重金屬Cd脅迫下內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草種子萌發(fā)及生長的影響

李柯，施寵，李昊宇，王文全，李陽

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】鎘(Cd)是備受關(guān)注的重金屬元素之一，具有移動性強(qiáng)、毒性大、周期長、難降解等特點(diǎn)[1]。Cd具有較強(qiáng)的化學(xué)活性，是植物生長發(fā)育過程中非必需的金屬元素之一，和其他重金屬相比，更容易被植物吸收和積累，植物大量吸收后會產(chǎn)生脅迫作用，對植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、生理生化過程都會造成不同程度的影響[2-4]。2014年7月發(fā)布的《全國污染狀況調(diào)查公報》顯示，耕地點(diǎn)位超標(biāo)率為19.4%，在無機(jī)污染物中Cd排在首位[5]。在對石河子墾區(qū)耕地土壤重金屬調(diào)查和評價時，以新疆土壤背景值為評價標(biāo)準(zhǔn)，已達(dá)到重度污染水平，累積現(xiàn)象明顯[6]。在對烏魯木齊市南郊農(nóng)田土壤鎘污染進(jìn)行調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)南郊農(nóng)田中鎘含量超標(biāo)的面積達(dá)到28.36%，其中兩個鄉(xiāng)的土壤鎘含量平均值已經(jīng)接近臨界的警示值[7]。在對新疆溫宿縣土壤重金屬含量進(jìn)行評價時，就單因子潛在風(fēng)險評價指數(shù)而言，重金屬Cd處于中生態(tài)風(fēng)險程度[8]。利用微生物，尤其是共生微生物來提高植物對重金屬的耐受性從而降低重金屬對植物的為害是目前國際研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。研究重金屬脅迫下內(nèi)生真菌-德蘭臭草共生體種子萌發(fā)和生長的影響，對解決新疆污染問題具有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】德蘭臭草(Melicatranssilvanica)是禾本科臭草屬多年生草本植物，主要分布于歐洲、中亞地區(qū)、俄羅斯西伯利亞等地，在我國沿天山北坡廣泛分布，主要生長于海拔800～2 000 m的落葉闊葉林下或干旱灌叢中及向陽干山坡[21]。禾草內(nèi)生真菌廣泛存在于禾草家族中并具有多樣性，在早熟禾亞科的冷季型草中分布最廣[9]。有研究表明，這些禾草內(nèi)生真菌賦予宿主植物很強(qiáng)的競爭能力，可以提高植物的抗旱性[10-12]、抗鹽堿性[13-16]等。有研究報道了內(nèi)生真菌和植物的共生體能增強(qiáng)宿主植物對重金屬的耐受性，內(nèi)生真菌侵染可以改善宿主高羊茅(Festucaarundinacea)的Zn耐受性[17]，也可以提高細(xì)羊茅(F.stapfii)[18]、紫羊茅(F.rubra)[19]對Al脅迫的耐受性，帶菌的多年生黑麥草(Loliumperenne)可以積累更多的Cd元素[20]。【本研究切入點(diǎn)】2014～2018年間，沿天山北坡調(diào)查采樣時發(fā)現(xiàn)德蘭臭草都系統(tǒng)性地被內(nèi)生真菌侵染[22]。研究利用廣泛生長在天山北坡的德蘭臭草，分析新疆本地土壤重金屬鎘污染情況?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以德蘭臭草種子(E+)為對象，以高溫干熱獲取不帶菌種子(E-)，用不同濃度的CdCl2(5/2 H2O)對種子進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，研究Cd對(E+)(E-)種子萌發(fā)、植株生長生理及植株內(nèi)Cd含量的變化，為評價共生微生物增強(qiáng)植物重金屬耐性和重金屬Cd污染防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

德蘭臭草種子于2016年7月采自烏魯木齊縣小渠子鄉(xiāng)(N43°34′23.52″、E87°5′4.92″、H 1387 m)。選取大小均一、飽滿、色澤均勻、表皮光滑無損傷的種子。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用高溫干熱的方法獲得德蘭臭草不帶菌(E-)種子[23]。將得到的E+和E-種子先用自來水沖洗3～4次，2%的次氯酸鈉溶液振蕩8 min，蒸餾水沖洗數(shù)遍，再用75%的酒精清洗5 min，在超凈工作臺用無菌水清洗數(shù)遍待用。

