棉鈴紅粉病鑒定及氣候條件對(duì)病菌生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

焦瑞蓮，任毓忠，李志強(qiáng)，董海濤，武剛，張莉，李國(guó)英,

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003； 2.石河子開發(fā)區(qū)石大惠農(nóng)科技開發(fā)有限公司，新疆石河子 832003； 3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師農(nóng)科所，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】棉鈴病害是棉花上的一類重要病害，棉花紅粉病是棉鈴病害中分布較廣的鈴病之一，世界各棉區(qū)都有發(fā)生，在我國(guó)各棉區(qū)也有分布。以往在新疆棉區(qū)發(fā)生很輕，但近年來(lái)發(fā)生有加重之勢(shì)，并常和其它鈴病混合發(fā)生。研究紅粉病的病原及其氣候條件對(duì)病菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和分生孢子萌發(fā)的影響，對(duì)該病的防治具有重要的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉鈴紅粉病是由粉紅聚端孢菌Trichotheciumroseum引起，該菌為腐生或弱寄生菌，可引起果蔬紅粉病，如：蘋果、厚皮甜瓜、葡萄、棗果、穗醋栗、西紅柿、菜豆等；還可引起黃麻、棉鈴等至少15種植物紅粉病害。Richard等[1]研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的粉紅聚端孢的毒性產(chǎn)物可致老鼠、家兔和幼豬死亡，同時(shí)，若將毒性產(chǎn)物注射到動(dòng)物真皮時(shí)，可造成動(dòng)物真皮壞死。該菌于1809年在德國(guó)柏林首次被Link發(fā)現(xiàn)，1902年Eustace在紐約蘋果上發(fā)現(xiàn)紅粉病，隨后在世界各地不斷出現(xiàn)該病害報(bào)道。如Shamsi等[2](2008)在孟加拉發(fā)現(xiàn)黃麻紅粉病害；Yun等[3](2013)在韓國(guó)發(fā)現(xiàn)番茄紅粉??；Hamid等[4](2014)在巴基斯坦發(fā)現(xiàn)T.roseum可導(dǎo)致番茄、橙子和蘋果果腐等。在國(guó)內(nèi)，戚佩坤(1966年)等報(bào)道了黃瓜紅粉?。徽聭?zhàn)華[5](2007)對(duì)棉花、葡萄、蘋果、甜瓜、香梨、油菜、茄子、草莓上的紅粉病菌進(jìn)行了研究；王勇等[6](2008)報(bào)道了番茄上紅粉病；潘月敏等[7,8](2005)和黎鴻慧等(2011)報(bào)道了棉花紅粉病，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可使棉花減產(chǎn)10%。馮中紅等[9](2015)報(bào)道了菜豆紅粉病；楊濟(jì)徽等(2016)[10]報(bào)道了龍眼紅粉病；均由T.roseum引起。但對(duì)氣候條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子發(fā)芽的影響缺乏研究。另外，從近期報(bào)道的資料來(lái)看，對(duì)其學(xué)名多用Trichotheciumroseum，但有的書中用Cephalotheciumroseum，有的甚至把它們作為為害棉鈴的兩種菌[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)前人研究的結(jié)果和新疆對(duì)其缺乏研究的實(shí)際情況，有必要對(duì)新疆棉鈴紅粉病進(jìn)行較為系統(tǒng)的鑒定。研究結(jié)合氣象因子對(duì)病菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究新疆棉花紅粉病的病原，明確氣象因子與病菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的關(guān)系。分析新疆棉鈴紅粉病菌的病原及其生物學(xué)特性，為制定有效的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2017年分別于8和9月，對(duì)北疆石河子棉區(qū)150團(tuán)4連和9連、147團(tuán)19連、142團(tuán)23連、133團(tuán)20連，以及南疆阿克蘇棉區(qū)12團(tuán)、阿瓦提縣、塔河種業(yè)等地一些棉田的棉鈴紅粉病害進(jìn)行調(diào)查。共采集典型癥狀的病樣19份，供分離鑒定，對(duì)田間癥狀和接種后的癥狀進(jìn)行觀察、描述和拍照。

