV RT區(qū)出現(xiàn)的新ETV耐藥變異也越來越受到關(guān)注。有學(xué)者在1例ETV難治性患者體內(nèi)分離鑒定出新的ETV耐藥變異rtI163V和rtA186T，體外復(fù)制力和耐藥表型分析顯示，含rtA186T+rtM204V/I的變異株具有顯著的ETV耐藥性(比野生株增加111倍)，而含rtI163V+rtM204V/I的變異株ETV耐藥性中等程度增高(比野生株增加20倍)且有助于增加病毒的適應(yīng)性[15]。另有學(xué)者在1例多種NAs序貫治療失敗的患者血清中分離出新的ETV耐藥變異rtS219A和rtY245H[16]。這些新型耐藥位點(diǎn)僅出現(xiàn)在某一患者體內(nèi)，還缺乏大樣本臨床數(shù)據(jù)證實(shí)。本課題組通過大樣本臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)合基因型和表型實(shí)驗(yàn)，在ETV用藥期間發(fā)生病毒學(xué)突破的患者中檢出了rtL180M+A181C+M204V變異，該變異株對(duì)ETV的敏感性顯著降低，而復(fù)制力與野生株相似；在rtL180M+A181C+M204V基礎(chǔ)上增加經(jīng)典ETV耐藥變異rtM250V或rtS202G可增加ETV耐藥倍數(shù)(分別為356.1倍和307.1倍)，同時(shí)進(jìn)一步降低復(fù)制力[17]。

1.3 ETV耐藥患者的挽救治療策略 如何進(jìn)行ETV耐藥HBV感染患者的優(yōu)化治療是近年臨床研究的主要問題。在TDF于我國(guó)上市(2014年)之前的相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)ETV耐藥患者的挽救治療以加用ADV為主，而2015新版指南推薦ETV耐藥患者加用ADV或換用TDF繼續(xù)挽救治療[18]。多項(xiàng)研究顯示，ADV+ETV對(duì)ETV耐藥患者具有良好的抗病毒效果，但也有相當(dāng)比例的患者在ADV+ETV挽救治療期間應(yīng)答不佳(治療6、12、24和36個(gè)月后完全病毒學(xué)應(yīng)答率分別為35%、43%、65%和76%)[19-21]。

雖然TDF對(duì)NAs初治患者的8年治療尚未鑒定到公認(rèn)的病毒耐藥突變[12]，有研究認(rèn)為TDF治療的ETV耐藥患者完全病毒學(xué)應(yīng)答率最高，而對(duì)于那些無(wú)法選擇TDF治療的患者，ADV+ETV仍是更加經(jīng)濟(jì)有效的挽救治療方案[22]。一項(xiàng)針對(duì)90例ETV耐藥患者的TDF單一或TDF+ETV聯(lián)合治療48周的病毒學(xué)應(yīng)答率研究結(jié)果并不十分理想(71% vs. 73%)，且對(duì)長(zhǎng)期治療依從性差的患者停藥后仍無(wú)法避免病毒學(xué)突破的發(fā)生[23]。新近也有研究相繼報(bào)道TDF單一或TDF+ETV聯(lián)合治療ETV耐藥患者，長(zhǎng)期治療后出現(xiàn)病毒學(xué)突破甚至檢出新的潛在TDF耐藥突變r(jià)tS78T/sC69*，后者能增加病毒復(fù)制力并可導(dǎo)致患者對(duì)TDF+ETV治療應(yīng)答不佳[24]。

目前對(duì)引起ADV+ETV聯(lián)合挽救治療應(yīng)答不佳的機(jī)制尚未完全明確，且缺少病毒耐藥株演變對(duì)療效影響的研究數(shù)據(jù)。本課題組結(jié)合臨床隨訪資料、動(dòng)態(tài)樣本克隆測(cè)序和代表性變異株的表型特性分析，考慮ADV+ETV對(duì)ETV耐藥患者療效不佳除了與ADV對(duì)ETV耐藥突變株抑制率低有關(guān)，還與挽救治療期間新產(chǎn)生的多重耐藥突變株有關(guān)，即使經(jīng)臨床挽救治療后檢測(cè)不到血清HBV DNA，仍可有低水平的病毒復(fù)制，提示需要進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)下的長(zhǎng)期抗病毒治療[25-26]。