采用濾紙發(fā)芽床法進(jìn)行種子萌發(fā)，運(yùn)用雙因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重金屬Cd脅迫，將CdCl2配成0、9、30、60、150、200、300 mg/L 7個濃度；內(nèi)生真菌感染狀況(E+和E-)，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個培養(yǎng)皿中放置50粒種子，持續(xù)15 d。分別向每個培養(yǎng)皿中加入10 mL不同濃度的CdCl2溶液，以加蒸餾水作為對照，逐日觀察種子發(fā)芽數(shù)(以胚芽長度達(dá)到種子一半為種子發(fā)芽的判斷標(biāo)準(zhǔn)[24])。

1.2.2 指標(biāo)測定

按照以下公式計(jì)算萌發(fā)率、發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)、根冠比、轉(zhuǎn)移系數(shù)、根系耐性系數(shù)：

萌發(fā)率=(15 d發(fā)芽的種子數(shù)/種子的總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢=(前5 d發(fā)芽的種子數(shù)/種子的總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)GI=∑Gt/Dt(Gt為不同時間發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù))；

活力指數(shù)VI=GI×S[25](式中：S為種苗的鮮重，GI為發(fā)芽指數(shù))；

根冠比=地下生物量/地上生物量[26]；

轉(zhuǎn)移系數(shù)=地上部分鎘含量/根部鎘含量[27]；

根系耐性系數(shù)=處理組根的平均長度/對照組根的平均長度[28]。

重金屬脅迫處理結(jié)束后，用直尺測量幼苗的芽長、根長；用分析天平稱量每個處理的鮮重、干重。用石墨爐原子吸收法(TAS-990)測定幼苗中的重金屬Cd含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，采用單因素方差分析檢驗(yàn)帶菌與不帶菌(E+與E-)種子間和Cd脅迫處理間的差異，采用雙因素方差分析檢驗(yàn)內(nèi)生真菌感染與Cd脅迫之間的交互作用，用Duncan法對同一指標(biāo)測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。采用Excel 2003進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫和內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

不同濃度的Cd脅迫對德蘭臭草種子的萌發(fā)指標(biāo)都有極顯著的影響(P<0.01)，內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)存在極顯著影響(P<0.01)，對活力指數(shù)存在顯著影響(P<0.05)。Cd脅迫與內(nèi)生真菌感染之間的交互作用對萌發(fā)指標(biāo)都存在極顯著影響(P<0.01)。表1

隨著Cd脅迫濃度的升高，德蘭臭草種子的萌發(fā)指標(biāo)均呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)脅迫濃度為30 mg/L時，E+和E-的發(fā)芽率和發(fā)芽勢都顯著高于對照(P<0.05)，且E+顯著高于E-(P<0.05)。當(dāng)脅迫濃度大于150 mg/L時，德蘭臭草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢普遍呈下降趨勢，且均顯著低于對照(P<0.05)，E+顯著高于同一脅迫濃度下的E-(P<0.05)。圖1，圖2

E+的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在30 mg/L濃度時均達(dá)到最大值，分別為54.91、7.39，且顯著高于對照(P<0.05)。E-的發(fā)芽指數(shù)在60 mg/L濃度時達(dá)到最大值，為50.19；E-的活力指數(shù)在30 mg/L濃度時達(dá)到最大值，為7.11，二者均顯著高于對照(P<0.05)。脅迫濃度在150 mg/L以上時的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著低于對照(P<0.05)。同一脅迫濃度下，除了60 mg/L，其余E+的發(fā)芽指數(shù)都顯著高于E-(P<0.05)。30 mg/L以上的脅迫濃度時，E+種子的活力指數(shù)顯著低于對照(P<0.05)。脅迫濃度低于150 mg/L時，E+種子的活力指數(shù)顯著高于同一濃度下的E-(P<0.05)。圖3，圖4

表1 內(nèi)生真菌感染和重金屬 Cd 脅迫處理對德蘭臭草影響的雙因素方差

Table1Two-wayANOVAoftheinfluenceofendophyteinfectionandCd2+stressonMelicatranssilvanica