1.2 方 法

1.2.1 病菌的分離、純化及代表性菌株的選擇

在分離前將所要分離的病鈴流水沖12 h，取下，晾干表面水分。用解剖刀切取5 mm×5 mm的病斑，分別在70%酒精中15s和0.1%升汞中停留2～5s、無(wú)菌水沖洗3次、置于吸水紙上將水分吸干后，在無(wú)菌條件下移植于PDA平板上，將平板置于28℃培養(yǎng)箱中。1～2 d待長(zhǎng)出菌落，挑取邊緣菌絲于新的PDA培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)。共分離出96個(gè)菌株，待培養(yǎng)3～4 d左右根據(jù)形態(tài)特征選出16個(gè)代表性菌株進(jìn)行單孢分離純化。表1

1.2.2 病原鑒定1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將單孢分離的16個(gè)代表性菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，觀察菌落顏色和形態(tài)，并鏡檢其分生孢子形態(tài)及顏色；測(cè)量孢子大小。采用玻片培養(yǎng)法，25℃下，培養(yǎng)6 d，觀察分生孢子梗的形態(tài)及分生孢子在分孢梗頂端的著生狀態(tài)。并拍照，作為病原鑒定的主要形態(tài)學(xué)依據(jù)。用測(cè)微尺測(cè)量50個(gè)孢子和孢子梗的大小。

表1 菌株編號(hào)及來(lái)源

Table 1 The strain ideutifiers and sources origin

編號(hào)Identifier采樣地點(diǎn)Origin棉花品種Cotton variety采集時(shí)間Collecting time1150團(tuán)4連紅州1022017.8.232150團(tuán)4連新陸早61號(hào)2017.8.233150團(tuán)9連新陸早62號(hào)2017.8.234147團(tuán)19連新陸早72號(hào)2017.8.235147團(tuán)19連79號(hào)品系2017.8.236147團(tuán)19連新陸早72號(hào)2017.8.237147團(tuán)19連新陸早62號(hào)2017.8.238142團(tuán)23連新陸早64號(hào)2017.8.229142團(tuán)23連石惠13號(hào)2017.8.2210133團(tuán)20連SH-9品系2017.8.2011133團(tuán)20連新陸早50號(hào)2017.8.2012133團(tuán)20連新陸早50號(hào)2017.8.2013阿克蘇地區(qū)塔河種業(yè)新陸中37號(hào)2017.9.2114阿克蘇地區(qū)阿瓦提縣新陸中37號(hào)2017.9.1715阿克蘇地區(qū)阿瓦提縣新陸中37號(hào)2017.9.1716阿克蘇地區(qū)12團(tuán)J206-52017.9.24

1.2.2.2 分子生物學(xué)

將供試的16個(gè)單孢菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，用刀片刮取菌絲體，用Bio Flux試劑盒提取供試菌株的基因組DNA。將提取的DNA置于-20℃冰箱中保存，備用。以提取的菌株基因組DNA為模板，用真核生物rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，后用回收試劑盒回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物(DNA回收試劑盒)?；厥债a(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，篩選出具有代表性的陽(yáng)性克隆，送上海生工(Sangon Biotech)公司測(cè)序。將所測(cè)得的序列利用Gen Bank BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，并在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他相關(guān)病菌的ITS區(qū)序列，用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行序列的比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株間的親緣關(guān)系。

1.2.2.3 致病性鑒定

分別采用菌絲塊接種和噴霧接種兩種方法進(jìn)行。

菌絲塊接種：在棉田隨機(jī)選取健康、大小均勻的棉鈴，用70%酒精擦拭后再用無(wú)菌水沖洗3次，供接種用。分有傷和無(wú)傷接種于準(zhǔn)備好的棉鈴上，每菌株接種3個(gè)棉鈴，并取不接種棉鈴作為對(duì)照，將其置于保濕缸中室溫下觀察，并記錄其發(fā)病情況和癥狀表現(xiàn)，7 d后結(jié)束并拍照。

孢子懸浮液接種：按常規(guī)方法配置孢子懸浮液(1×106cfu/mL)，裝入小型噴霧器內(nèi)，分別在室內(nèi)和田間進(jìn)行噴霧接種，室內(nèi)接種條件同菌絲塊接種，田間接種為自然條件下田間棉株上的棉鈴，均以不接種棉鈴為對(duì)照，觀察并記錄其發(fā)病情況及癥狀，7 d后結(jié)束并拍照。同時(shí)對(duì)發(fā)病株進(jìn)行再分離，觀察再分離菌株與接種菌株的異同。

