低氧訓練誘導miR-27/PPARγ調控肥胖大鼠肝臟脂肪酸代謝變化的研究

朱 磊，路瑛麗，馮連世

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低氧訓練誘導miR-27/PPARγ調控肥胖大鼠肝臟脂肪酸代謝變化的研究

朱 磊1，路瑛麗2，馮連世2

1.曲阜師范大學,山東 曲阜 273165；2.國家體育總局體育科學研究所,北京 100061

目的：探討低氧訓練對肥胖大鼠肝臟中miR-27/PPARγ及其下游脂肪酸代謝相關基因、蛋白表達水平的時序性影響。方法：13周齡雄性SD肥胖大鼠50只隨機平均分成5組（n=10×5）：低氧對照組(C組)、低氧訓練1周組（E1組）、低氧訓練2周組（E2組）、低氧訓練3周組（E3組）和低氧訓練4周組（E4組），所有訓練組用水平跑臺進行耐力訓練，訓練強度常氧25 m/min，低氧20 m/min（低氧濃度13.6%），持續(xù)運動1 h/天、5天/周，共4周。檢測血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平；實時熒光定量PCR檢測miR-27、PPARγ基因表達，Western Blot和免疫組化檢測PPARγ、CD36、ATGL、LPL、L-FABP、SREBP1蛋白表達水平。結果：4周低氧訓練過程中，肥胖大鼠脂體比、TC、TG和LDL-C濃度逐步降低，而HDL-C逐步升高；伴隨著低氧訓練時間的延長，肥胖大鼠肝臟中miR-27表達逐步降低，其中，E3和E4組極顯著高于其余各組(≤0.01)；與之相反，PPARγ、CD36、ATGL、LPL的表達逐步升高，其中E4組CD36表達量顯著高于C組(≤0.05)，C組AGTL表達量顯著低于E2組(≤0.05)，且極顯著低于E3和E4組(≤0.01)，C組LPL表達量顯著低于E2和E3組(≤0.05)，而極顯著低于E4組(≤0.01)；L-FABP表達量在E1組最高，顯著高于C組(≤0.05)；SREBP1表達量無顯著變化(≥0.05)。結論：肥胖大鼠肝臟miR-27表達與低氧訓練時間呈現(xiàn)負相關，低氧訓練通過miR-27影響PPARγ及其下游脂肪酸代謝相關靶基因和靶蛋白的表達，改善血脂水平，最終機體脂含量伴隨低氧訓練時間的延長而逐漸下降。

低氧訓練；miR-27；PPARγ；肥胖；大鼠

世界衛(wèi)生組織（WHO）2014年公布的數據顯示，全球18歲及其以上的成年人中約有19億人超重，肥胖人群大約6億，肥胖及其并發(fā)癥嚴重威脅人類健康。國內、外研究結果一致表明，低氧訓練不僅具有降低體重和體脂的作用[9,12]，而且可以調節(jié)人體機能，預防和治療肥胖引起的心血管和脂代謝紊亂等相關疾病，降低患病風險[35,38]。最近研究認為，miRNA與脂代謝密切相關，通過調節(jié)脂類合成、運輸、分解、氧化等關鍵酶轉錄后水平的表達調控脂代謝，已經成為脂代謝機制的研究熱點[23,33,49]。其中，miR-27可以調控其靶基因PPARγ水平，進而影響下游脂肪酸代謝相關基因和蛋白表達，并最終影響機體脂代謝過程[19,45,54]。

由于肝臟組織在機體脂肪酸代謝過程中占據重要位置，因此，目前對于肝臟組織中miR-27調控脂肪酸代謝水平的研究相對較多。但是，低氧訓練對肝臟組織內miR-27表達量的時序性影響，及其低氧訓練刺激miR-27調控PPARγ影響機體脂肪酸代謝水平的研究較少。

