棉鈴疫病人工接種方法優(yōu)化及應(yīng)用

鹿秀云，商俊燕，邵美琪，謝雪嬌，郭慶港，李社增，馬平*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)中心，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000）

棉鈴疫病是造成我國主要棉區(qū)棉花爛鈴的主要病害，其發(fā)生率占爛鈴病的90%以上[1-2]，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。 我國棉鈴疫病主要由苧麻疫霉（Phytophthora boehmeriae）引起[3-4]。苧麻疫霉不僅直接侵染棉鈴導(dǎo)致棉鈴疫病，而且還增加了其他腐生病原菌侵染棉鈴的概率[5]。 針對該病害，我國學(xué)者開展了多種防治技術(shù)研究。 楊春萍[6]和常文周等[7]將推株并壟、化學(xué)調(diào)控棉花高度和封行時(shí)間、摘早蕾、摘爛鈴等防治技術(shù)在生產(chǎn)中應(yīng)用，并初見成效。 但這些技術(shù)應(yīng)用時(shí)存在難以精準(zhǔn)控制、費(fèi)工費(fèi)時(shí)等問題，故其在生產(chǎn)實(shí)踐中并未被普遍推廣應(yīng)用。 行間覆蓋地膜的物理防治技術(shù)雖然在棉鈴疫病防治上取得了較好的防病效果和經(jīng)濟(jì)效益[8]，但因?yàn)榕涮状胧┎煌晟频葐栴}，在棉花生產(chǎn)中也未大面積應(yīng)用。

選育和利用抗病品種是控制作物病害最經(jīng)濟(jì)、有效的措施。 田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同棉花品種對爛鈴病的抗性存在很大差異。 朱荷琴等調(diào)查發(fā)現(xiàn)鈴病發(fā)生的輕重與棉花品種類型關(guān)系密切，海島棉較亞洲棉和陸地棉鈴病發(fā)生重，黃河流域棉區(qū)的品種較長江流域棉區(qū)的品種鈴病重，早熟棉品種的爛鈴率明顯高于中熟棉品種[9]；李社增等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，河北、山東和河南3 省審定的50 個棉花品種對棉花爛鈴病的抗性存在顯著差異，其中邯7860、邯棉103、錦科178、百棉1 號和鄭農(nóng)棉4號5 個品種對棉花爛鈴病表現(xiàn)出較好的抗性[2]；李彩紅等調(diào)查發(fā)現(xiàn)湖南省的26 個品種（系）對鈴病病原菌的抵抗力存在顯著差異[10]。 然而目前還沒有關(guān)于棉鈴疫病的抗性評價(jià)方法。 藥劑防治棉花爛鈴是棉農(nóng)普遍采用的主要措施，但目前針對棉鈴疫病我國僅登記了以三乙膦酸鋁為有效成分的4 個化學(xué)殺菌劑， 其防效也不盡如人意，難以滿足生產(chǎn)需求。 因此，有必要建立快速有效的人工接種方法開展殺卵菌類藥劑或廣譜性化學(xué)殺菌劑對棉鈴疫病的防治效果評價(jià)，以期為棉鈴疫病的藥劑防治提供技術(shù)指導(dǎo)。