1.2.3 氣候條件對(duì)供試菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量影響1.2.3.1 溫度

按1.2.2.3的方法制取菌餅，將其移植到PDA培養(yǎng)基平板中央，分別在5、10、15、20、 25、30、35和40℃ 8個(gè)梯度的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，3次重復(fù)，并分別于24、48、72、96、120、144和168 h測(cè)量菌落直徑，共測(cè)量7 d。在第7 d用打孔器打取7 mm的菌餅，并按每毫升無(wú)菌水3個(gè)菌餅的量置于2 mL離心管中，充分震蕩，洗下分生孢子。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)量分生孢子量，觀察溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響。

1.2.3.2 光照

將上述供試菌株菌餅分別移植于PDA培養(yǎng)基上，設(shè)置完全光照、12 h光暗交替和完全黑暗3個(gè)處理，在 25℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每組3次重復(fù)，并分別于24、48、72、96、120、144和168 h測(cè)量菌落直徑，分生孢子量的計(jì)算方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

用挑針挑取培養(yǎng)7 d的菌落邊緣分生孢子于凹形載玻片上，將載玻片置于相對(duì)濕度為100%的培養(yǎng)盒中，并將培養(yǎng)盒分別置于5、10、15、20、25、30、35和40℃的人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)，每種溫度均三次重復(fù)。每12 h隨機(jī)觀察1次各供試溫度中100個(gè)分生孢子的萌發(fā)情況，48 h結(jié)束，共觀察4次。用SPSS 8.0分析溫度對(duì)孢子萌發(fā)的顯著性。

1.2.3.4 光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響

用挑針挑取培養(yǎng)7 d的菌落邊緣分生孢子于凹形載玻片上，將載玻片置于相對(duì)濕度為100%的培養(yǎng)盒中，之后將培養(yǎng)盒分別放于完全光照、完全黑暗和光暗交替的25℃人工氣候箱中。每12 h隨機(jī)觀察100個(gè)分生孢子萌發(fā)情況，48 h結(jié)束，共觀察4次。用SPSS 8.0分析光照對(duì)孢子萌發(fā)的顯著性。

1.2.3.5 濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

用挑針挑取培養(yǎng)7 d的菌落邊緣分生孢子于凹形載玻片上，并將載玻片置于40%、60%、80%、100%四個(gè)相對(duì)濕度梯度的培養(yǎng)盒中；同時(shí)挑取分生孢子于無(wú)菌水中，蓋上蓋玻片置于培養(yǎng)盒中作為對(duì)照，重復(fù)3次。培養(yǎng)盒均置于25℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)，每12 h隨機(jī)觀察100個(gè)分生孢子萌發(fā)情況，48 h結(jié)束，共觀察4次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 8.0分析濕度對(duì)孢子萌發(fā)的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花紅粉病發(fā)病情況的調(diào)查和致病性測(cè)定

研究表明，棉鈴紅粉病危害的棉鈴一般表現(xiàn)為，初期在棉鈴鈴殼或棉鈴縫隙處形成褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大成圓形或近圓形，黑褐色病斑，濕度較大時(shí)，病斑處初生白色(菌絲體)，后呈粉紅色、厚且緊密的霉層。嚴(yán)重時(shí)霉層可局部或全部布滿鈴面。使棉鈴不能正常吐絮、甚至形成僵鈴、僵瓣，且僵瓣上也會(huì)分布有粉紅色霉層、使纖維變?yōu)榉奂t色或淺褐色(圖1-A：a、b、c)。

致病性測(cè)定表明，菌絲塊接種后無(wú)論有傷接種還是無(wú)傷接種都可使棉鈴發(fā)病，但有傷接種比無(wú)傷接種發(fā)病早，病情也較重。接種48 h后在棉鈴接種處出現(xiàn)褐色小點(diǎn)，后褐色區(qū)域逐漸擴(kuò)大呈圓形或近圓形、下陷的黑褐色病斑，濕度大時(shí)在病斑中心長(zhǎng)出白色粉狀物，隨著病斑的擴(kuò)大，霉層擴(kuò)增，顏色加深，呈粉白色或粉紅色(圖1-B：b、c)。用孢子懸浮液進(jìn)行室內(nèi)離體棉鈴噴霧接種16 h后，棉鈴表面出現(xiàn)水浸狀褐色小點(diǎn)，后不斷擴(kuò)大成黑褐色斑點(diǎn)；若田間接種，發(fā)病較遲，第4 d出現(xiàn)水浸狀褐色小點(diǎn)；而室內(nèi)、田間沒(méi)接種對(duì)照棉鈴均不發(fā)病。將接種后的病鈴進(jìn)行再分離， 得到與接種菌株形態(tài)相同的病原物。圖1