本研究通過觀察低氧訓練4周過程中肥胖大鼠肝臟組織miR-27/PPARγ及其下游脂肪酸代謝相關基因、蛋白表達量的時序性變化，探討低氧訓練減脂降體重的分子學機制，以期將低氧訓練作為預防與控制脂代謝相關疾病的干預手段，為科學制定減脂降重、治療脂代謝紊亂方案提供理論依據。

1 研究材料與方法

1.1 實驗對象

SPF級5周齡雄性Sprague Dawley（SD）大鼠200只，體重176.47±10.75 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001，飼養(yǎng)人員證書編號：1115032300009。隨機分為兩組：20只普通飼料喂養(yǎng)，體重176.26±10.62 g，180只高脂飼料（D12451，research diets公司，美國）喂養(yǎng)，體重176.54±10.80 g，兩組大鼠體重無顯著差異。國家體育總局體育科學研究所ABSL-3級動物房飼養(yǎng)，自由飲食，室溫22±1oC，濕度55%±2%，動物房裝有晝夜明暗交替照明系統(tǒng)，每12 h輪轉照明。

1.2 肥胖動物模型構建

高脂飼料喂養(yǎng)8周后，從高脂飼料組隨機抽取20只SD大鼠與20只普通飼料組進行對比，若高脂飼料組大鼠平均體重、脂體比和Lee’S指數顯著升高，且血清中TC、TG、LDL-C顯著升高，而HDL-C顯著降低，判定肥胖動物模型構建成功。從高脂飼料組挑選體重超過對照組平均體重20%的SD大鼠作為實驗對象。

1.3 實驗分組與運動方案

挑選出建模成功的SD大鼠共97只。進行1周的適應性訓練（速度從16 m/min梯度遞增到25 m/min，運動時間從20 min/天遞增到60 min/天）。根據實驗大鼠對跑臺訓練適應情況，選取50只均分成5組（n=10，各組體重無顯著差異）：低氧對照組(C組)、低氧訓練1周組（E1組）、低氧訓練2周組（E2組）、低氧訓練3周組（E3組）和低氧訓練4周組（E4組），所有訓練組用水平跑臺進行低氧耐力訓練（20 m/min，低氧濃度13.6%，相當于海拔3 500 m），持續(xù)運動1 h/天、5天/周。

1.4 實驗取材

各組大鼠依據實驗設計訓練周期進行跑臺訓練，最后一次訓練后恢復24 h后取材。取材前大鼠禁食12 h，按0.3 mL/100 g體重的劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，測量體長，稱量體重；迅速將大鼠固定于有冰塊的取材板上，打開腹腔，腹主動脈取血，分離血清；取肝右葉上緣，快速在預冷的生理鹽水中漂洗去血，濾紙吸干水分，液氮速凍，而后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）和蛋白質印跡法（Western Blot）檢測。取右側腎周脂肪和附睪脂肪，快速在預冷的生理鹽水中漂洗去血，濾紙吸干水分，電子天平稱重。

1.5 生理生化指標檢測

根據大鼠腎周脂肪重量、附睪脂肪重量和體重計算脂體比；半自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）濃度。

1.6 QRT-PCR

超低溫冰箱取100 mg左右肝臟組織，放入盛有液氮的研缽中粉碎，嚴格按照Trizol法提取肝臟組織總RNA。OD260/OD280檢測提取總RNA的純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.6.1 檢測mRNA的表達

嚴格按照試劑盒（RR370A，Takara生物公司）說明書反轉錄生成cDNA，反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保持，-20℃冰箱保存待測。以合成的cDNA為模板，β-actin為內參，每個樣本設計3個復孔，嚴格按照試劑盒（RR8200A，Takara生物公司）說明書在實時熒光定量PCR儀（ABI 7300）進行檢測。反應條件：第1步預變性（95℃ 30 s）；第2步PCR反應（95℃ 5 s，60℃ 31 s，共40個循環(huán)）。