在棉鈴疫病的人工接種方法方面，李暉等采用75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的酒精將健康棉鈴離體消毒，然后在苞葉和棉鈴間擦傷接種黃豆粒大小棉鈴疫菌菌絲塊，能夠使棉鈴表現(xiàn)典型的疫病癥狀[11]；單衛(wèi)星等通過游動孢子人工接種試驗(yàn)證明棉鈴疫菌主要危害棉鈴，此外還能侵染棉苗及成株葉片[12]；馬輝剛等采用菌絲塊創(chuàng)傷接種法，分別對棉苗子葉、棉鈴和苧麻葉片接種，4 株棉鈴疫菌對棉鈴的致病力強(qiáng)，對苧麻的致病力弱，對棉苗存在明顯的致病力分化[13]。 雖然研究者應(yīng)用不同的接種方法開展了相關(guān)研究，但這些接種方法均沒有詳細(xì)描述技術(shù)指標(biāo)，且試驗(yàn)周期長。 為了解決上述問題，本研究擬對棉鈴疫病人工接種方法進(jìn)行優(yōu)化，篩選致病快、重復(fù)性強(qiáng)的接種方法，為棉鈴疫病的有效防治提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌：棉鈴疫菌（P.boehmeriae）菌株JP5-1， 自河北省滄州市獻(xiàn)縣河城街鎮(zhèn)河城街村（116°12′21″E，36°10′41″N） 發(fā)病棉鈴上分離，在棉鈴上表現(xiàn)為強(qiáng)致病力，用于棉鈴疫病人工接種方法優(yōu)化試驗(yàn)。 棉鈴疫菌菌株JP2-1、JP2-2、JP2-3分離自河北省肥鄉(xiāng)縣 （114°45′57″E，36°31′53″N），JP3-1、JP3-2、JP3-3、JP3-4 分離自河北省成安縣 （114°44′24″E，36°29′58″N），JP15-2 分離自河北 省 威 縣 （115°26′53″E，36°55′48″），JP18-3、JP18-4 分離自河北省邱縣 （115°10′53″E，36°48′25″N）， 該10 株棉鈴疫菌用于致病力測定試驗(yàn)。以上病原菌菌株均由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

供試棉花品種：冀棉863 由曲周縣銀絮棉花專業(yè)合作社提供，農(nóng)大棉8 號由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供， 冀豐106 由河北冀豐棉花科技有限公司提供， 鄂荊1 號和冀棉11 由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室繁種。 邯7860、DP99B、百棉5 號、國欣棉11、新陸中35、柳棉2 號、邯棉802、新植5 號、魯棉研29、科林9828、科抗棉2 號、魯墾棉33、創(chuàng)優(yōu)9 號、魯棉研27、銀山6 號和冀151 等已審定品種的種子由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

供試化學(xué)藥劑：25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）甲霜·霜霉威可濕性粉劑（劑型代碼：WP）由浙江禾本科技有限公司生產(chǎn)，70%丙森鋅可濕性粉劑由深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)，52.5%噁酮·霜脲氰水分散粒劑（劑型代碼：WG）和46.1%氫氧化銅水分散粒劑由美國杜邦公司生產(chǎn)，70%乙鋁·錳鋅可濕性粉劑由利民化學(xué)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，50%烯酰嗎啉水分散粒劑由海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，40%五氯硝基苯粉劑（劑型代碼：DP）由山西農(nóng)豐寶農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)；69%烯?！ゅi鋅可濕性粉劑由威海韓孚生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，50%福美雙可濕性粉劑由河北冠龍農(nóng)化有限公司生產(chǎn)，722 g·L－1霜霉威鹽酸鹽水劑（劑型代碼：AS）由拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司生產(chǎn)，80%代森錳鋅可濕性粉劑由鄭州志信農(nóng)化有限公司生產(chǎn)，250 g·L－1嘧菌酯懸浮劑（劑型代碼：SC）由先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司生產(chǎn)。

培養(yǎng)基是馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）土豆煎汁、2%葡萄糖、2%瓊脂粉、蒸餾水1 000 mL。

儀器設(shè)備：SPX-8085-II 生化培養(yǎng)箱， 由上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn)；VD-650-U 潔凈工作臺，由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；恒溫人工氣候室，由保定市華風(fēng)制冷有限公司生產(chǎn)。

