急性運動對血清游離mtDNA以及先天免疫信號通路的影響

李省天，漆正堂，丁樹哲

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急性運動對血清游離mtDNA以及先天免疫信號通路的影響

李省天，漆正堂，丁樹哲

華東師范大學 青少年健康評價與干預教育部重點實驗室,上海 200241

目的：探討不同強度急性運動對小鼠外周血液循環(huán)中游離mtDNA含量和骨骼肌免疫信號通路的影響。方法：32只7周齡雄性小鼠隨機分為4組：安靜組（SED，n=8），低強度運動組（R10，n=8），中強度運動組（R15，n=8），高強度運動組（R20，n=8）。分別按照10 m/min、15 m/min、20 m/min的速度進行一次40 min的跑臺運動，運動后即刻采集血液和腓腸肌，應用PCR技術檢測小鼠血清mtDNA含量及骨骼肌免疫信號分子基因表達。結果：1）高強度運動使小鼠血清游離mtDNA含量顯著增加（＜0.05），但中、低強度運動組小鼠血清游離mtDNA與安靜組無顯著性差異；2）中低強度運動可使線粒體相關免疫信號分子（AIM2、NLRP3、TLR9、STING、MAVS）表達增加，其中，低強度運動組AIM2和STING的表達存在顯著性差異，而中等強度運動組均存在顯著性差異（＜0.05），但高強度運動組免疫信號分子表達均下降，TLR9的表達存在顯著性差異。結論：1）急性高強度運動可使血清游離mtDNA顯著提高，并抑制先天性免疫反應，但血清游離mtDNA的來源是否來自骨骼肌尚需進一步實驗證明；2）中、低強度急性運動對血清游離mtDNA含量無顯著性影響，但可提高機體的先天性免疫能力，原因可能是細胞內(nèi)游離mtDNA含量的增加。

急性運動；線粒體DNA；先天性免疫；AIM2； NLRP3；TLR9；STING；MAVS

先天性免疫是人類在漫長進化過程中獲得的一種遺傳特性，宿主通過模式識別受體（PatternRecognition Receptors，PRRs）識別病原體相關分子（PAMPs Pathogen-associated Molecular Patterns）和損傷相關分子（Damage-associated Molecular Patterns, DAMPs）引起免疫反應。病原相關分子（PAMPs）主要有DNA（CpG-DNA）、雙鏈RNA、單鏈RNA、脂蛋白、表面糖蛋白和生物膜成分等[38]。損傷相關分子（DAMPs）是在組織或細胞受到損傷或其他情況時，釋放出的一類被Toll樣受體和NOD樣受體[Nucleotide Oligomerization Domain(NOD)-like Receptor, NLR]識別進而誘導免疫應答發(fā)生的物質。隨著線粒體相關病毒感受器（Mitochondrial-associated Viral Sensor, MAVS）的發(fā)現(xiàn)，線粒體與先天免疫的關系開始引起重視。隨后發(fā)現(xiàn)的NLRP3、TLR9、STING、AIM2等免疫分子也與線粒體功能密切相關[11,20,29,33,36]。運動具有抗炎作用，其抗炎機制包括降低內(nèi)臟脂肪含量、增加骨骼肌中抗炎因子的產(chǎn)生和釋放，或者減少中性粒細胞與白細胞中TLRs（Toll-like Receptors）的表達[16]。線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是組織或細胞受損時釋放入血的一種DAMP，參與先天免疫過程。有研究發(fā)現(xiàn)，專業(yè)男性運動員血液中mtDNA含量低于正常男性，說明規(guī)律運動可降低血液中mtDNA，對于抗炎癥反應有積極作用[22]。此外，有證據(jù)表明，mtDNA作為DAMPs被免疫細胞識別引起免疫反應，因此線粒體也被稱為機體先天性免疫的觸發(fā)器[4]。

為了進一步探求不同運動強度急性運動對骨骼肌先天免疫信號通路的影響，本研究設計了不同強度的急性運動方案，探討運動后即刻血清游離mtDNA的變化，并提出骨骼肌釋放的mtDNA可以激活細胞內(nèi)免疫蛋白信號分子的假設。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

C57BL/6雄性小鼠32只，7周齡，體重19~22 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料和墊料均由上海生工生物技術有限公司提供，實驗小鼠自由飲水飲食，每周更換墊料2~3次，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃~23℃，相對濕度50%~70%，保持通風。小鼠隨機分為4組：安靜組（SED）、低強度運動組（R10）、中強度運動組（R15）、高強度運動組（R20），每組均8只小鼠。