1.6.2 檢測miRNA的表達

嚴格按照試劑盒（購于北京天根生化科技有限公司）說明書反轉錄生成cDNA。以合成的cDNA為模板，U6為內參，每個樣本設計3個復孔，嚴格按照試劑盒（購于北京天根生化科技有限公司）說明書在實時熒光定量PCR儀（ABI 7300）進行檢測。反應條件：第1步預變性（94℃ 2 min）；第2步PCR反應（94℃ 20 s，63℃ 20 s，72℃ 30 s，共5個循環(huán)）；第3步PCR反應（94℃ 20 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)）。

熒光定量PCR得到各待測樣本的值，求3個重復樣本平均CT值，據此計算△△Ct值：△△Ct=（Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因）。而后計算出各待測樣本2-△△Ct值，即各待測樣本相對表達量。

實驗所用引物均由上海生物工程有限公司設計和合成，序列如表1所示。

表1 Real-Time PCR引物序列

1.7 Western-Blotting

超低溫冰箱取100 mg左右肝臟組織，放入盛有液氮的研缽中粉碎，加入蛋白裂解液和蛋白酶（購自碧云天公司生物技術有限公司）。離心后采用BCA法檢測樣本蛋白濃度，去離子水和緩沖液調整所有樣本濃度為4 μg/μl，沸水加熱10 min蛋白質變性后置于-20℃冰箱待測。采用10%膠120 V恒壓電泳1.5 h，200 mA恒流轉膜1 h。5%脫脂奶粉（購于美國BD公司）封閉PVDF膜（購自Millipore公司）1 h，而后加入一級抗體置于搖床4℃過夜，TBST洗滌后加入二級抗體室溫孵育1 h。TBST洗膜后加入發(fā)光液于暗室中顯影、定影。掃描膠片后利用Quantiy One軟件分析分析蛋白條帶灰度值，求目的蛋白與內參蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計分析

2 實驗結果

2.1 低氧訓練對肥胖大鼠生理生化指標的時序性影響

C組肥胖大鼠血清TC濃度顯著高于E2組和E4組（＜0.05），E3組肥胖大鼠血清TC濃度極顯著低于C組和E1組（＜0.01）；C組肥胖大鼠血清TG濃度極顯著高于其余各組（＜0.01）；E4組肥胖大鼠血清LDL-C濃度極顯著低于其余各組（＜0.01）；C組肥胖大鼠血清HDL-C濃度顯著低于E2組（＜0.05），且極顯著低于E1組、E3組和E4組（＜0.01），E4組大鼠血清HDL-C濃度極顯著高于E2組（＜0.01）。E2組肥胖大鼠脂體比顯著低于C組（＜0.05），E4組肥胖大鼠脂體比極顯著低于C組（＜0.01），且顯著低于E1組和E3組（＜0.05）。

2.2 低氧訓練對肥胖大鼠肝臟miR-27、PPARγ表達的時序性影響

E3組肥胖大鼠肝臟miR-27表達量極顯著低于C組、E1組和E2組（＜0.01）；E4組肥胖大鼠肝臟miR-27表達量極顯著低于C組、E1組和E2組（＜0.01）。E2組肥胖大鼠肝臟PPARγ mRNA表達量顯著高于E1組（＜0.05），且極顯著高于C組（＜0.01）；E4組肥胖大鼠肝臟PPARγ mRNA表達量顯著高于C組（＜0.05）。C組肥胖大鼠肝臟PPARγ蛋白表達量顯著低于E1組（＜0.05），且極顯著低于E3組和E4組（＜0.01）；E2組肥胖大鼠肝臟PPARγ蛋白表達量顯著低于E4組（＜0.05）。

