棉花苯丙氨酸解氨酶基因家族的生物信息學分析

李雨哲，邢淋雪，劉夢潔，劉蘇瑤，鮑夢楠，劉震

（安陽工學院，河南安陽45500）

棉花是重要的纖維作物，棉花產(chǎn)業(yè)對中國經(jīng)濟發(fā)展有著重要的作用。 二倍體棉種分為8 個基因組（即A～G 和K），而常見的四倍體棉種（陸地棉、海島棉）為異源四倍體，由A 和D 兩個二倍體亞組組成[1]。 二倍體亞洲棉（Gossypium arboreum，A 組）[2]、雷蒙德氏棉（G.raimondii，D 組）[3]及四倍體陸地棉 （G.hirsutum，AD 組）、 海島棉（G.barabdense，AD 組）[4-5]的基因組已經(jīng)公布。 同時，NCBI-SRA 數(shù)據(jù)庫也公布了棉屬大量的表達數(shù)據(jù)，為開展基因家族的全基因組鑒定與生物信息學分析提供了基礎信息。

苯丙烷代謝途徑是植物重要的三大次生途徑之一， 其上游起始是以L- 苯丙氨酸或酪氨酸為底物，在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL,EC 4.3.1.5）的催化下脫氨，產(chǎn)生反式肉桂酸，最終生成香豆酰輔酶A，并以此為底物進入下游的類黃酮代謝、木質素代謝、香豆素代謝等分支[6-7]。 苯丙烷類代謝途徑的中間產(chǎn)物酚類物質和終產(chǎn)物黃酮、異類黃酮、木質素等物質參與植物的抗病原菌侵入過程，從而防御病原生物的侵染[8]。 PAL 是初級代謝途徑和苯丙烷類代謝途徑第一步反應的連接酶，是苯丙烷代謝的關鍵限速酶；它也被認為是一種防御酶，其編碼基因屬于多基因家族成員， 不同物種其拷貝數(shù)各異，成員從幾個至幾十個不等[9-10]。 PAL 表達量和活性的提高能促進木質素及酚類等次生物質的合成[11]。木質素是植物細胞次生壁的重要成分，次生壁加厚能在細胞形態(tài)結構上抵抗黃萎病菌的入侵，是棉株抗黃萎病菌的第一道屏障，次生壁中的木質素含量與棉花品種的耐病程度成正比。 已有研究表明，PAL 對阻礙棉花黃萎病菌的侵染具有重要作用[12]。 酚類物質作為莽草酸途徑的中間產(chǎn)物， 在棉花抗病防御反應中也有重要作用，它能抑制真菌水解酶的合成和分泌，避免棉花木質部結構的分解或導管的堵塞[11]。 生物信息學的方法在全基因組分析中發(fā)揮著越來越重要的作用， 棉花的多個重要基因家族已經(jīng)通過生物信息學的全基因組分析取得了重要成果[13-14]。 本研究依據(jù)已公布的陸地棉、海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉的基因組數(shù)據(jù)， 系統(tǒng)地分析了棉花PAL基因家族成員的進化、基因結構、共線性關系和基因表達等， 為深入研究棉花PAL 功能提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 棉花PAL 基因家族的全基因組鑒定與理化性質分析

下載陸地棉（https://www.cottongen.org/）、海島棉（https://www.cottongen.org/）、亞洲棉（ftp://bioinfo.ayit.edu.cn/downloads/） 和 雷 蒙 德 氏 棉（https://cottonfgd.org/） 的基因組序列和注釋數(shù)據(jù)。 依據(jù)PAL 家族的隱馬爾可夫模型文件PF00221，利用HMMER 程序[15]；同時依據(jù)擬南芥PAL 家族蛋白序列，利用BLASTP 程序[16]（E 值設為1e-10）， 搜尋上述4 個棉種的PAL 家族蛋白序列。 進一步通過在線工具NCBI CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和Search Pfam（http://pfam.xfam.org/search）進行驗證，去除保守結構域不完整的序列，得到PAL 家族成員序列。

借助在線工具ExPASy（https://www.expasy.org/）計算棉花PAL 家族成員的分子量和等電點。 利用亞細胞定位工具WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）預測棉花PAL 家族的亞細胞定位。

1.2 棉花PAL 基因家族的進化與基因結構分析

利用MEGA-X[17]內(nèi)置的Clustal W[18]對棉花PAL 蛋白序列進行比對，采用鄰接法（Neibourjoining method），Bootstrap 重復1 000 次構建進化樹。 利用在線工具GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析棉花PAL 基因家族成員的基因結構。 利用在線工具MEME（http://meme-suite.org/）分析PAL 蛋白序列的保守結構域，最大發(fā)現(xiàn)基序設置為10，其他參數(shù)為默認值。