1.2 運動方案

1.3 實驗動物處死與取材

安靜組（SED）安靜飼養(yǎng)，與運動組對照同步處死，運動組運動后即刻處死。立刻采取眼球取血的方式提取小鼠血液，隨后斷頸處死，并迅速取出完整的下肢腓腸肌，用錫紙包裹迅速置于液氮速凍，之后轉到-80℃超低溫冰箱保存，待測。

1.4 血清總DNA提取與mtDNA測定

取血清，基因組抽提試劑盒抽提循環(huán)DNA（碧云天D0063），依據(jù)說明書進行操作。線粒體DNA的含量用PCR進行檢測，6 μL反應體系：1X SYBR Green Master Mix，200 nmol/L引物，2μL血清DNA樣品。引物序列如下：ND F 5‘TCCGAGCATCTTATCCACGC3’，R5‘GTATGGTGGTAC TCCCGCTG3’；CYTb F5‘GGCTACGTCCTTCCATGAGG 3’，R5‘AGGTGAACGATTGCTAGGGC3’；COX F5‘AACA TGAAACCCCCAGCCAT3’，R5‘CTCCTCCAGCGGGATCA AAG3’。循環(huán)參數(shù)：95°C 10 min，進行40個循環(huán)（95°C 15s和58°C 1 min ），采集數(shù)據(jù)[17]。

1.5 Real-Time PCR

取完整腓腸肌，對腓腸肌中線粒體相關免疫蛋白進行mRNA表達的檢測，RNA抽取參照Trizol（Invitrogen）試劑盒說明書進行。取RNA樣品5 μL，以oligo Dt為隨機引物反轉錄，進行cDNA合成。10 μL反應體系中含有：5×RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，RNA 5 μL，Nuclease-free Water 2 μL。反應條件：37 ℃，15 min；然后95℃，5 min；-20 ℃冰箱保存。

cDNA樣品按以下反應體系進行：SYBR green PCR Master Mix（TOYOBO）10 μL，上下游引物各0.8 μL，DEPC水6.4 μL，cDNA模板2 μL，總反應體積20 μL。引物序列如下：TLR9 F 5’CTGGTGTGGAACATCATTC3’；R 5’CTT TCCATTGCTGTCCCTTC3’；NLRP3 F5’AGGCTCAATTCT ATCCTCTGTG3’, R5’CTTTCCAGTTCCTTAGCCCC3’；ST INGF5’TCTGCAAGAGAAGGGCTTTG3’, R5’AAGTACGG CAAAGCTGTGTG3’；MAVS F5’GCAACTGCTTTATCTCA TTTCC3’，R 5’AACCCTAACCTTCCTGCGAG3’；AIM2 F 5’GAATTCTAATTCTCAGCCATGC3’,R5’ACAGAAGGCTTCGAGTGCTG3’。反應條件，Step1:預變性（95℃，45 s）；Step2：40個循環(huán)（95℃，15 s；57℃，60 s；80℃,45 s）；Step3：建立PCR產(chǎn)物溶解曲線，變性（95℃，15 s），退火（56℃，60 s），從56 ℃緩慢加熱到95℃，15 s；每1℃收集熒光一次。熔解曲線只顯示一個主波峰，說明其擴增特異性高，符合Real-Time PCR的技術要求。反應結束后PCR儀輸出各反應孔的CT值，GADPH基因為內(nèi)參，根據(jù)公式2－ΔＣＴ計算待測樣品目的基因相對表達進行分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 實驗結果

2.1 血清循環(huán)mtDNA

本研究通過監(jiān)測ND、CYTb、COX這3種mtDNA片段在小鼠血清中含量來反應游離mtDNA在外周血液循環(huán)中的存在情況。結果顯示，3種mtDNA片段在SED組、R10組和R15組中的含量水平無差異，而R20組中3種mtDNA片段含量顯著增加（＜0.05，圖1）。

圖1 小鼠血清ND1,CYTb,COX的DNA相對含量示意圖（n=8）

Figure1. Changes of ND1 DNA, CYTb DNA, COX DNA Relative Content in Serum of C57BL

注：*表示與SED組比＜0.05。下同。

2.2 骨骼肌免疫蛋白mRNA表達

與SED組比，R10組中免疫蛋白mRNA表達水平均有所提高，其中，STING mRNA表達顯著上調(diào)（＜0.01）；R15組TLR9、AIM2、MAVS以及NLRP3 mRNA表達顯著提高（＜0.05）；R20組中免疫蛋白含量表達均有所下降，其中，TLR9 mRNA表達顯著降低（＜0.05）。提示，中、低強度運動可明顯促進骨骼肌中免疫信號分子的表達水平，而高強度運動組則對其產(chǎn)生了負面影響。