表2 各組肥胖大鼠生理、生化指標

注：單因素方差分析各指標F值和P值，Bonferroni法比較分析組間差異，將α設置為0.05作為顯著性水平。

圖1 各組肥胖大鼠肝臟miR-27和PPARγ相對表達量

Figure 1. Diagram of Relative of miR-27 and PPARγ in the obesity rat liver

注：單因素方差分析顯示，miR-27相對表達量存在組間差異性，=17.00，=0.000；PPARγ mRN相對表達量存在組間差異性，=3.94，=0.008；PPARγ/β-actin的相對表達量存在組間差異性，=3.42，=0.016。Bonferroni法比較分析組間差異，將α設置為0.05作為顯著性水平。*表示兩組間均值差異顯著（＜0.05）；**表示兩組間均值差異極顯著（＜0.01），下同。

2.3 低氧訓練對肥胖大鼠肝臟脂肪酸代謝相關基因表達的時序性影響

伴隨著低氧訓練時間的延長，肥胖大鼠肝臟CD36、ATGL、LPL和L-FABP蛋白表達量逐漸升高。其中，C組肥胖大鼠肝臟CD36蛋白表達量顯著低于E4組（＜0.05）。C組肥胖大鼠肝臟ATGL蛋白表達量顯著低于E2組（＜0.05），且極顯著低于E3組和E4組（＜0.01）；E4組肥胖大鼠肝臟ATGL蛋白表達量顯著高于E1組和E2組（＜0.05）。C組肥胖大鼠肝臟LPL蛋白表達量顯著低于E2組和E3組（＜0.05），且極顯著低于E4組（＜0.01）。E組肥胖大鼠肝臟L-FABP蛋白表達量最高，且顯著高于C組（＜0.05）。此外，伴隨著低氧訓練時間的延長，各組肥胖大鼠肝臟SREBP1蛋白表達量均值組間差異無顯著性。

圖2 肥胖大鼠肝臟CD36、ATGL、LPL、L-FABP和SREBP1蛋白相對表達量

Figure 2. Diagram of Relative of CD36，ATGL，LPL，L-FABP and SREBP1in the obesity rat liver

注：單因素方差分析顯示，CD36/β-actin存在組間差異性，=9.86，=0.004；ATGL/β-actin存在組間差異性，=5.13，=0.002；LPL/β-actin存在組間差異性，=3.15，=0.023; L-FABP/β-actin存在組間差異性，=10.7，=0.000; SREBP1/β-actin存在組間差異性，=5.47，=0.001。

3 分析與討論

3.1 低氧訓練對肥胖大鼠生理生化指標的時序性影響

有研究報道高原訓練或人工低氧環(huán)境能夠降低人體體重和體脂[1,7]，以大鼠為研究對象也得到了相似的研究結論[20,31]。Lu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，經過4周的低氧訓練，大鼠體重、體脂重量和脂體比均出現(xiàn)極顯著降低。本實驗大鼠經過4周低氧訓練，脂體比也呈現(xiàn)同樣的變化趨勢。王寧琦等[9]通過實驗模擬海拔2 600～2 800 m高度氧氣環(huán)境，觀察4周低氧運動對于青少年減肥的效果，結果顯示，經過4周低氧訓練，受試者的體重、腰圍、BMI、體脂和體脂百分比均顯著低于實驗前水平，血清中TC、TG、LDL-C顯著低于實驗前水平，而HDL-C水平與實驗前相比升高了5.71%。此外，實驗結果還顯示，低氧訓練第3周肥胖大鼠脂體比不同于之前的變化趨勢，而是出現(xiàn)相反的變化，而這一變化在低氧訓練4周消失，脂體比再次與之前的變化趨勢一致，造成這一現(xiàn)象的原因可能是機體對于低氧訓練適應而形成的短暫性反饋，具體機制有待于進一步深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著低氧訓練時間的延長，肥胖大鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，而HDL-C水平出現(xiàn)顯著升高。大部分相關實驗研究也得出了類似的結果：低氧、訓練和低氧訓練均可導致機體血清TC、TG和LDL-C水平下降而HDL-C水平升高，進而改善肥胖機體的血脂水平。馬延超等[6]將SD大鼠低氧訓練4周后，發(fā)現(xiàn)血清中TC、TG和LDL-C水平降低，提示低氧訓練具有降血脂的作用。但是，該研究與本實驗不同之處在于：本實驗結果顯示伴隨著低氧訓練時間的延長，大鼠血清HDL-C水平呈現(xiàn)上升趨勢，而馬延超等的實驗結果顯示，SD大鼠經過4周的低氧游泳訓練，HDL-C也呈現(xiàn)下降趨勢，造成這一結果的不同可能是因為兩個研究所采用的運動強度不同。