1.3 棉花PAL 基因家族的染色體定位與順式作用元件分析

依據(jù)陸地棉、海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉的基因組注釋文件，利用MapChart[19]軟件繪制PAL 基因家族在染色體上的位置圖。編寫perl 腳本，從基因組序列中提取PAL 基因上游1 500 bp（base pair, 堿基對）作為啟動子序列，利用在線工具PlantCARE[20]分析啟動子的順式作用元件。

1.4 棉花PAL 基因家族成員的共線性分析

利用MCScanX[21]軟件分析PAL 基因家族在陸地棉、海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉中成員的共線性關系，最小模塊設置為10 個基因，并通過KaKs_Calculator 2.0[13]計算PAL 基因的選擇壓力。

1.5 棉花PAL 基因家族的表達分析

從NCBI SRA（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）數(shù)據(jù)庫下載高溫、低溫、鹽和PEG 脅迫下的陸地棉轉錄數(shù)據(jù)（NCBI BioProject:PRJNA248163），并下載陸地棉和海島棉在不同組織中的轉錄數(shù)據(jù)（NCBI BioProject: PRJNA490626）。 使用軟件Trimmomatic[22]去除轉錄序列兩邊的接頭，并對數(shù)據(jù)做質量控制。 通過軟件hisat2[23]將read 序列比對到基因組，使用軟件cufflinks[24]得出基因的表達量標準值FPKM （Fragments per kilobase million），將表達數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2（FPKM+1）處理后，使用MeV[25]軟件將表達數(shù)據(jù)可視化。

2 結果與分析

2.1 棉花PAL 基因家族成員的數(shù)量及其理化性質

綜合HMMER 和BLASTP 程序的分析結果（表1），共從陸地棉、海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉中鑒定出40 個棉花PAL 基因， 其中陸地棉12 個、海島棉13 個、亞洲棉7 個、雷蒙德氏棉8 個。 PAL 蛋白包含491～753 個氨基酸殘基，等 電 點 為5.85 ～9.09； 除GB_D04G1317 和GH_D04G1248 的編碼蛋白外，均呈酸性，分子量為54 360.02～78 879.87。 亞細胞定位結果顯示PAL 蛋白全部在細胞質中（表1）。

2.2 棉花PAL 基因家族的結構

進化分析結果表明棉花40 個PAL 基因家族成員可分為6 組，依次命名為Group1～Group6（圖1）。同一組內(nèi)的PAL 基因具有相近的序列長度。 Group1 中GB_D04G1317 有6 個外顯 子，GH_D04G1248 有5 個外顯子，Gorai.009G416400有4 個外顯子；Group6 中均只有1 個外顯子；其余的PAL 基因家族成員均含2 個外顯子。

表1 棉花PAL 基因家族成員信息Table 1 Information of cotton PAL gene family members

表1 （續(xù)）Table 1 (Continued)

我們將從PAL 蛋白序列中找到的10 個保守基序依次命名為Motif 1～Motif 10（圖1）。 棉花40 個PAL 家族成員中有36 個具有全部的10個Motif，且順序相同。 在4 個缺失Motif 的PAL基因中，3 個是來自Group1 中“內(nèi)含子- 外顯子”結構發(fā)生變化的基因， 另外一個是Group4 中的Gorai.007G373700 基因。

順式作用元件分析結果表明，陸地棉、海島棉、 亞洲棉和雷蒙德氏棉中的PAL 基因含有較多 的 光 響 應 相 關 元 件（ATCT-motif、GT1-motif、box-4、TCT-motif 等19 種）、 激素反應相關元件（ABRE、TGA-element、GARE-motif 等8 種）、脅迫響應相關元件 （LTR、WUN-motif、ARE 等6種） 和 生 長 發(fā) 育 相 關 元 件 （RY-element 和CAT-box 等3 種）。 其中光反應元件的數(shù)量較多且種類豐富。 在激素響應元件中，乙烯響應元件含量較多（圖2）。

2.3 棉花PAL 基因家族的染色體分布與共線性關系

棉花PAL 基因家族在染色體上的分布比較分散， 每條染色體包含1 個或2 個PAL 基因。 2 個PAL 基因位于同一染色體的則兩者距離非常近（圖3）。 在分析的4 個棉種之間共發(fā)現(xiàn)271 個PAL 共線性基因對； 結合PAL 基因家族的分組數(shù)據(jù)（圖1），發(fā)現(xiàn)除一條染色體上有2 個PAL 基 因 外（Ga04G0847、GB_A04G0957、Gorai.009G416400.1，GB_D04G1317，GH_D04G1248，Gorai.007G373700.1），同一組的PAL 基因之間均具有共線性關系（圖4）。