變量Variable內(nèi)生真菌感染Endophyte infection鎘脅迫Cd2+ stress交互作用InteractionFSig.FSig.FSig.發(fā)芽率 Germination rate82.81**1 191.62**18.57**發(fā)芽勢 Germination potential76.00**280.88**12.04**發(fā)芽指數(shù) Germination index104.55**648.89**9.53**活力指數(shù) Vitality index7.41*487.75**6.75**芽長 Bud length112.26**4 620.05**49.12**根長 Root length28.17**1 613.90**10.613**幼芽鮮重 Bud fresh weight0.99NS352.18**13.40**幼根鮮重 Root fresh weight11.44**100.01**5.07**幼芽干重 Bud dry weight25.09**89.71**6.20**幼根干重 Root dry weight10.60**232.64**7.08**根冠比 Root-shoot ratio0.065NS57.41**25.589**幼芽重金屬Cd含量 Cd2+ content467.52**4 126.88**38.26**幼根重金屬Cd含量 Cd2+ content100.27**711.18**12.94**鎘轉(zhuǎn)移系數(shù) Cd transfer coefficient6.505*837.868**0.759NS根系耐性系數(shù) Root tolerance coefficient25.33**1 349.37**121.63**

注：NS表示差異不顯著，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)

Note: NS indicates that the difference is not significant,* indicates that the difference is significant(P<0.05), ** indicates that the difference is very significant(P<0.01)

圖1 不同濃度Cd脅迫下內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草種子發(fā)芽率變化

Fig.1 Effect of endophyte infection on germination rate ofMelicatranssilvanicaunderdifferentCd2+concentrations

圖2 不同濃度Cd脅迫下內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草種子發(fā)芽勢變化

Fig.2 Effect of endophyte infection on germination percentage ofMelicatranssilvanicaunderdifferentCd2+concentrations

圖3 不同濃度Cd脅迫下內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草種子發(fā)芽指數(shù)變化

Fig.3 Effect of endophyte infection on germination index ofMelicatranssilvanicaunderdifferentCd2+concentrations

圖4 不同濃度Cd脅迫下內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草種子活力指數(shù)變化

Fig. 4 Effect of endophyte infection on vitality index ofMelicatranssilvanicaunderdifferentCd2+concentrations

2.2 Cd脅迫和內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草幼苗生長的的影響

研究表明，不同濃度的Cd脅迫對德蘭臭草幼苗的生長指標(biāo)都有極顯著的影響(P<0.01)。內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草幼苗的芽長、根長、幼芽干重、幼根鮮重、幼根干重都具有極顯著的影響(P<0.01)，對活力指數(shù)和Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)具有顯著影響(P<0.05)，對幼苗的幼芽鮮重和根冠比沒有顯著影響(P<0.05)。Cd脅迫和內(nèi)生真菌感染的交互作用除對Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)沒有顯著影響外，對德蘭臭草幼苗其余的測定指標(biāo)都存在極顯著的影響(P<0.01)。

隨著脅迫濃度的升高，德蘭臭草幼苗的芽長都顯著低于對照(P<0.05)，根長除9 mg/L外，都顯著低于對照(P<0.05)。同一脅迫濃度下，E+芽長顯著高于E-(P<0.05)。9 mg/L脅迫濃度時，E+和E-根長都顯著高于對照，且E+高于E-，但二者之間不存在顯著性差異(P<0.05)。

當(dāng)脅迫濃度為9 mg/L時，E+幼芽鮮重和幼根鮮重都顯著高于對照(P<0.05)，而E-只有幼根鮮重顯著高于對照(P<0.05)；在30 mg/L的脅迫濃度時，E-的幼芽鮮重顯著高于對照(P<0.05)，且顯著高于E+(P<0.05)；幼根鮮重在60 mg/L的脅迫濃度時，E-顯著高于對照(P<0.05)，且顯著高于E+(P<0.05)；60 mg/L以上，幼芽和幼根鮮重都顯著低于對照(P<0.05)。

隨著脅迫濃度的升高，幼芽干重和幼根干重都呈現(xiàn)增加的趨勢，都顯著高于對照(P<0.05)。脅迫濃度在30 mg/L時，E-芽長干重大于E+，但二者之間不存在顯著性差異(P<0.05)。在脅迫濃度為60 mg/L時，E+的幼芽和幼根干重都顯著大于E-(P<0.05)。隨著脅迫濃度的增加，幼苗的根冠比呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，在脅迫濃度為9和60 mg/L時，E+的根冠比顯著低于E-(P<0.05)。脅迫濃度在150 mg/L及以下時，隨著脅迫濃度的升高，Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)逐漸增大，且任何兩個濃度之間都具有顯著性差異(P<0.05)。濃度小于150 mg/L時，E-的轉(zhuǎn)移系數(shù)高于同一濃度下的E+，但二者之間不存在顯著性差異(P<0.05)，當(dāng)脅迫濃度達(dá)到150 mg/L時，E-轉(zhuǎn)移系數(shù)顯著高于E+(P<0.05)。當(dāng)脅迫濃度為9 mg/L時，根系耐性系數(shù)>1。當(dāng)脅迫濃度為30 mg/L時，E+的根系耐性系數(shù)顯著高于E-(P<0.05)，其余濃度下，E+的根系耐性系數(shù)高于E-，但二者之間不存在顯著性差異(P<0.05)。表2