3.2 低氧訓練對肥胖大鼠肝臟miR-27、PPARγ表達的時序性影響

miRNA與脂代謝密切相關，通過調節(jié)脂類合成、運輸、分解、氧化等關鍵酶轉錄后水平的表達調控脂代謝，已經成為脂代謝機制的研究熱點[33,49]。目前報道與脂代謝密切相關的有miR-27[50]、miR-370[39]、miR-122[29]、miR-33[21]、miR-143[30]、miR-378[17]等。而miR-27是迄今為止發(fā)現(xiàn)的和人類脂肪細胞分化相關性最強的miRNA之一。Vickers等[27]利用基因芯片篩選了肝臟中大約150種miRNA，結果發(fā)現(xiàn)，無論是人類還是鼠類，miR-27都是最高效的脂質代謝調控因子。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-27模擬物降低了循環(huán)中的脂肪酸濃度，減少了脂肪在體內的堆積，被認為是改善血脂和減輕肥胖潛在的治療靶點[52]。查閱有關文獻發(fā)現(xiàn)，目前沒有低氧訓練影響miR-27水平的相關研究和報道。本實驗結果表明，低氧訓練調低肥胖大鼠肝臟miR-27的表達水平，且這種變化隨著低氧訓練時間的延長呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。隨著低氧訓練時間的延長，miR-27的表達進行性降低，與血液中TC、TG、LDL-C和脂體比的變化趨勢一致，而與HDL-C的變化趨勢相反。這提示，miR-27可能參與了低氧訓練調控的脂肪酸代謝和脂肪形成過程。與本研究一致，多項研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪形成后，miR-27的表達呈現(xiàn)出逐漸降低的變化趨勢。miR-27則可進一步通過下游調節(jié)因子，阻礙脂肪的進一步生成，并且抑制脂肪細胞的分化[22,37]。

PPARγ作為脂肪代謝的關鍵轉錄因子，調控脂肪細胞分化、脂肪酸代謝和膽固醇代謝，與肥胖的發(fā)生發(fā)展密切相關。熒光素酶報告基因分析，miR-27與PPARγ的3’UTR特異結合，抑制PPARγ的表達，證明PPARγ是miR-27的靶基因[36]。miR-27在脂肪生長過程中發(fā)揮負向調節(jié)作用，過表達miR-27通過抑制PPARγ的表達，抑制脂肪生成和分化而不影響成肌分化，且抑制作用發(fā)生在分化的早期[16,40]。目前研究表明，低氧和訓練均可以引起脂肪和肌肉組織中PPARγ表達水平的變化，Lui等[43]的實驗研究發(fā)現(xiàn)，處于高緯度低氧環(huán)境中的鹿鼠腓腸肌中PPARγ mRNA表達量是低緯度鹿鼠的2倍，而且，PPARγ蛋白的表達量也同樣呈現(xiàn)出高緯度大于低緯度鹿鼠的差異。實驗還發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境可以升高鹿鼠腓腸肌中PPARγ蛋白的表達水平。禹尚美[8]探討了低氧及低氧訓練對脂肪代謝的影響，實驗選取8周齡雄性SD大鼠作為研究對象，隨機分成對照組、訓練組、低氧組和低氧訓練組，氧分壓12.5%的低壓氧艙12 h/天，跑臺訓練坡度為10°，速度25 m/min，每周訓練5天，每天訓練60 min，3周后發(fā)現(xiàn)各組間脂肪組織中PPARγ的表達量無顯著差異。本實驗也出現(xiàn)相同的結果，低氧訓練3周后，PPARγ蛋白表達量與低氧對照組無顯著性差異。此外，本實驗還檢測了其他訓練時間點肥胖大鼠肝臟PPARγ mRNA和蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)伴隨著低氧訓練時間的延長，PPARγ mRNA和蛋白表達量總體呈現(xiàn)上升趨勢。與本實驗結果相似，Liu等[41]通過實驗發(fā)現(xiàn)，30天的自主訓練可以顯著提高C57Bl/6J小鼠結腸中PPARγ的表達水平。Song等[24]的實驗發(fā)現(xiàn)，無論是4周的訓練還是1周的預適應，大鼠肝臟中PPARγ基因和蛋白表達水平均顯著升高。Lu等[42]構建雄性SD大鼠肥胖模型，經過8周訓練后發(fā)現(xiàn)，小強度、中等強度和大強度訓練均可以升高大鼠血漿中PPARγ濃度，且3種訓練強度組大鼠脂肪組織中PPARγ mRNA表達水平均顯著高于低氧對照組。Szostak等[25]實驗發(fā)現(xiàn)，3個月的訓練顯著增加了小鼠主動脈PPARγ的表達水平。