2.4 棉花PAL 基因家族的表達

圖1 PAL 基因的結構與保守基序Fig. 1 Gene structure and conserred motif of PAL gene in cotton

圖2 順式作用元件位置圖Fig. 2 Location diagram of cis-acting element

圖3 PAL 基因在染色體上的位置Fig. 3 Location of PAL gene on chromosome

總的來看， 陸地棉PAL 基因家族的表達量隨高溫、鹽和PEG 脅迫時間變化而增加，而在低溫脅迫下的表達量隨時間變化而逐漸減少。GH_D09G1608 和GH_D04G1247 基因分別在低溫和高溫脅迫12 h 后的表達量最高、GH_A01G2316 基因在鹽和PEG 脅迫12 h 后的表達量最高；GH_D04G1248 在本實驗所有條件下都不表達。在低溫脅迫下，GH_A06G0814 呈現(xiàn)上升趨勢（圖5）。 我們進一步分析了陸地棉和海島棉PAL 基因家族成員在不同組織中的表達情況（圖6）， 結果表明，PAL 基因在不同組織中的表達量不同，根、莖中的表達量較高，萼片中的表達量則較 低。 陸 地 棉 GH_D04G1248 和 海 島 棉GB_D04G1317 在所有檢測的組織都不表達。

3 討論

圖4 棉花PAL 基因共線性分析圖Fig. 4 Collinear analysis diagram of PAL genes in cotton

PAL 蛋白在植物防御系統(tǒng)中起著重要作用，參與植物響應病原菌的過程。 有研究表明，PAL與棉花黃萎病抗性有關[12]，PAL 酶活也可以作為植物抗病的標志酶[26]。 PAL 基因家族是一個相對較小的多基因家族，存在于多種植物，如擬南芥中有4 個PAL 基因[27]，胡桃中有12 個[28]，黃瓜中有13 個[29]。 依據(jù)進化分組數(shù)據(jù)和共線性關系，我們推測亞洲棉和雷蒙德氏棉分化之前的二倍體祖先共有6 個PAL 基因， 分別對應于本研究中的6 個分組。 其中Group1（4 號染色體祖先）中的PAL 基因進行了一次復制，因此該二倍體祖先有7 個PAL 基因祖先。我們還推測最初的四倍體祖先有14 個PAL 基因，在隨后的進化過程中丟失了1 個（位于D06 染色體）。 四倍體分化之后，陸地棉再丟失1 個PAL 基因 （位于A04 染色體）。此外，分化之后，雷蒙德氏棉的PAL 也發(fā)生了復制和丟失的情況，最終在陸地棉、海島棉、亞洲棉和 雷 蒙 德 氏 棉 中 分 別 有12、13、7、8 個PAL 基因。

圖5 陸地棉PAL 基因家族在非生物脅迫下的表達Fig. 5 Expression of PAL gene family under different stress in G. hirsutum

圖6 PAL 基因家族在陸地棉和海島棉不同組織的表達Fig. 6 Expression of PAL gene family in different tissues of G. hirsutum and G. barabdense

棉花PAL 基因在不同逆境脅迫下的表達變化趨勢也不盡相同。 在高溫、 鹽以及PEG 脅迫下，陸地棉PAL 基因的表達量明顯升高，這可能與PAL 基因參與木質素、 黃酮類等苯丙烷類代謝物的生成有關。 但在低溫脅迫下，基因的表達量呈下調(diào)趨勢， 推測低溫可能會影響PAL 基因的表達。 GH_D04G1248 在本實驗所有條件下都不表達。 參考基因結構和保守域分析結果，該基因含有5 個外顯子， 缺失motif 7 與motif 9 保守域； 同時， 在該基因附近有另一個PAL 基因GH_D04G1247，因此我們推測GH_D04G1248 可能已經(jīng)喪失了生物學活性，成為假基因。

4 結論

本研究分析了陸地棉、海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉基因組中PAL 基因家族成員的理化性質、基因結構、保守結構域、順式作用元件、染色體分布、進化、共線性關系和表達，推測了棉花PAL 基因家族成員數(shù)量的進化歷程。研究發(fā)現(xiàn)棉花PAL 基因家族在不同條件、 不同器官中的表達均有差異， 個別PAL 基因家族成員可能已經(jīng)喪失了表達能力。 這些研究結果為深入解析棉花PAL 基因的功能提供了參考。