2.3 不同Cd2+處理下內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草幼苗中Cd2+含量的影響

不同濃度的鎘脅迫和內(nèi)生真菌感染都顯著影響了德蘭臭草幼苗中的Cd2+含量(P<0.05)，且二者之間的交互作用對德蘭臭草幼苗中的Cd2+含量具有極顯著的影響(P<0.01)，研究表明，不同脅迫濃度下，幼芽、幼根重金屬含量都顯著高于對照(P<0.05)。隨著脅迫濃度的升高，幼芽中的重金屬含量呈現(xiàn)增加的趨勢。同一脅迫濃度下，德蘭臭草幼根中的重金屬含量顯著高于幼芽(P<0.05)，幼芽E-顯著高于E+(P<0.05)。脅迫濃度小于150 mg/L時，E-幼根中的重金屬含量均顯著高于E+(P<0.05)。表3

3 討 論

3.1 Cd脅迫和內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

植物生長在重金屬污染的環(huán)境介質(zhì)中，會吸收過量的重金屬，從而對植物的膜系統(tǒng)造成一定程度的為害，進(jìn)一步會影響植物各細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能[29]。鎘是一種毒性很強(qiáng)的重金屬，高濃度的鎘脅迫會擾亂水分平衡、降低細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而抑制植物生長發(fā)育[30-31]。研究在對種子萌發(fā)指標(biāo)的評價中，發(fā)現(xiàn)在脅迫濃度低于30 mg/L時，種子的萌發(fā)指標(biāo)都高于對照，高濃度下強(qiáng)烈抑制種子萌發(fā)。這與劉雪云[32]、周秋峰[33]等得出的結(jié)論一致。周秋峰等[33]發(fā)現(xiàn)在25 mg/L Cd2+脅迫下，在一定程度上促進(jìn)小麥種子的萌發(fā)，高濃度脅迫對小麥種子萌發(fā)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用；劉雪云等[32]發(fā)現(xiàn)在1 mg/kg時，可以刺激天藍(lán)苜蓿的生長，高濃度Cd對天藍(lán)苜蓿產(chǎn)生了毒害作用，影響了呼吸作用和生長代謝。在低濃度脅迫下，植物可通過排斥、固定、抗氧化酶、絡(luò)合等達(dá)到解毒作用，重金屬離子可刺激金屬硫蛋白和植物螯合態(tài)的合成，從而促進(jìn)脅迫蛋白的合成與積累[34]。隨著脅迫濃度的升高，植物蛋白酶和淀粉酶的活性會受到抑制，從而植物代謝所需要的物質(zhì)和能量都會受到影響，最終會導(dǎo)致種子萌發(fā)受到抑制[35]。研究種子萌發(fā)指標(biāo)表現(xiàn)出"低促高抑"的現(xiàn)象，可能是因?yàn)榈蜐舛让{迫促進(jìn)了脅迫蛋白的合成與積累，高濃度脅迫抑制了植物所需的物質(zhì)和能量的合成，最終導(dǎo)致種子萌發(fā)收到抑制。

表3 不同Cd2+處理下內(nèi)生真菌感染下德蘭臭草幼苗中Cd2+含量變化

Table 3 Effects of endophyte infection on Cd2+ content of Melica transsilvanica under different Cd2+ concentrations

不同植株鎘含量(mg/kg)鎘處理 Cd2+ concentration (mg/L)093060150200300幼芽Bud dryE+-32.49±0.88k63.75±1.57i73.18±1.79h112.41±1.99d97.92±2.31e138.80±0.52aE--42.30±1.46i85.00±2.86g93.20±4.30f124.70±2.93b119.98±0.61c139.69±2.13a幼根Root dryE+-259.88±22.78d237.02±4.91e298.98±0.56c219.68±2.13e339.65±1.46b-E--312.78±12.41c309.19±6.83c368.93±1.53a232.15±1.36e--

注：同列、同行不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

Note: Different small letters in the same column and the same line indicate significant difference (P<0.05)