3.3 低氧訓練對肥胖大鼠肝臟脂肪酸代謝相關基因、蛋白表達的時序性影響

PPARγ在肝臟、脂肪和骨骼肌中均可表達，目前研究多集中于PPARγ在脂肪組織和肌肉組織中的表達。PPARγ在脂肪組織中表達豐度非常高，多個脂肪酸轉運和代謝的基因在轉錄水平受其調控，如脂肪細胞脂肪酸結合蛋白（Fatty Acid Binding Protein，F(xiàn)ABP）、脂肪酸移位酶（CD36/FAT）及脂蛋白脂酶（Lipoprotein lipase，LPL）等[11]。PPARγ能夠誘導肝細胞表達載脂蛋白、脂肪酸氧化酶與LPL等，從而促進脂質氧化，降低血脂濃度[40]。研究還發(fā)現(xiàn)，PPARγ與肌肉組織LPL、FATP-1、CPT-1的表達密切相關，參與肌肉組織中脂肪酸代謝[41]。因此，PPARγ可以通過調控靶基因CD36、ATGL、LPL、L-FABP和SREBP1的表達影響脂肪酸代謝[11,14,26]，進而改善血漿中HDL、LDL和TG含量，最終影響內臟脂肪和體脂百分含量。CD36通過調控脂肪酸的跨膜轉運來影響脂肪酸氧化代謝效率[34,18]。ATGL是脂肪水解成脂肪酸的最關鍵限速酶，是各組織內水解TG的第1步反應的限速酶和關鍵酶，與脂代謝速率的調節(jié)有著密切關系。LPL作為乳糜微粒（CM）和VLDL中TG的限速酶，調節(jié)其分解形成甘油和脂肪酸的效率。它可以調節(jié)HDL-C的生成，參與VLDL-C與HDL-C的脂質交換[10]，還能增加CM結合到肝細胞膜LDL受體相關蛋白上的能力，促使肝細胞攝取CM[46]。通過以上3種途徑，LPL影響機體脂代謝能力。FABP具有攝取和轉運脂肪酸的功能，在機體脂代謝過程中起著重要作用[44]。FABP位于肝臟內的亞型是L-FABP，不僅可以在細胞膜上結合長鏈脂肪酸，還可以結合飽和脂肪酸、膽固醇等其他?；潴w[51]。L-FABP與脂肪酸結合后，作為載體將脂肪酸運輸到線粒體或者過氧化物酶體，而后進行β氧化，參與到細胞內的脂肪酸穩(wěn)態(tài)調節(jié)過程中。L-FABP，與肝臟組織中許多脂代謝相關酶有直接交互作用，進而調控肝臟組織脂代謝酶的活性，參與細胞內的脂質代謝[48]。SREBP1與內質網結合后調節(jié)下游FAS、ACC1和SCD1等靶基因的表達，影響TG的合成和脂質儲集，幾乎參與肝臟中所有與甘油三酯和脂肪酸合成基因的轉錄，在維持肝臟脂質代謝平衡中有著重要意義。

