黃曲霉菌的分離鑒定及毒性試驗

徐洪濱 李四山 張鵬飛

（1.如皋市家畜改良站，江蘇如皋市 226500；2.如皋市畜牧獸醫(yī)站，江蘇如皋市 226500；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130）

黃曲霉毒素（aflatoxins）是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，包括B1，B2，G1，G2，P1，H1，GM，M1，M2，B2a和毒醇。黃霉毒素的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，b1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?。含有一個氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀╇p呋喃環(huán)和一個雙呋喃環(huán)。前者為與黃曲霉毒素的致癌性有關(guān)，后者是基本的毒性結(jié)構(gòu)。m1可以由黃曲霉毒素b1在體內(nèi)羥化衍生而成。黃曲霉毒素主要分子型包含b1，b2m1，m2，g1，g2，等。其中黃曲霉毒素m1和m2常在牛奶中被發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素b1的致癌性和毒性是最強的。

黃曲霉毒素g1，g2在紫外線照射下發(fā)綠色熒光，而黃曲霉毒素b1，b2則可以發(fā)藍色熒光。黃曲霉毒素的相對分子量為312～346。難溶于水，但較易溶于油，甲醇，丙酮等有機溶劑，但黃曲霉毒素不溶于石油醚，己烷和乙醚中。在中性溶液中，毒素較穩(wěn)定，在強酸性溶液中，毒素會稍有分解，在ph9-10的強堿溶液中，毒素分解迅速。其純品結(jié)晶后為無色，耐高溫，黃曲霉毒素b1的分解溫度為268℃。低濃度黃曲霉毒素在紫外線照射下會招到破壞。

土壤，動植物，各種堅果，特別是花生和核桃中可以發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。也被發(fā)現(xiàn)存在于玉米，通心粉，牛奶，奶制品，食用油中。食品中黃曲霉毒素在熱帶和亞熱帶地區(qū)經(jīng)常被檢測出。在我國1980年的記錄中，從17個省糧食中共檢測出黃曲霉1660株，其中廣西地區(qū)黃曲霉的檢出率為58%，是17個省份中最多的。黃曲霉毒素在我國多分布于華中，華南，華北，并且產(chǎn)毒量也大。而東北，西北地區(qū)相對較少。

1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。

在自然界中寄生曲霉（A 1 parasiticus）和黃曲霉（Aspergili us f lav us）可以產(chǎn)生黃曲霉毒素（Aflatoxin），黃曲霉毒素是它們的次生代謝產(chǎn)物。目前黃曲霉毒素已被發(fā)現(xiàn)有17種，其中分布最廣泛、含量最高、毒性最強的為黃曲霉毒素B1。通過實驗證明，黃霉菌產(chǎn)生的真菌霉素即黃曲霉素，是化學(xué)致癌物中，黃曲霉毒素是致癌性最強的物質(zhì)之一，主要損害肝臟功能并且具有強烈的致癌性、致畸性、致突變性，能引發(fā)肝癌、骨癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌等。由于黃曲霉素穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，破壞其溫度要達到280℃以上。

動物肝臟是黃曲霉毒素主要傷害的器官[14]。研究結(jié)果顯示，受到黃曲霉毒素傷害的肝臟，功能明顯下降，奶牛和家禽感染黃曲霉毒素時，產(chǎn)奶量和產(chǎn)蛋量都會下降，免疫力也會受到影響，病原微生物可以輕易感染機體。黃曲霉毒對幼齡的動物素傷害更大，長期對母畜投喂低濃度黃曲霉毒素的飼料，會導(dǎo)致胚胎內(nèi)的幼畜死亡。動物的消化系統(tǒng)功能、生育能力都會受到黃曲霉毒素的影響。奶牛的產(chǎn)奶量會因奶牛感染黃曲霉毒素下降，牛奶中還會含有黃曲霉毒素m1和m2[15]，食用會有很大危險。黃曲霉毒素污染飼料，再投喂家畜，使美國畜牧業(yè)每年至少因此遭受10%的經(jīng)濟損失。在我國，黃曲霉毒素污染飼料對畜牧業(yè)造成的損失更大。