注：A田間癥狀：a、b田間病鈴癥狀；c棉纖維感染癥狀；B人工接種癥狀：a噴霧接種癥狀；b菌絲塊接種癥狀； c后期癥狀

Note: A field symptoms：a, b: cotton boll symptom in field; c: symptoms of cotton fiber infection; B artificial inoculation symptom：a: spray inoculation symptom; b: symptoms of hyphae block Inoculation; c: the late symptoms

圖1 棉鈴紅粉病田間與接種癥狀

Fig.1 Field and inoculation symptoms of cotton boll red powder disease

2.2 棉花紅粉病菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將單孢分離純化的16個(gè)菌株移植到PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第1 d長(zhǎng)出淺白色氣生菌絲；第2 d出現(xiàn)少量分生孢子，菌落邊緣呈淺白色；第3 d，由于菌落上產(chǎn)生大量分生孢子，菌落開始呈現(xiàn)粉紅色；后菌落邊緣呈不規(guī)則齒狀或波狀，有的具明顯的同心輪紋，菌落正面為粉紅色，背面為粉黃色，邊緣淺白色(圖2-A、B)。由小室培養(yǎng)進(jìn)行鏡檢，分生孢子梗直立不分枝，具幾個(gè)隔膜，長(zhǎng)50～200 μm，平均132.75 μm。分生孢子單生或聚生于分生孢子梗頂端，無(wú)色，聚集時(shí)呈粉色，梨形或卵圓形，雙孢，中間隔膜處稍溢縮，孢基有一偏向乳頭狀突起，大小為(12.5～22.5)μm×(5～12.5)μm，平均大小為16.7μm×8.8 μm(圖2-C、D)。孢子萌發(fā)時(shí)芽管可從分生孢子基部、頂部、側(cè)面等部位萌發(fā)，可一端或兩端同時(shí)萌發(fā)，芽管分支或不分支(圖2-E)。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定該病病原為粉紅聚端孢菌(Trichotheciumroseum)。圖2

注：A、B菌落形態(tài)；C分生孢子梗；D分生孢子；E 孢子萌發(fā)

Note : A/B Colony morphology；C Conidiophores；D Conidia；E Spore germination

圖2 棉鈴病原菌形態(tài)特征

Fig.2 Morphological characteristics of cotton boll pathogenic fungus

2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

提取16個(gè)供試菌株DNA，利用rDNA-ITS區(qū)引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為611～613 bp，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收DNA，將回收的DNA做連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性單克隆菌斑進(jìn)行培養(yǎng)，后送上海生工生物公司測(cè)序。對(duì)所測(cè)得的序列在NCBI Blast 中進(jìn)行同源比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明，1、3～10、13～16菌株與T.roseum(KP317992.1) 相似性為100%；2、11與T.roseum(JQ898156.1)的相似性為100%，而12與T.roseum(JQ898156.1) 的相似性達(dá)到98%。圖3

通過(guò)使用DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，其中15個(gè)供試菌株與T.roseum都?xì)w在同一分支，只有12不在T.roseum的分支上，但與聚端孢屬(Trichothecium.spp)的其他種如T.ovalisporum)及F.solani不在同一分支上。在對(duì)12號(hào)菌株的菌落形態(tài)、分生孢子、分生孢子梗分析中發(fā)現(xiàn)其與其他15個(gè)菌株基本相似；且在NCBI Blast同源比對(duì)中與T.roseum(JQ898156.1)的相似性為98%。結(jié)合各菌株的形態(tài)學(xué)特征和NCBI Blast同源比對(duì)結(jié)果，初步認(rèn)為供試菌株都為T.roseum。圖4