本實驗結果表明，伴隨著低氧訓練時間的延長，CD36、ATGL、LPL和L-FABP表達水平均逐步升高，這與目前大部分的研究結果一致。Ortiz-Masià等[47]的實驗發(fā)現(xiàn)，3% O2低氧暴露導致人巨噬細胞CD36蛋白表達水平顯著升高。毛孫忠[5]探討了高原習服過程中骨骼肌脂肪氧化利用特點、機制及意義，低壓艙模擬海拔5 000 m高壓環(huán)境，SD大鼠跑臺一次性力竭運動，實驗發(fā)現(xiàn)，高原暴露15天和30天組SD大鼠骨骼肌CD36表達量顯著高于急性高原暴露組。路瑛麗等[3]的實驗結果發(fā)現(xiàn)，高住高練肥胖大鼠脂肪組織中ATGL表達量第1周調低，第2周上升，第3周沒有變化，第4周再次降低到第0周水平，其中，第2周和第3周肥胖大鼠脂肪組織中ATGL表達量顯著高于第0周（＜0.05）。Jiang等[15]的實驗發(fā)現(xiàn)，經過3天的0.2% O2低氧暴露，骨髓間充質干細胞中LPL表達水平極顯著高于常氧孵育組。路瑛麗[4]實驗發(fā)現(xiàn)，高住高練組大鼠血清LPL水平在第1周和第2周持續(xù)上升，第3周和第4周同樣呈現(xiàn)上升趨勢，但是上升幅度減小，其中第2周和第3周大鼠血清LPL水平顯著高于第0周組，而第4周極顯著高于第0周組。Han等[13]實驗研究發(fā)現(xiàn)，長期間斷性低氧顯著上調了腹主動脈細胞脂肪型脂肪酸結合蛋白（Adipocyte Fatty Acid-binding Protein，A-FABP）mRNA和表皮型脂肪酸結合蛋白（Epidermal Fatty Acid-binding Protein，E-FABP） mRNA及其蛋白的表達水平。Lam等[38]研究了睡眠呼吸暫停引起的長期間斷性低氧對于A-FABP表達水平的影響，實驗結果顯示，血清中A-FABP水平與最小血氧飽和度及持續(xù)時間呈顯著正相關，長期間斷性低氧可以調高血清中A-FABP的表達水平。經過低氧訓練后，肥胖大鼠肝臟中CD36、ATGL、LPL和L-FABP表達水平的升高，且隨著低氧訓練時間的延長，上述脂肪酸代謝調節(jié)相關蛋白的變化幅度越明顯，從而引起肝臟中脂肪酸代謝水平的提高，促進了肝臟中膽固醇外流，因此改善了血脂水平，進而減少體脂百分含量，這可能也是低氧訓練減脂降體重的生理學機制。本實驗還發(fā)現(xiàn)，低氧訓練過程中SREBP1蛋白的表達無顯著性差異，提示，SREBP1并不是低氧訓練減脂生理過程的主要影響因子。

圖3 低氧訓練誘導miR-27/PPARγ調控脂代謝過程示意圖

Fignre 3. Schematic Diagram of Hypoxia Exercise Inducing miR-27/PPARγ to Regulate Fatty Acids Metabolism