黃曲霉毒素污染的食物被人們食用后，會對人體造成很大的傷害。黃曲霉的污染很難預(yù)防，因為真菌在食物中普遍存在。國家衛(wèi)生部門制定相關(guān)的標準，防止被污染的糧食用于食品加工。但如食品中黃曲霉毒素含量低于標準則很難控制。在發(fā)展中國家，食用被黃曲霉毒素污染的食品常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究機構(gòu)的研究工作表明，肝細胞癌變（liver cell cancer，lcc）多由食用被黃曲霉污染的食品導(dǎo)致，發(fā)病率在亞洲和非洲較高。肝癌，胃癌，腸癌等疾病是長時間食用被黃曲霉污染的食品的極端結(jié)果。1988年，黃曲霉毒素b1被國際腫瘤研究機構(gòu)（international agency for research on cancer，iarc）列為可以導(dǎo)致人體癌變的物質(zhì)。此外，黃曲霉毒素的致癌性可以疊加，其他致癌因素與黃曲霉毒素疊加后致癌性會更強。

黃曲霉毒素主要損害人體的肝臟，病患會有肝炎，肝硬化等癥狀。臨床表現(xiàn)有胃部不適，食欲減退，惡心，嘔吐，腹脹及肝區(qū)觸痛等；嚴重者出現(xiàn)水腫，昏迷，以至抽搐而死。目前的研究表明黃曲霉毒素是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的最強的致癌物質(zhì)，其致癌力比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍，比3，4苯并芘大4000倍。黃曲霉毒素主要誘使動物發(fā)生肝癌，胃癌，腎癌，直腸癌等。

本實驗從霉變花生上分離下的疑似霉菌菌絲接種于察氏培養(yǎng)基中，通過對菌落顏色、形態(tài)的觀察和鏡檢，初步篩選黃曲霉霉菌，然后與黃曲霉菌標準菌株3.4408對照確定為黃曲霉菌。制得含黃曲霉毒素的懸濁液，后進行體外淋巴細胞增殖試驗，通過黃曲霉毒素感染淋巴細胞，與增值組、抑制組、實驗組對照，最終求得黃曲霉毒素對淋巴細胞的抑制率。證明黃曲霉毒素對細胞具有極大的殺傷力，在生產(chǎn)生活中對黃曲霉菌的污染應(yīng)該加強控制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

兔

1.2 培養(yǎng)基

察氏培養(yǎng)基（硝酸鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，氯化鉀，硫酸亞鐵，蔗糖）

1.3 材料與藥品

花生，肝素，75%酒精，蒸餾水，無菌水，生理鹽水。

1.4 儀器與設(shè)備

紫外燈，試管，錐形瓶，高壓滅菌鍋，溫箱，接種環(huán)，培養(yǎng)皿，移液器，移液管，報紙，玻璃棒，無菌操作臺，注射器，針頭。

2 實驗方案

2.1 黃曲霉菌的培養(yǎng)、分離和鑒定

2.1.1 黃曲霉菌的初培養(yǎng)及初步篩選

將干燥的花生放于陰暗潮濕處，潑上適量水，放置3周，使其霉變。待霉菌長出后觀察霉菌孢子和菌絲顏色，挑選少量黃色菌絲鏡檢，若鏡檢下，菌絲呈分隔狀，分生孢子頭呈連珠狀，且可見孢子梗上有孢子囊，囊上有分生孢子梗，梗上有分生孢子，整個孢子的形態(tài)呈球拍狀。則可初步判斷為黃曲霉菌。

2.1.2 黃曲霉菌的分離及鑒定

將疑似霉菌接種于察氏培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)6天，再次使用劃線分離法進行菌株的分離，并與黃曲霉菌標準菌株3.4408對照[16]，在熒光顯微鏡下進行觀察，通過觀察到的菌株形態(tài)來判斷疑似菌株是否為黃曲霉菌株。若菌落正面色澤隨其生長由白色變?yōu)辄S色及黃綠色，呈半絨毛狀。孢子成熟后顏色變?yōu)楹稚?，孢子表面平坦或有放射狀溝紋，觀察孢子反面無色或者褐色，在低倍顯微鏡下觀察可見分生孢子頭呈疏松放射狀，繼而為疏松柱狀。制片鏡檢觀察，可見分生孢子梗很粗糙。頂囊呈燒瓶形或近球形。分生孢子在小梗上呈鏈狀著生，分生孢子的周圍有小突起、球形、粗糙。則可判定其為黃曲霉菌。將已鑒定的培養(yǎng)至第6天的培養(yǎng)基倒置于紫外燈（波長360nm，125w）下觀察，菌落周圍的培養(yǎng)基中出現(xiàn)特殊的熒光，即為產(chǎn)黃曲霉毒素的陽性菌株。

2.2 黃曲霉的純化

將黃曲霉菌株接種于察氏培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5d。取平板上的單個菌落接種于察氏斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5～6d。多次反復(fù)接種純化，然后保存純種菌株。