1.2 病原菌活化

將保存在4 ℃PDA 試管斜面培養(yǎng)基上的棉鈴疫菌菌株轉(zhuǎn)接至PDA 平板上，于25 ℃下培養(yǎng)5 d，備用。

1.3 棉鈴疫病人工接種方法優(yōu)化

在河北省曲周縣銀絮棉花專業(yè)合作社試驗(yàn)田種植棉花品種冀棉863， 定點(diǎn)定株采集健康成鈴用于棉鈴疫病人工接種方法的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.1 棉花植株不同部位成鈴疫病感染情況檢測。 于7 月27 日、8 月23 日、9 月2 日和9 月23日分別采集棉花植株下部第1～3 果枝、 中部第4～6 果枝、中部第7～9 果枝和植株上部第10～12 果枝的健康成鈴 （鈴最大處的直徑≥2.5 cm）各40 個，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。 將去掉苞葉的棉鈴固定在40 cm×25 cm 的長方形白色泡沫板上，每塊泡沫板平均分為8 排，每排固定5 個棉鈴， 每塊泡沫板固定40 個棉鈴， 放入盛有300 mL 無菌水的保濕培養(yǎng)盒內(nèi)（保濕盒長42.0 cm，寬27.5 cm，高10.5 cm，用保鮮膜封嚴(yán)保濕），每10 個棉鈴為1 次重復(fù)，每個處理重復(fù)4 次，置于25 ℃培養(yǎng)室恒溫培養(yǎng)。 觀察棉鈴發(fā)病情況，調(diào)查棉鈴發(fā)病率，明確棉花植株不同部位棉鈴攜帶疫菌的情況。

1.3.2 棉鈴表面消毒處理對棉鈴疫病發(fā)病情況的影響。 于8 月中旬采集棉株中部第4～6 果枝和第7～9 果枝的健康成鈴各80 個，帶回實(shí)驗(yàn)室開展試驗(yàn)。 將棉鈴去掉苞葉，將其中40 個棉鈴在75%酒精消毒液中浸泡2 min 后取出， 酒精自然揮發(fā)后備用；另外40 個棉鈴不作任何處理（空白對照）。每10 個棉鈴為1 次重復(fù)，每個處理重復(fù)4次，恒溫保濕培養(yǎng)條件同1.2.1。 每天觀察發(fā)病情況，記錄發(fā)病棉鈴數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，計(jì)算病鈴率。

1.3.3 有傷和無傷接種對棉鈴疫病發(fā)病情況的影響。 于8 月中下旬采集棉株中部第4～9 果枝的健康成鈴80 個，帶回實(shí)驗(yàn)室開展試驗(yàn)。 將棉鈴去掉苞葉，在75%酒精消毒液中浸泡2 min 后取出， 酒精自然揮發(fā)后備用。 設(shè)有傷和無傷接種2個處理，（1）有傷接種處理：用滅菌針束（3 根5 號縫衣針）將鈴面中上部鈴縫處輕微刺傷（深度3 mm），將培養(yǎng)5 d 的棉鈴疫菌JP5-1 菌絲塊（直徑5 mm）面朝下貼在傷口處；（2）無傷接種處理：直接將培養(yǎng)5 d 的棉鈴疫菌JP5-1 菌絲塊（直徑5 mm）面朝下貼在鈴面中上部的鈴縫處。 每個處理設(shè)4 次重復(fù)，每次重復(fù)10 個棉鈴，放入培養(yǎng)盒中培養(yǎng)，恒溫保濕培養(yǎng)條件同1.2.1，每天觀察發(fā)病情況，記錄發(fā)病棉鈴數(shù)和發(fā)病級別，計(jì)算病鈴率和病情指數(shù)。

1.4 棉鈴疫病人工接種方法的應(yīng)用

1.4.1 篩選防治棉鈴疫病的化學(xué)殺菌劑。評價(jià)12種化學(xué)殺菌劑對棉鈴疫病的防效。 于8 月中下旬采集農(nóng)大棉8 號植株中部第4～9 果枝健康成鈴， 按照1.3.3 中棉鈴疫病有傷接種技術(shù)對去掉苞葉的棉鈴進(jìn)行表面消毒和刺傷，然后將棉鈴固定在泡沫板上放入保濕盒內(nèi)；在棉鈴傷口位置噴施相應(yīng)稀釋倍數(shù)的化學(xué)藥劑水溶液，待藥液晾干后將培養(yǎng)5 d 的棉鈴疫菌JP5-1 菌絲塊 （直徑5 mm） 面朝下貼在傷口處。 每個處理設(shè)4 次重復(fù)，每次重復(fù)10 個棉鈴，放入培養(yǎng)盒中培養(yǎng)，恒溫保濕培養(yǎng)條件同1.2.1， 每天觀察發(fā)病情況，分別在培養(yǎng)3 d、5 d 和7 d 時(shí)調(diào)查棉鈴疫病發(fā)病情況，記錄發(fā)病棉鈴數(shù)和發(fā)病級別，計(jì)算病鈴率和病情指數(shù)。