2 HBV rtA181T/sW172截短和非截短HBsAg特點(diǎn)及對(duì)HBV耐藥的影響

HBV基因組結(jié)構(gòu)緊湊、高度重疊，發(fā)生在RT基因的耐藥變異可造成對(duì)應(yīng)的S基因序列發(fā)生改變[5]，某些核苷酸變異會(huì)產(chǎn)生終止密碼子，形成C端疏水區(qū)大段缺失的截短型HBsAg。最常報(bào)道的帶有C端截短的耐藥變異有rtA181T/sW172*、rtM204I/sW196*和rtV191I/sW182*，并均具有致肝癌發(fā)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)。這些變異大多在LAM或ADV用藥期間產(chǎn)生，單獨(dú)或與其他經(jīng)典耐藥變異共同出現(xiàn)，可能是一種交通耐藥位點(diǎn)，可輕微降低HBV對(duì)ADV的敏感性。其中rtA181T變異引起的S基因172位點(diǎn)變異包括截短型HBsAg(rtA181T/sW172*，TGGCT→TGACT)及非截短型HBsAg rtA181T/sW172non-stop(rtA181T/sW172L，TGGCT→TTACT及rtA181T/sW172S，TGGCT→TCACT)，前者rtA181T變異導(dǎo)致HBsAg缺失C端55個(gè)氨基酸而提前終止并積聚于細(xì)胞，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力增加致肝細(xì)胞癌變潛能[27]。

本課題組通過臨床大樣本數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，5.37%(1182/22 009)的慢性HBV感染患者可檢出rtA181T變異，同時(shí)在重疊S區(qū)172位點(diǎn)的變異為截短型(Stop)和非截短型(含L與S兩種形式)兩種，其中rtA181T/sW172non-stop(sW172L/S)、rtA181T/sW172*/non-stop和rtA181T/sW172*的發(fā)生率分別為7.70%、9.39%和82.91%，且rtA181T/sW172non-stop型變異呈逐年遞增趨勢(shì)，rtA181T/sW172non-stop變異可增加病毒復(fù)制水平，尤其是當(dāng)存在ADV或ETV耐藥變異株時(shí)可顯著降低病毒株對(duì)ADV或ETV的敏感性[28-29]。

3 HBsAg主要親水區(qū)(MHR)的免疫逃逸相關(guān)變異特點(diǎn)及臨床意義

HBsAg主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR)位于aa99–169，是刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體的重要抗原表位，其所包含的“a”決定簇(aa121–147)是中和抗體作用的主要靶區(qū)域，對(duì)HBsAg抗原性具有重要意義。HBV S基因尤其MHR區(qū)發(fā)生變異，可使HBsAg與中和抗體的結(jié)合力降低，引起免疫逃逸。發(fā)生在MHR區(qū)的免疫逃逸相關(guān)變異(包括新增N-糖基化變異)多見于HBsAg陰性、HBV DNA陽(yáng)性的隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)患者以及HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性的HBV感染患者，且均有進(jìn)展為肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[30]。

3.1 OBI患者HBV S基因MHR區(qū)免疫逃逸相關(guān)變異特點(diǎn) OBI與HBV漏診、輸血傳播、乙肝再激活等密切相關(guān)，最經(jīng)典的免疫逃逸變異為sG145R[31]。HBV S基因突變引起OBI的可能機(jī)制主要是S基因變異導(dǎo)致HBsAg表達(dá)分泌及抗原性改變，變異的HBsAg可逃避商業(yè)化診斷試劑檢測(cè)，因此容易造成OBI漏診及傳播。本課題組從我國(guó)西北寶雞地區(qū)110 843例獻(xiàn)血者樣本中確定了60例OBI患者，并證實(shí)HBV S基因MHR區(qū)內(nèi)的5個(gè)免疫逃逸變異(sS117T、sT118K、sT131N、sT134Y/L和sD144E)與OBI的發(fā)生密切相關(guān)[32]。進(jìn)一步對(duì)11 650例就診于302醫(yī)院的肝病患者進(jìn)行臨床資料和基因測(cè)序分析，結(jié)果顯示OBI的檢出率為0.172%(12/6 996)，共檢出包括經(jīng)典sG145R在內(nèi)的9種變異，均為已報(bào)道的OBI相關(guān)MHR變異[33]。深入分析9種(其中5種為本課題組首次發(fā)現(xiàn))代表性的OBI相關(guān)MHR變異的病毒學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)各種變異HBsAg的抗原性降低是影響HBsAg被檢出的主要因素。此外，新形成的NXT/S(X為P以外的任何aa殘基)結(jié)構(gòu)可能會(huì)引入N-糖基化變異，MHR新增N-糖基化變異也可削弱HBsAg的抗原性，增強(qiáng)HBV病毒顆粒分泌，是引起OBI發(fā)生的原因之一[34-36]。