2.3 黃曲霉毒素的粗提

在無菌室內(nèi)操作，在培養(yǎng)的黃曲霉菌培養(yǎng)基中加入10ml無菌生理鹽水，制成菌懸液。將菌懸液加入培養(yǎng)瓶中，置于28-30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，相對濕度為85%～94%，培養(yǎng)3d。降溫為25℃，培養(yǎng)3d，得含毒培養(yǎng)乳，將以上步驟所得含毒乳用生理鹽水稀釋，制得含黃曲霉毒素的懸濁液。

2.4 毒性試驗

2.4.1 兔外周血淋巴細胞的分離和培養(yǎng)

（1）采血

每次實驗均采5ml兔外周血液，添加1ml肝素（5%枸櫞酸鈉溶液抗凝劑），加入10ml的塑料離心管中。

（2）外周血淋巴細胞的分離和純化

取5ml肝素抗凝的兔外周血，加入一倍（5ml）的PBS液稀釋，輕輕搖勻。將稀釋的血液沿管壁加入已盛有5ml淋巴細胞分離液的離心管中，保持界面清晰，2000r/min離心20min。用取樣槍伸至單個核細胞層（白色狹帶）沿管壁吸出全部單核細胞移入另一離心管中離心，2000r/min離心15min。倒掉上層清液，加入37℃預(yù)熱的PBS液（約為懸液量的五倍）洗滌2次。第一次2000r/min離心15min；第二次2000r/min離心10min。洗滌后的淋巴細胞團用無菌的 RPMI1640 培養(yǎng)液吹散混勻，于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4.2 淋巴細胞的鏡檢和計數(shù)

為了驗證淋巴細胞的成活狀況，用取樣槍吸取分離出來的家兔外周血淋巴細胞100μl，用 PBS 緩沖液 10 倍系列稀釋，經(jīng)吉姆薩染色，在普通顯微鏡下觀察形態(tài)，計數(shù)每1ml細胞懸液中的淋巴細胞數(shù)。同時取 50μl 細胞懸液滴在計數(shù)板上，加臺盼藍溶液50μl 充分混勻，3～5min 內(nèi)在顯微鏡下觀察，計算出活淋巴細胞的百分率?；盍馨图毎俜致?（淋巴細胞總數(shù)-死亡淋巴細胞總數(shù)）/淋巴細胞總細胞數(shù)×100%。

2.4.3 體外淋巴增值細胞試驗

在無菌96孔細胞培養(yǎng)板中，設(shè)增值組（100μl淋巴細胞液+100μl刀豆+100μl1640培養(yǎng)液）、抑制組（100μl淋巴細胞液+100μl環(huán)孢霉素A+100μl1640培養(yǎng)液）、空白組（100μl淋巴細胞液+200μl1640培養(yǎng)液）、實驗組（100μl淋巴細胞液+100μl黃曲霉素+100μl1640培養(yǎng)液），所有實驗設(shè)定三個重復(fù)孔。將培養(yǎng)板在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)箱孵育24h后，每孔加入10μlCCK-8溶液，將培養(yǎng)板再孵育4h，用酶標儀570nm波長測定OD值。計算淋巴細胞抑制率。抑制率=（空白組-實驗組）/空白組×100%

3 實驗結(jié)果

3.1 培養(yǎng)及鑒定

從堆放在陰暗潮濕處的花生、大米和玉米中挑取疑似黃曲霉菌絲接種在察氏培養(yǎng)基，在30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d后，可見菌落直徑達7cm，菌落顏色為淡黃色，1～2d之后變?yōu)辄S綠色，兩周左右顏色變暗，平坦略有放射狀溝紋，反面無色或帶褐色。低倍鏡下可觀察到菌絲分隔現(xiàn)象，孢子頭部呈疏松放射狀，1～2d后變?yōu)槭杷芍鶢?，為典型的分生孢子。分生孢子梗多從基質(zhì)生出，長度一般小于1mm。有些會菌絲產(chǎn)生帶褐色的菌核，見圖1。

挑選典型的黃曲霉菌菌絲做進一步純培養(yǎng)，勾取少量菌絲鏡檢，如圖2?？梢?，菌絲呈分隔狀，分生孢子頭呈連珠狀，且可見孢子梗上有孢子囊，囊上有分生孢子梗，梗上有分生孢子，分生孢子的周圍有小突起、球形、粗糙，整個孢子的形態(tài)呈球拍狀，與黃曲霉菌標準菌株3.4408對照。