注:M 標(biāo)準(zhǔn)DL 2000 bp；C陰性對(duì)照；H1-H16供測(cè)菌株

Note: M Molecular size marker DL,2000 bp，C Negative control；H1-H16 Test strain

圖3 供測(cè)菌株rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增

Fig.3 PCR amplification in the rDNA- ITS region of the test strain

圖4 供試菌株與相似種的ITS序列發(fā)育樹

Fig.4 ITS sequence Phylogenetic tree of the pathogen and similar species

2.4 氣候條件對(duì)病菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

2.4.1溫度條件對(duì)病菌生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

研究表明，溫度對(duì)T.roseum的菌落生長(zhǎng)有顯著的影響，該菌在5和40℃不生長(zhǎng)，10和35℃生長(zhǎng)極其緩慢，其生長(zhǎng)的最適溫度是25℃左右。10和35℃菌落均小于2.5 cm。對(duì)生長(zhǎng)168 h菌落上的分生孢子進(jìn)行產(chǎn)孢量檢測(cè)，以25℃條件下生長(zhǎng)的菌落的分生孢子量最多，達(dá)到了8.65×106cfu/mL，其次是在20℃時(shí)的分生孢子量，而15和30℃的分生孢子量明顯減少，分別為1.75×106cfu/mL和1.9×106cfu/mL；10℃以下和35℃以上不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢極少。表2，圖5

表2 不同溫度條件下棉鈴紅粉病菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量變化

Table 2 Effects of different temperatures on colony growth and sporulation capacity of cotton boll pathogenic fungus

溫度Temperature(℃)菌落直徑 Colony diameter (cm)24 h48 h72 h96 h120 h144 h168 h產(chǎn)孢量Sporulation capacity(cfu/mL)50.000.000.000.000.000.000.000.00100.000.000.100.200.420.731.000.00150.000.150.721.432.072.833.451 750 000200.080.771.832.984.235.176.473 175 000250.431.432.633.725.036.387.058 650 000300.271.031.872.583.524.084.501 900 000350.000.030.190.320.470.580.620.00400.000.000.000.000.000.000.000.00

圖5 不同溫度下棉鈴紅粉病菌的菌落形態(tài)

Fig.5 Colony morphology of cotton boll pathogenic fungus at different temperatures

2.4.2 光照條件對(duì)菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

研究表明，在三種光照處理?xiàng)l件下，對(duì)T.roseum的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的差異，但是對(duì)產(chǎn)孢量的影響很大，其中以完全光照產(chǎn)孢量最少，為1.85×106cfu/mL；完全黑暗產(chǎn)孢量最大，為8.93×106cfu/mL；光暗交替處于兩者之間，其產(chǎn)孢量為5.63×106cfu/mL。光線對(duì)產(chǎn)孢有明顯的抑制作用。不同光照條件對(duì)菌落的形態(tài)特征也有明顯影響，完全光照和完全黑暗所長(zhǎng)出的菌落不產(chǎn)生輪紋；而光暗交替條件下所長(zhǎng)出的菌落，由于光暗條件產(chǎn)孢量的明顯不同，則產(chǎn)生明顯的輪紋。表3，圖6

表3 不同光照條件下棉鈴紅粉病菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量變化

Table 3 Effects of different illumination on colony growth and sporulation capacity of cotton boll pathogenic fungus

光照Light菌落直徑 Colony diameter (cm)24 h48 h72 h96 h120 h144 h168 h產(chǎn)孢量Sporulation capacity(cfu/ml)完全光照Light0.451.723.074.335.556.677.451 850 000完全黑暗Darkness0.631.983.384.756.127.087.808 925 000光暗交替Light dark alternation0.651.732.923.985.176.157.225 625 000

圖6 不同光照條件下菌落形態(tài)

Fig.6 Colony morphology under different light conditions

2.4.3 溫度條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

不同溫度對(duì)T.roseum的分生孢子萌發(fā)具有顯著影響。試驗(yàn)表明，小于5℃和大于40℃時(shí)該菌的分生孢子不能萌發(fā)；在10～35℃孢子都可萌發(fā)，其萌發(fā)的最適溫度為20～25℃，48 h時(shí)其萌發(fā)率為94%～97.67%，15℃以下和35℃以上萌發(fā)率明顯下降。表4

表4 不同溫度條件下棉鈴紅粉病菌孢子萌發(fā)變化

Table 4 Effect of temperature on spore germination of cotton boll pathogenic fungus