1.4.2 評價(jià)棉花品種對棉鈴疫病的抗性。 應(yīng)用棉鈴疫病人工接種方法評價(jià)已審定的16 個棉花品種對棉鈴疫病的抗性。 在河北省獻(xiàn)縣小平王鄉(xiāng)西劉莊村試驗(yàn)田種植16 個棉花品種， 每個棉花品種種植2 行，每行約25 株，常規(guī)栽培管理。 于8月中下旬采集各棉花品種植株中部第4～9 果枝健康成鈴，按照1.3.3 中棉鈴疫病有傷接種技術(shù)對不同品種的棉鈴進(jìn)行接種， 每個處理設(shè)4次重復(fù)，每次重復(fù)10 個棉鈴，25 ℃保濕培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)3 d、5 d 和7 d 時(shí)調(diào)查棉鈴疫病發(fā)病情況，記錄發(fā)病棉鈴數(shù)和棉鈴疫病發(fā)病級別，計(jì)算病鈴率和病情指數(shù)， 評價(jià)棉花品種對棉鈴疫病的抗性。

1.4.3 評價(jià)棉鈴疫菌的致病力。 應(yīng)用棉鈴疫病人工接種方法評價(jià)10 株棉鈴疫菌在棉鈴上的致病力。 采集農(nóng)大棉8 號植株中部第4～9 果枝健康成鈴， 按照1.3.3 中棉鈴疫病有傷接種技術(shù)進(jìn)行接種，25 ℃保濕培養(yǎng)。每個菌株作為1 個處理，每個處理設(shè)4 次重復(fù)，每次重復(fù)10 個棉鈴。 分別在培養(yǎng)3 d、5 d 和7 d 時(shí)調(diào)查棉鈴疫病發(fā)病情況，記錄發(fā)病棉鈴數(shù)和棉鈴疫病發(fā)病級別，計(jì)算病鈴率和病情指數(shù)，評價(jià)棉鈴疫菌的致病力。

1.5 棉鈴疫病的調(diào)查方法

采用5 級標(biāo)準(zhǔn)[14]調(diào)查棉鈴疫病的發(fā)病情況：0級，未發(fā)病；1 級，病斑面積≤25%；2 級，25.0%＜病斑面積≤50.0%；3 級，50.0%＜病斑面積≤75.0%；4 級，病斑面積＞75.0%。 根據(jù)以下公式計(jì)算病鈴率（rDB）、病情指數(shù)（DI）和防治效果（防效，E）。 公式：rDB（%）＝NDB/N×100，式中NDB為病鈴數(shù)，N 為總鈴數(shù)。DI＝∑（i×Ni）/（imax×N 總鈴數(shù)）×100， 式中i 為病級，Ni為i 病級鈴數(shù)，imax為最高病級，N 為總鈴數(shù)。 E （%）＝（DICK－DIT）/DICK×100， 式中DICK為對照病情指數(shù)，DIT為處理病情指數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用鄧肯多重范圍檢驗(yàn)（鄧肯氏新復(fù)極差法）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花植株不同部位棉鈴感病情況檢測

采集田間棉株不同部位的棉鈴經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)， 培養(yǎng)7 d 時(shí)， 僅棉株下部第1～3 果枝鈴（T1）開始發(fā)?。ú♀徛?.25%），而中部第4～6果枝鈴（T2）、中部第7～9 果枝鈴（T3）和上部第10～12 果枝鈴（T4）各部位棉鈴均未發(fā)??；培養(yǎng)12 d 時(shí)，除上部棉鈴未發(fā)病外，其他部位的棉鈴均發(fā)病， 棉株下部果枝的病鈴率顯著高于棉株中部第4～6 果枝和中部第7～9 果枝的病鈴率；培養(yǎng)17 d 和22 d 時(shí)，棉株所有部位的棉鈴均發(fā)病， 棉株下部果枝的病鈴率顯著高于中部第4～6 果枝鈴、 中部第7～9 果枝鈴和上部果枝鈴（圖1）。