圖1 黃曲霉菌菌落

圖2 黃曲霉菌形態(tài)學(xué)觀察

3.2 兔外周血淋巴細胞的分離

在顯微鏡下淋巴細胞的形態(tài)為小圓核狀，細胞核較大，胞質(zhì)較少，有的相互疊加。經(jīng)細胞計數(shù)板計數(shù)，計算得出兔外周血淋巴細胞的細胞數(shù)為 2.5×106個/ml，活細胞百分率為 96.8%。

3.3 淋巴細胞OD值

表1 淋巴細胞OD值

實驗測得淋巴細胞抑制率為35.3%。

4 討論

目前的研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素至少有20 種左右結(jié)構(gòu)相似的化合物，如黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2及毒醇等，在糧食和食品中黃曲霉毒素主要存在形式為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1及 M2，在眾多的黃曲霉毒素化合物中，黃曲霉毒素 B1的毒性和致癌性是最強。1993 年，世界衛(wèi)生組織（WHO）癌癥研究機構(gòu)通過研究調(diào)查將黃曲霉毒素劃定為一類致癌物質(zhì)，主要傷害的器官是肝臟，引起肝癌以及肝臟的其他病變。黃曲霉菌的適宜生長溫度在12℃～42℃，相對濕度在 80%～85%。在環(huán)境溫度處于24℃～30℃之間時，黃曲霉毒素的產(chǎn)出量最高，并且在之后的兩條黃曲霉高速生長并且產(chǎn)毒量不管提升，產(chǎn)生黃曲霉毒素的條件有干燥、低溫或黃曲霉與其他霉菌競爭應(yīng)激情況時。黃曲霉毒素是從作物生長的初期，就會對其造成污染，在農(nóng)作物收割后糧食的污染通常是由于不良儲藏條件（如陰暗）和作物含水量過高所引起，環(huán)境溫度過高以及環(huán)境潮濕會是黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉。多數(shù)植物能夠被黃曲霉毒素污染，如植物性食物，最易受黃曲霉毒素污染的食物有玉米和花生，堅果類食物的果仁也常常受到黃曲霉的污染。

黃曲霉毒素毒性相當(dāng)于氰化鉀的 10 倍，砒霜的 68 倍，毒性非常強危害很大，尤其作用于人和動物的肝臟和腎臟。黃曲霉毒素毒素污染食品被人類食用后，可誘發(fā)人體的原發(fā)性肝癌、胃癌及肺癌等，從感染黃曲霉毒素到檢出癌變最短僅需24周，而且如人體本身攜帶乙肝病毒，在接觸黃曲霉毒素后，患肝癌的概率是常人的 60 倍。農(nóng)作物生長、收獲、加工和儲藏的任何環(huán)節(jié)都可能被黃曲霉毒素污染，如玉米、花生、大豆、大米、食用植物油及飼料等農(nóng)產(chǎn)品，并且通過人和動物的食用進入食物鏈，傷害人體以及動物并且污染動物產(chǎn)品如牛奶等。

本實驗從發(fā)霉花生中提取出黃曲霉，并通過實驗室提供適宜條件使黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素，最終通過體外淋巴細胞實驗得出淋巴細胞抑制率，得到黃曲霉毒素對淋巴細胞有強烈抑制作用的結(jié)論。體外淋巴細胞實驗的增值組中刀豆素為促細胞有絲分裂素，主要對淋巴細胞有激發(fā)作用，抑制組中的環(huán)孢霉素主要對淋巴細胞有抑制作用。通過對比抑制組與實驗組，可以得出結(jié)論黃曲霉毒素可以抑制淋巴細胞的生長，并且通過OD值的計算可以得到淋巴細胞的抑制率。

由于實驗室可提供條件有限以及淋巴細胞體外培養(yǎng)時很容易死亡，所以實驗數(shù)據(jù)存在誤差，希望在以后的學(xué)習(xí)研究中可以進一步探索完善實驗。

[1] 徐華坤.云南省部分奶源地原奶中黃曲霉毒素M1與飼料中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的相關(guān)性研究[D].昆明醫(yī)科大學(xué)，2013.

[2] 高博，王艷，陳霄，曹云恒，等.貴州省辣椒制品中黃曲霉毒素B1的污染調(diào)查[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，1（15）：141-142.

[3] 張自強，柏凡，張克英，等.我國飼料中黃曲霉毒素B1污染的分布規(guī)律研究[J].中國畜牧雜志，2009，6（12）：27-28.