3.2 HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性患者HBV S基因MHR區(qū)免疫逃逸相關(guān)變異特點(diǎn) HBV血清學(xué)標(biāo)志物5項(xiàng)(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb以及HBcAb)是臨床應(yīng)用最為廣泛的HBV感染檢測(cè)與篩查指標(biāo)。通常認(rèn)為HBV感染者血清中HBsAg轉(zhuǎn)陰和出現(xiàn)HBsAb是病毒受到機(jī)體免疫控制的標(biāo)志，但臨床實(shí)踐中，有少數(shù)慢性HBV感染者血清中可同時(shí)檢測(cè)到HBsAg和HBsAb，即HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性，有研究發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)性患者5年、10年、15年的累計(jì)HCC發(fā)生率顯著高于單陽(yáng)性患者(12.7%、23.4%、69.4% vs. 4.9%、13.0%、20.6%)，提示HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性可能與乙型肝炎的疾病嚴(yán)重程度，尤其HCC的發(fā)生相關(guān)[37]。

本課題組對(duì)778例慢性HBV感染患者的樣本進(jìn)行了S基因測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)性患者的MHR區(qū)新增N-糖基化變異檢出率顯著高于單陽(yáng)性患者，有多例發(fā)生N-糖基化變異的雙陽(yáng)性慢性乙肝或肝硬化患者在40個(gè)月內(nèi)進(jìn)展為HCC，提示MHR N-糖基化變異可能增加了HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性患者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)[38-40]。此外，已經(jīng)進(jìn)展至肝硬化的乙型肝炎患者中，HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性患者M(jìn)HR內(nèi)總體免疫逃逸相關(guān)變異檢出率、多位點(diǎn)聯(lián)合變異檢出率，以及免疫逃逸相關(guān)的MHR新增N-糖基化位點(diǎn)變異檢出率均顯著增高于HBsAg單陽(yáng)性患者[41]。

已知HBsAg MHR的正常糖基化(s146–148為1個(gè)N-糖基化位點(diǎn))可幫助蛋白空間構(gòu)象正確折疊，增加蛋白的穩(wěn)定性和親水性，維持蛋白抗原性，但如果S基因在該區(qū)域變異引入新增N-糖基化位點(diǎn)，則可引起MHR過度糖基化而影響蛋白構(gòu)象，掩蓋表面抗原，是病毒逃逸免疫應(yīng)答的重要機(jī)制之一。有學(xué)者研究了216例雙陽(yáng)性患者和182例單陽(yáng)性患者，發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)性患者中有47例檢出S基因MHR N-糖基化變異，這一比例顯著高于單陽(yáng)性患者(47/216，21.8% vs. 1/182，0.5%，P＜0.001)，體外實(shí)驗(yàn)顯示，S基因MHR N-糖基化變異可減弱HBsAg抗原性，是HBsAg/HBsAb共存的原因之一[42]。

4 小 結(jié)

如何更好地應(yīng)用現(xiàn)有抗HBV藥物進(jìn)行抗病毒治療，減少和避免耐藥病毒產(chǎn)生，最大限度地抑制病毒復(fù)制，從而阻止或延緩肝病進(jìn)展一直是臨床研究的熱點(diǎn)。在關(guān)注HBV 耐藥變異的同時(shí)也要重視S蛋白截短和非截短型變異及其對(duì)耐藥性的影響，同時(shí)還要重視OBI患者和HBsAg/HBsHb雙陽(yáng)性患者中HBsAg免疫逃逸相關(guān)變異和新增N-糖基化變異，定期監(jiān)測(cè)HCC的發(fā)生。

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