2.2 棉鈴表面消毒處理對棉鈴疫病發(fā)病的影響

室內(nèi)培養(yǎng)7 d 時(shí)， 棉鈴表面經(jīng)75%酒精消毒2 min 處理的棉鈴未發(fā)生疫病， 未消毒處理的對照病鈴率為1.3%；培養(yǎng)12 d 時(shí)，酒精消毒處理的病鈴率為1.3%，顯著低于未消毒處理的對照病鈴率（15.6%）；培養(yǎng)17 d 和22 d 時(shí)，酒精消毒處理的病鈴率分別為8.1%和12.5%，仍然顯著低于未消毒處理的對照病鈴率（49.9%和55.0%）（圖2）。培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，棉鈴表面經(jīng)酒精消毒無疫病以外的病害發(fā)生，對照除疫病嚴(yán)重外還發(fā)生了其他真菌的感染。 說明75%酒精處理棉鈴表面2 min能夠有效殺死或抑制棉鈴表面攜帶的疫病菌和其他雜菌，有效保證了棉鈴疫病人工接種試驗(yàn)需要的棉鈴表面無菌環(huán)境。

圖1 人工培養(yǎng)條件下棉株上不同部位棉鈴疫病發(fā)病情況比較Fig. 1 Comparison of disease incidence of cotton boll blight in different parts of cotton plant under the artificial culture conditions

圖2 棉鈴表面消毒對棉鈴疫病發(fā)病的影響Fig. 2 Influence of sterilizing cotton bolls on disease incidence of cotton boll blight

2.3 有傷接種和無傷接種對棉鈴疫病發(fā)病的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，接種后保濕培養(yǎng)3 d時(shí)，有傷接種的處理病鈴率達(dá)90.0%，病情指數(shù)達(dá)29.38，無傷接種處理棉鈴未發(fā)??；培養(yǎng)5 d 和7 d時(shí)，有傷接種的處理病鈴率達(dá)92.5%和95.0%，病情指數(shù)分別為58.75 和89.38，無傷接種處理棉鈴仍未發(fā)?。慌囵B(yǎng)9 d、11 d 和13 d 時(shí)，有傷接種的處理病鈴率均為95.0%， 病情指數(shù)均為95.00，而無傷接種的處理在培養(yǎng)11 d 和13 d 時(shí)病鈴率僅為20.0%和42.5%， 病情指數(shù)僅為6.25 和16.25。說明有傷接種棉鈴疫菌，棉鈴疫病發(fā)病快速且發(fā)病均勻。

圖3 有傷接種和無傷接種下棉鈴疫病發(fā)病情況的比較Fig. 3 Comparison of disease incidence of cotton boll blight between injured and no injured inoculation

2.4 采用優(yōu)化的人工接種方法篩選防治棉鈴疫病的化學(xué)殺菌劑

應(yīng)用優(yōu)化的棉鈴疫病人工接種方法評價(jià)了12 種化學(xué)殺菌劑對棉鈴疫病的防治效果。試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，人工接種棉鈴疫菌JP5-1 菌株后3 d 時(shí)，12 個化學(xué)藥劑處理的病鈴率在15.0%～80.0%， 棉鈴疫病病情指數(shù)在3.13～25.00， 其中25%甲霜·霜霉威可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性

粉劑和52.5%噁酮·霜脲氰水分散粒劑處理的病鈴率、 棉鈴疫病病情指數(shù)顯著低于空白對照，對棉鈴疫病的防效在70%以上；人工接種后5 d 時(shí)，12 個化學(xué)藥劑處理的病鈴率在15.0%～92.5%，棉鈴疫病病情指數(shù)在3.75～50.00， 其中25%甲霜·霜霉威可濕性粉劑和70%丙森鋅可濕性粉劑的病鈴率、棉鈴疫病病情指數(shù)均顯著低于空白對照，對棉鈴疫病的防效在80%以上；人工接種后7 d 時(shí)，空白對照充分發(fā)病，病鈴率和病情指數(shù)分別高達(dá)97.5%和90.63， 此時(shí)12 個化學(xué)藥劑處理的病鈴率在17.5%～100.0%，棉鈴疫病病情指數(shù)在5.00～88.13， 其中25%甲霜·霜霉威可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑和52.5%噁酮·霜脲氰水分散粒劑的病鈴率、 棉鈴疫病病情指數(shù)仍然顯著低于空白對照，對棉鈴疫病表現(xiàn)出理想的防效。以上結(jié)果說明， 本研究優(yōu)化建立的棉鈴疫病人工接種方法可用于篩選防治棉鈴疫病的化學(xué)藥劑。