溫度Temperatur(℃)萌發(fā)率 Germination rate (%)12 h24 h36 h48 h5℃0b0d0f0f100b0d0f9e150b13.0c35.5d42.0c2023.7a63.7a86.3b94.0a2525.7a68.7a93.0a97.7a3024.7a47.3b76.3c87.7b350b3.0d7.0e25.0d400b0d0f0f

注：數(shù)據(jù)后小寫英文字母為0.05水平顯著性差異

Note: little letters after date indicate at 0.05 levels

2.4.4 光照條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

研究證明，在供試三種條件下T.roseum的孢子均可萌發(fā)，且萌發(fā)率都較高。在光暗交替和完全黑暗條件下，孢子萌發(fā)率均可達(dá)到93.33%以上，完全光照條件下孢子萌發(fā)率低于其他兩種條件下的萌發(fā)率，為85%。完全光照條件對(duì)棉鈴紅粉病菌T.roseum的分生孢子萌發(fā)具有一定的抑制作用，而完全黑暗和光暗交替則有利T.roseum的孢子萌發(fā)。表5

表5 不同光照條件下棉鈴紅粉病菌孢子萌發(fā)變化

Table 5 Effect of light on spore germination of cotton boll pathogenic fungus

光照Light萌發(fā)率 Germination rate (%)12 h24 h36 h48 h完全光照Light3.8b26.4b59.7b85.0b光暗交替Light dark alternationt3.7c27.6b62.7b93.3a完全黑暗Darkness9.0a40.2a74.0a95.7a

注：數(shù)據(jù)后小寫英文字母為0.05水平顯著性差異

Note: letters after date indicate at 0.05 levels

2.4.5 濕度條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

研究表明，在供試的四個(gè)相對(duì)濕度和水中，48 h后，在100%相對(duì)濕度下孢子萌發(fā)率為100%；相對(duì)濕度在80%時(shí)孢子萌發(fā)率為80.33%；相對(duì)濕度為60%時(shí)的萌發(fā)率為51.5%；相對(duì)濕度為40%時(shí)孢子萌發(fā)率最低為28.50%；而水中的孢子萌發(fā)率為58.7%，與相對(duì)濕度60%條件下接近。在40%～100%的相對(duì)濕度條件下，濕度越大，孢子的萌發(fā)率越高。表6

表6 不同濕度條件下棉鈴紅粉病菌孢子萌發(fā)變化

Table 6 Effect of humidity on spore germination of cotton boll pathogenic fungus

濕度Humidity萌發(fā)率 Germination rate (%)12 h24 h36 h48 h40%7.5a15.0d23.5d28.5e60%10.3a18.0d27.3d51.5d80%10.3a40.7b65.0b80.3b100%9.5a57.0a98.0a100.0a水12.0a25.3c40.8c58.7c

注：數(shù)據(jù)后小寫英文字母為0.05水平顯著性差異

Note: little letters after date indicate at 0.05 levels

3 討 論

經(jīng)鑒定，新疆石河子棉區(qū)和阿克蘇棉區(qū)的棉鈴紅粉病是由粉紅聚端孢菌(T.roseum)所致，這一結(jié)果與潘月敏(2005)等[7]及黎鴻慧等(2011)的報(bào)道相同[8]。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，在16個(gè)代表性菌株中，其中13個(gè)菌株與T.roseum(KP317992.1)相似性為100%；2個(gè)菌株與T.roseum(JQ898156.1)的相似性為100%，只有12號(hào)菌株與T.roseum(JQ898156.1) 的相似性為98%，初步認(rèn)為在鐘內(nèi)可能存在生物多樣性。

國(guó)內(nèi)關(guān)于棉鈴紅粉病的研究較少，對(duì)其學(xué)名應(yīng)用也比較混亂。如當(dāng)前有的使用Trichotheciumroseum， 但也有的用Cephalotheciumroseum，有的甚至把它們作為為害棉鈴的兩種菌[11]。張中義等[12]在《植物病原真菌學(xué)》中就指出Trichotheciumroseum和Cephalotheciumroseum是同物異名。陸家云[13]在所著植物病原真菌學(xué)一書中再次強(qiáng)調(diào)Trichotheciumlink=CephalotheciumCorda；Trichotheciumroseum=Cephalotheciumroseum，故不能將其作為兩種不同的菌。Cephalotheciumroseum只是Trichotheciumroseum的同物異名，目前國(guó)內(nèi)大部分研究單位都使用Trichotheciumroseum，以此為好。