3.2 Cd脅迫和內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草幼苗生長的的影響

根系是植物吸收養(yǎng)分和水分的重要器官，其形態(tài)直接或間接影響地上部的生長和發(fā)育[36]。王喆和王強(qiáng)[37]研究指出，當(dāng)Cd對植物產(chǎn)生毒害作用時，會表現(xiàn)在根部的形態(tài)和生理功能的改變上。研究中當(dāng)脅迫濃度大于30 mg/L時，主根長度逐漸減小，達(dá)到200 mg/L以上時，主根不再生長。劉建新[38]在對玉米幼苗的研究中有相似的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)當(dāng)脅迫濃度大于50 mg/L時，根系長度減小。植物的根部直接接觸鎘溶液，吸收的鎘不易向地上部分運(yùn)輸而積累在根部，活性氧大量積累，導(dǎo)致膜脂過氧化和脫脂化，進(jìn)而影響細(xì)胞正常的生理功能[39]。研究中根冠比隨著Cd脅迫濃度的增加逐漸增大，且脅迫濃度達(dá)到150 mg/L以上時，幼芽的生長速率明顯高于幼根，表明根系吸收了大量的重金屬，阻礙了重金屬離子向地上部分的遷移，減少了對芽的損傷，最終導(dǎo)致根受抑制的程度大于芽的受抑制程度[40]。研究中隨著脅迫濃度的升高，無論是幼芽還是幼根，干物質(zhì)的量都呈現(xiàn)增加的趨勢，重金屬脅迫使宿主增加了干物質(zhì)的積累?？赡苁且?yàn)榉N子萌發(fā)時，胚根最先突破種皮，并始終完全與脅迫液接觸，導(dǎo)致其根尖細(xì)胞受到傷害，從而影響水分和養(yǎng)分的吸收及向上運(yùn)輸，從而影響幼芽、幼根伸長及造成干物質(zhì)的積累[41]。植物對重金屬的轉(zhuǎn)移系數(shù)表示植物對重金屬的轉(zhuǎn)移能力，與植物的生理生化等因素密切相關(guān)[42]。研究中，脅迫濃度在150 mg/L及以下時，隨著脅迫濃度的升高，Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)逐漸增大，到達(dá)地上部分的Cd越多，對地上部分的毒害作用越大。

有研究報道內(nèi)生真菌的侵染有效緩解了Cd毒害對醉馬草(Achnatheruminebrians)、披堿草(Elymusdahuricus)種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[43-44]。研究發(fā)現(xiàn)種子的萌發(fā)指標(biāo)及芽長、根長，E+顯著高于E-(P<0.05)，且E-的轉(zhuǎn)移系數(shù)高于E+，表明內(nèi)生真菌的侵染有效緩解了Cd對德蘭臭草種子萌發(fā)和生長的毒害作用。

3.3 不同Cd2+處理下內(nèi)生真菌感染對德蘭臭草幼苗中Cd2+含量的影響

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌感染會導(dǎo)致高羊茅植物根系分泌物中酚類物質(zhì)含量的增加[45]，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)高羊茅根系分泌物會使鋁、銅等重金屬的毒性顯著降低[46-47]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌侵染可以降低德蘭臭草E+幼苗中的Cd2+的含量。同一脅迫濃度下德蘭臭草幼根中的重金屬含量顯著高于幼芽，E-顯著高于E+(P<0.05)表明內(nèi)生真菌顯著降低了根系中鎘的含量，可能是因?yàn)閮?nèi)生真菌促進(jìn)德蘭臭草根部分泌了更多的酚類物質(zhì)，減少了鎘在根部的積累，進(jìn)一步降低了植株整體的鎘含量。

4 結(jié) 論

4.1 Cd脅迫濃度低于30 mg/L時，種子的萌發(fā)指標(biāo)均高于對照；脅迫濃度高于30 mg/L時，種子的各萌發(fā)指標(biāo)呈下降趨勢，脅迫濃度達(dá)到200 mg/L以上時，強(qiáng)烈抑制種子萌發(fā)。

4.2 隨著脅迫濃度的升高，無論是幼芽還是幼根，干物質(zhì)的量都呈現(xiàn)增加的趨勢，且Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)逐漸增大。

4.3 脅迫濃度小于150 mg/L時，E+的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)均顯著高于同一濃度下的E-(P<0.05)而且德蘭臭草幼根中的重金屬含量顯著高于同一濃度下的幼芽(P<0.05)，E-植株中的Cd含量顯著高于E+植株(P<0.05)。內(nèi)生真菌的侵染有效緩解了Cd對德蘭臭草種子萌發(fā)和生長的毒害作用，進(jìn)一步證實(shí)了共生微生物能增強(qiáng)宿主德蘭臭草對重金屬Cd的耐受性。