表1 應(yīng)用優(yōu)化的棉鈴疫病人工接種方法篩選防治棉鈴疫病化學(xué)殺菌劑的結(jié)果比較Table 1 Screening of chemical fungicides for controlling cotton boll blight by the optimized artificial inoculation method

2.5 應(yīng)用優(yōu)化的棉鈴疫病人工接種方法評價(jià)棉鈴疫菌的致病力

應(yīng)用優(yōu)化的棉鈴疫病人工接種方法評價(jià)了10 株來源于冀中南主產(chǎn)棉區(qū)的棉鈴疫菌的致病力。 試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，人工接種后3 d 時(shí)，病鈴率為35.0%～78.8%， 病情指數(shù)為11.25 ～22.50，其中接種菌株JP2-2 的病鈴率和病情指數(shù)均顯著高于菌株JP15-2、JP18-3、JP2-1 的病鈴率和病情指數(shù)， 與菌株JP18-4、JP3-1 和JP3-3 差異不顯著；人工接種后5 d 時(shí)，棉鈴病鈴率為75.0%～100.0%， 病情指數(shù)為26.25～52.50， 其中菌株JP18-4 的病鈴率顯著高于菌株JP15-2 的病鈴率，接種菌株JP18-4 的棉鈴病情指數(shù)顯著高于接種其他供試菌株的棉鈴病情指數(shù)； 人工接種后7 d時(shí)，棉鈴的病鈴率為80.0%～100.0%，病情指數(shù)為45.00～95.00，其中接種菌株JP18-4 的棉鈴病鈴率仍然顯著高于接種菌株JP18-3 和JP2-1，病情指數(shù)也顯著高于除JP3-3 之外的其他供試菌株。 綜合3 次調(diào)查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)供試的10 株棉鈴疫菌中JP18-4 對棉鈴的致病力最強(qiáng)，JP15-2 對棉鈴的致病力最弱，說明應(yīng)用本研究優(yōu)化建立的棉鈴疫病人工接種方法能夠有效區(qū)分不同棉鈴疫菌菌株對棉鈴的致病力。

表2 應(yīng)用優(yōu)化的棉鈴疫病人工接種方法評價(jià)棉鈴疫菌的致病力Table 2 Evaluation of pathogenicity of P. boehmeriae on cotton boll by the optimized artificial inoculation method

2.6 應(yīng)用優(yōu)化的棉鈴疫病人工接種方法評價(jià)棉花品種對棉鈴疫病的抗病性

應(yīng)用優(yōu)化的棉鈴疫病人工接種方法評價(jià)了16 個已審定棉花品種對棉鈴疫病的抗性。試驗(yàn)結(jié)果表明 （表3）， 供試品種在人工接種棉鈴疫菌JP5-1 菌株后3 d 時(shí)均有不同程度發(fā)病，病鈴率為25.0%～100.0%，病情指數(shù)為6.25～38.75，不同品種間病鈴率、病情指數(shù)存在顯著差異；接種后5 d 時(shí)，供試品種棉鈴疫病發(fā)病迅速加重，病鈴率為82.5%～100.0%，病情指數(shù)為38.75～72.50，不同品種間病鈴率、 病情指數(shù)仍然存在顯著差異；接種后7 d 時(shí)，供試各品種棉鈴疫病發(fā)病充分，病鈴率95.0%～100.0%，不同品種間病鈴率差異不顯著，病情指數(shù)為85.00～100.00，最大病情指數(shù)與最小病情指數(shù)僅相差15.00，方差分析發(fā)現(xiàn)，品種間差異顯著性縮小。 3 次連續(xù)調(diào)查結(jié)果顯示，邯7860、新植5 號、柳棉2 號、科林9828 和DP99B 對棉鈴疫病表現(xiàn)了較好的抗性，冀151、銀山6 號、魯墾棉33 和魯棉研27 對棉鈴疫病抗性較差。本研究結(jié)果說明，應(yīng)用人工接種方法能夠快速評價(jià)不同棉花品種對棉鈴疫病的抗性，明確棉花品種在人工接種病原菌不同時(shí)間后對棉鈴疫病的抗性程度。