研究查明，該菌在10～35℃條件下均可生長(zhǎng)，但10和35℃時(shí)生長(zhǎng)極其緩慢，25℃左右為其生長(zhǎng)的最適溫度，5和40℃不能正常生長(zhǎng)。對(duì)生長(zhǎng)7 d的菌落進(jìn)行產(chǎn)孢量檢測(cè)，以生長(zhǎng)在25℃條件下的分生孢子量最多，達(dá)到了8.65×106cfu/mL；其次是在20℃時(shí)的分生孢子量；15和30℃的分生孢子量明顯減少；10℃以下和35℃以上不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢極少。該結(jié)果與Yun等[3]和王勇等[7]研究結(jié)果基本一致，不同點(diǎn)為試驗(yàn)中5℃菌落不能生長(zhǎng)，而王勇等研究中5℃條件下148 h時(shí)開始生長(zhǎng)。

三種光照條件對(duì)T.roseum的菌落生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的差異，但是對(duì)產(chǎn)孢量的影響很大。其中完全光照條件下產(chǎn)孢量最少，完全黑暗產(chǎn)孢量最大，光暗交替處于兩者之間，說(shuō)明光線對(duì)產(chǎn)孢有明顯的抑制作用；此外，不同光照條件對(duì)菌落的形態(tài)特征也有一定的影響：完全光照和完全黑暗所長(zhǎng)出的菌落不產(chǎn)生輪紋；而光暗交替條件下所長(zhǎng)出的菌落，由于光暗條件產(chǎn)孢量的明顯不同，則產(chǎn)生明顯的輪紋。

分生孢子萌發(fā)是病菌侵染的前提，研究氣候條件對(duì)病菌孢子萌發(fā)的作用對(duì)了解該病的發(fā)生規(guī)律和防治都有重要作用。研究表明，該菌的分生孢子萌發(fā)最適溫度為20～25℃，15℃以下或35℃以上孢子萌發(fā)率明顯下降，萌發(fā)時(shí)間推遲，而當(dāng)溫度小于5℃或大于40℃時(shí)，孢子不能萌發(fā)，這一結(jié)論與殷輝等[14]在棗果貯藏期紅粉病菌鑒定及環(huán)境因子對(duì)其分生孢子萌發(fā)的影響結(jié)論相似。關(guān)于光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響國(guó)內(nèi)報(bào)道很少，試驗(yàn)查明，該菌分生孢子在供試不同光照條件下都可萌發(fā)，且48 h萌發(fā)率達(dá)到了85%以上，但其趨勢(shì)為：完全黑暗>光暗交替>完全光照，表明光線對(duì)孢子萌發(fā)有一定的抑制作用。關(guān)于相對(duì)濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響，試驗(yàn)的結(jié)果是：在40%～100%的相對(duì)濕度條件下，濕度越大，孢子的萌發(fā)率越高，當(dāng)濕度大于80%時(shí)，最適該菌分生孢子萌發(fā)，但在水中的萌發(fā)率又明顯下降。

由于棉鈴紅粉病菌產(chǎn)孢量很大，發(fā)芽率較高，潛育期較短，對(duì)濕度條件要求較高，故秋季一旦遇到持續(xù)降雨天氣，易造成該病的發(fā)生。

4 結(jié) 論

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、致病性測(cè)定和分子生物學(xué)分析查明，引起棉鈴紅粉病的病原菌是粉紅聚端孢T.roseum。通過(guò)氣候條件對(duì)菌落生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和對(duì)孢子萌發(fā)的影響查明，棉鈴紅粉菌在10～35℃條件下均可生長(zhǎng)，25℃左右為其生長(zhǎng)的最適溫度；在黑暗潮濕的條件下，25℃左右的溫度，適于棉鈴紅粉菌產(chǎn)孢；該菌的分生孢子在10～35℃、40%～100%的相對(duì)濕度和有光和無(wú)光的條件下均可萌發(fā)，萌發(fā)的最適條件是：溫度為20～25℃、相對(duì)濕度80%以上。在此條件下，相對(duì)黑暗的環(huán)境更有益于孢子的萌發(fā)。