綜上所述，低氧訓練抑制肥胖大鼠肝臟miR-27表達，miR-27進一步通過靶基因PPARγ調節(jié)下游靶分子CD36、ATGL、LPL、L-FABP的表達。隨著低氧訓練時間的延長，miR-27的表達逐漸降低，PPARγ的表達基本呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，脂肪酸代謝調節(jié)相關蛋白CD36、ATGL、LPL、L-FABP的表達逐漸遞增，促進脂肪酸的氧化，抑制TC、TC和LDL-C的合成，促進HDL-C的生成，從而改善肥胖大鼠血脂并降低機體脂含量，可能是低氧訓練調控脂肪酸代謝的分子機制。

4 結論

肥胖大鼠肝臟miR-27表達與低氧訓練時間呈現(xiàn)負相關，低氧訓練通過miR-27影響PPARγ及其下游脂肪酸代謝相關靶基因和靶蛋白的表達，改善血脂水平，最終機體脂含量伴隨低氧訓練時間的延長而逐漸下降。

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Study on Hypoxia Exercise Inducing miR - 27 / PPARγ to Regulate Fatty Acids Metabolism in Obese Rat’s Liver

ZHU Lei1，LU Ying-li2，F(xiàn)ENG Lian-shi2

1.Qufu Normal University,Qufu 273165,China;2.China Institute of Sport Science,Beijing 100061,China.

Objective: To explore the sequential effects of hypoxic exercising on miR - 27 / PPARγ and lipid metabolism target gene and protein expression levels in the obesity rat’s liver. Methods: Fifty 13-week-old male diet-induced obesity rats were randomly divided into five groups (n=10 each): Control group (C), 1-week hypoxic exercise group (E1), 2-week hypoxic exercise group (E2), 3-week hypoxic exercise group (E3) and 4-week hypoxic exercise group (E4). All the rats were trained with a treadmill for 1 h/day, 5 d/week for a total of 4 weeks, and the control group was trained in the normal oxygen environment with the speed of 25 m/min, but the hypoxic groups were trained in the 13.6% hypoxic environment. To detect the concentrations of serum total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein (LDL-C), high-density lipoprotein (HDL-C) levels. MicroRNA-27(miR-27) expression levels in the liver were determined by Real-time PCR. Protein and mRNA expression levels of PPARγ、CD36、ATGL、LPL、L-FABP、SREBP1 were tested by western blot and immunohistochemistry in the obesity rat liver. Results: The fat/body weight ratio and the concentrations of TC, TG, LDL-C were gradually decreased in obese rats during four weeks hypoxic exercise, but the concentrations of HDL-C were gradually increased. With the prolonged hypoxic exercise time, the expression of miR-27 was gradually decreased in the liver of obese rat, E3 and E4 were significantly higher than other groups (≤0.01).However, the expression levels of PPARγ、CD36、ATGL、LPL were gradually increased, and the levels of CD36 in E4 group were significantly higher than C group (≤), the levels of AGTL were significantly lower than E2 group (≤), E3 and E4 group (≤), the levels of LPL were significantly lower than E2 and E3 group (≤), especially lower than E4 group (≤). Meanwhile, the levels of L-FABP were the highest in E1 group, which were significantly higher than C group (≤), but the expression levels of SREBP1 were no significant change. Conclusion: The expression of miR-27 in the obese rat liver was negatively correlated with the hypoxic exercise time, and hypoxic exercise could affect PPARγ expression and its downstream fatty acid metabolism related target genes and target proteins expression, improve the blood lipid level through miR-27. Finally, the lipid content was gradually decreased with the prolonged hypoxic exercise time.

G804.2

Ａ

1002-9826(2018)01-0115-08

10.16470/j.csst.201801016

2017-08-10；

2017-12-25

國家自然科學基金資助項目（31471139）。

朱磊,男,副教授,博士,主要研究方向為低氧訓練調控脂代謝的機制,E-mail:zhulei316@126.com。

馮連世,男,研究員,主要研究方向為運動訓練監(jiān)控、高原（低氧）訓練。