表3 應(yīng)用優(yōu)化的人工接種方法評價(jià)不同棉花品種對棉鈴疫病的抗性Table 3 Evaluation of resistance of different cotton varieties to cotton boll blight by the optimized artificial inoculation method

表3 （續(xù)）Table 3 (Continued)

3 討論與結(jié)論

3.1 棉株不同部位棉鈴發(fā)病情況

棉鈴疫病的病原菌為苧麻疫霉， 自然條件下， 該病菌在寄主組織及土壤中均可產(chǎn)生卵孢子，卵孢子在土壤中可安全越冬作為次年病害的主要初侵染源。 在棉花爛鈴病的眾多病原菌中棉鈴疫菌的寄生能力最強(qiáng)，其卵孢子萌發(fā)產(chǎn)生的孢子囊可隨雨水飛濺到健康棉花成鈴上進(jìn)行寄生和侵染[15]。 有文獻(xiàn)報(bào)道，棉田爛鈴的發(fā)生，多從近地面的棉鈴開始，有近距離感染的趨勢。 竺修高調(diào)查發(fā)現(xiàn)，果枝越低爛鈴越重[16]。崔淑芳等報(bào)道河北省棉區(qū)爛鈴以棉鈴疫病為主，在多雨年份棉株下部5 個果枝都有爛鈴，在30%以上，主要集中在中下部果枝[17]。 王金平報(bào)道棉花爛鈴病的發(fā)生與棉鈴生長位置關(guān)系密切， 就棉花單株?duì)€鈴而言，表現(xiàn)為基部重于中上部，基部3 個果枝上的爛鈴數(shù)占爛鈴總數(shù)的80%以上； 在水平位置上，內(nèi)圍鈴重于外圍鈴， 第1～2 節(jié)的爛鈴數(shù)占單株?duì)€鈴總數(shù)的90%[18]。 趙鳴等研究了黃河流域不同棉花品種爛鈴空間分布情況，發(fā)現(xiàn)覆膜春播模式下， 棉田爛鈴主要集中在下部果枝的內(nèi)圍節(jié)位，所有品種由下向上的第1～3 果枝爛鈴比例在82.14%～100.00%，由內(nèi)向外的第1～3 節(jié)位爛鈴比例在98.48%～100.00%[19]。 本研究從田間采集棉株不同果枝部位的健康成鈴，在室內(nèi)模擬棉鈴疫病田間發(fā)病條件保濕培養(yǎng)，明確了田間棉株下部第1～3 果枝鈴疫病發(fā)生率顯著高于中部第4～6 果枝鈴、中部第7～9 果枝鈴和上部第10～12 果枝鈴，與已有相關(guān)報(bào)道結(jié)果相似。 根據(jù)棉鈴疫病人工接種方法需要，本研究選取結(jié)鈴時(shí)間集中、 自身攜帶棉鈴疫菌相對較少的第4～9 果枝健康成鈴作為供試材料，是建立棉鈴疫病人工接種方法關(guān)鍵的第一步，為棉鈴疫病人工接種方法的優(yōu)化提供了材料基礎(chǔ)。

3.2 棉鈴疫病人工接種方法的建立

一個穩(wěn)定的棉鈴疫病人工接種方法是篩選防治棉鈴疫病藥劑、評價(jià)棉鈴疫病病原菌的致病力以及評價(jià)棉花抗棉鈴疫病品種等工作的基礎(chǔ)。前人針對棉花黃萎病開展了菌培養(yǎng)物土壤接種法、紙缽撕底法、切根蘸孢子法等多種人工接種方法的研究[20]；王婧等針對棉花葉部病害輪紋斑病，利用鏈格孢孢子懸浮液比較研究了涂菌+套袋保濕接種、涂菌+噴霧保濕接種和噴菌+噴霧保濕接種的效果，發(fā)現(xiàn)噴菌+噴霧保濕接種是更適合棉花鏈格孢抗性研究的接種方法[21]。 目前，未見棉鈴疫病人工接種方法研究的報(bào)道。 馬平等以發(fā)病率為指標(biāo)，通過在滅菌后的健康成鈴表面噴霧接種棉鈴疫菌游動孢子懸浮液的方法，評價(jià)了拮抗菌對棉鈴疫病的防治效果[22]，但僅僅統(tǒng)計(jì)了棉鈴疫病的發(fā)病率，沒有計(jì)算棉鈴疫病的病情指數(shù)。 陳方新等應(yīng)用有傷接種棉鈴疫菌菌盤的方法測定了棉鈴疫菌的致病性、寄主范圍以及不同棉鈴疫菌菌株對棉苗的致病力[23-24]。 但該方法每個接種點(diǎn)都需要覆蓋脫脂棉保濕培養(yǎng)，在培養(yǎng)24 h后須去除棉球和菌絲塊，操作繁瑣。 本研究建立的棉鈴疫病人工接種方法，選取棉株中部第4～9果枝上的健康帶柄成鈴，去掉苞葉，用75%酒精浸泡消毒2 min， 在棉鈴中上部鈴縫位置針刺接種棉鈴疫菌菌盤，25 ℃保濕培養(yǎng)3～7 d 即完全發(fā)病，操作簡單規(guī)范，發(fā)病快速均勻，是一種更適合棉鈴疫病研究的接種方法，可為棉鈴疫病的研究提供技術(shù)支持。

3.3 棉鈴疫病人工接種方法的應(yīng)用

應(yīng)用殺菌劑是目前防治棉花爛鈴病的主要措施，為篩選防治棉花爛鈴病的新型高效低毒低殘留農(nóng)藥，林玲等直接通過田間小區(qū)試驗(yàn)比較了4 種殺菌劑防治棉花爛鈴病的效果[25]；鹿秀云等采用菌絲生長速率法測定了9 種化學(xué)殺菌劑對棉鈴疫菌的室內(nèi)毒力，并通過田間小區(qū)試驗(yàn)評價(jià)了9 種化學(xué)殺菌劑防治棉鈴疫病的效果[26]。 本研究建立的棉鈴疫病人工接種方法，在人工控制的條件下直接以健康棉鈴為接種對象， 可在7 d 內(nèi)完成常用殺卵菌劑和廣譜性化學(xué)藥劑對棉鈴疫病的防治效果評價(jià)； 明確了25%甲霜·霜霉威可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑和52.5%噁酮·霜脲氰水分散粒劑對棉鈴疫病防效分別為94.48%、80.00%和74.48%，為有針對性開展田間小區(qū)藥劑評價(jià)試驗(yàn)提供了目標(biāo)藥劑，可有效減少田間試驗(yàn)的工作量。 以往主要通過調(diào)查田間病鈴率來評價(jià)棉花對爛鈴病的抗性差異，調(diào)查結(jié)果受氣候條件、土壤中致病菌菌量、棉花株型結(jié)構(gòu)、蟲害發(fā)生情況等多因素影響，而且耗時(shí)很長。 趙靜等對新疆阿拉爾墾區(qū)的30 個棉花品種（品系）爛鈴病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查， 篩選出KS1、KS2、KS21 等抗?fàn)€鈴品種（品系）[27]；趙鳴等在田間調(diào)查了山東省109 個棉花新品種的爛鈴病發(fā)生情況，結(jié)果表明供試品種間爛鈴發(fā)生存在顯著差異[28]。本研究通過室內(nèi)人工接種評價(jià)了16 個棉花品種棉鈴對棉鈴疫病的抗性，明確了邯7860、新植5號、柳棉2 號、科林9828 和DP99B 等5 個品種表現(xiàn)出較好的抗病性， 其中邯7860 的鑒定結(jié)果和以往田間鑒定結(jié)果[2]一致，說明本研究建立的棉鈴疫病人工接種方法的鑒定結(jié)果具有較好的代表性，可為相關(guān)抗病品種的篩選評價(jià)以及抗病機(jī)理的研究提供技術(shù)支撐。