圖2 小鼠骨骼肌免疫信號分子mRNA相對含量示意圖（n=6）

Figure2. Changes of mRNA of Immune Signaling Molecule in C57BL

3 分析與討論

骨骼肌作為一個內(nèi)分泌器官參與了體內(nèi)很多生理反應，其中包括先天性免疫反應。運動對先天性免疫的影響程度取決于運動的方式和強度[15]。急性運動會導致骨骼肌內(nèi)環(huán)境紊亂，引發(fā)肌纖維修復、重塑和再生長，致使肌纖維類型成分改變、衛(wèi)星細胞活化和成肌細胞分化，以此來適應運動訓練。在這一過程中骨骼肌與免疫系統(tǒng)之間的交流也越來越明顯，有研究證明，肌纖維收縮可改變該部位炎癥環(huán)境，聚集白細胞來適應骨骼肌修復、重塑和再生長的過程[5]。Chatterjee等[7]以果蠅的間接飛行肌肉（Indirect Flight Muscles，IFM）為模型，發(fā)現(xiàn)殘翅果蠅無法產(chǎn)生有效的體液免疫應答，并在以斑馬魚為脊椎動物模型代表的實驗中證實了骨骼肌可以增強先天性免疫的觀點。

線粒體是對細胞環(huán)境異常敏感的細胞器，細菌、病毒、氧化應激等刺激因素均可使線粒體受損，可導致mtDNA釋放到細胞質基質甚至會進入到外周血液循環(huán)中誘發(fā)免疫炎癥反應。外周循環(huán)DNA可以作為許多疾病確診及發(fā)展過程中的診斷指標[3]，有研究在癌癥患者的血液中發(fā)現(xiàn)了突變的mtDNA[9,12,23,24]。Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)，無菌創(chuàng)傷造成的類似敗血病的全身系統(tǒng)性炎癥是細胞受損后導致線粒體DAMPs釋放進入外周血液循環(huán)引發(fā)先天性免疫造成的。孢疹病毒會引起mtDNA應激增強抗病毒信號和Ⅰ型干擾素分泌，證明mtDNA是抗病毒反應中的觸發(fā)器[31]。Chang等[6]對絕經(jīng)后婦女的研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運動可以增加白細胞內(nèi)mtDNA的拷貝數(shù)，并有研究發(fā)現(xiàn)，排球運動員血液游離mtDNA含量要低于正常人[22]。

本研究通過不同強度急性運動實驗，發(fā)現(xiàn)R20組（高強度運動組）血液中mtDNA含量明顯升高，其他3組無顯著性變化，提示，急性高強度運動可引起線粒體失調(diào)。目前，關于mtDNA進入外周血液循環(huán)的機制還不清楚，可能的機制有3種：1）線粒體損傷導致線粒體膜通透性改變，致使mtDNA從線粒體通透性轉換孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP）進入細胞質基質；2）運動引起肌細胞分泌外泌體，mtDNA包裹在外泌體中被釋放到細胞外[26]；3）溶酶體中核酸酶活性降低無法完全降解自噬體內(nèi)的mtDNA，或細胞凋亡致使mtDNA進入外周循環(huán)[32]。急性大強度運動可造成肌細胞損傷[2]，R20組（高強度運動組）血清游離mtDNA含量的明顯提高可能由于骨骼肌細胞損傷/凋亡引起的。

先天性免疫細胞識別PAMP的PRR有4類：TLR（Toll-like Receptor）、RLR（RIG-I Like Receptor）、NLR（NOD-like Receptor）和DNA受體AIM2（Absent in Melanoma 2）。TLR9是先天性免疫和適應性免疫的紐帶，它的天然配體是病毒和細菌基因組中的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸序列（CPG-DNA）[13]，在脊椎動物的基因組中CpGDNA片段非常少見，且大多數(shù)處于甲基化狀態(tài)，而線粒體中的DNA恰巧含有大量未甲基化的CpGDNA片段，當mtDNA進入細胞質或釋放到細胞外時可被TLR9識別誘導細胞進行免疫應答，所以，mtDNA與TLR9可能與自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生密切相關。在NLR家族中，NLRP3是一種能夠識別多種外來病原體和內(nèi)在危險信號的PRR[8]，mtDNA釋放到細胞基質中可激活NLRP3炎癥小體[21,29]，若減少線粒體中mtDNA的數(shù)量則可以降低NLRP3的活化，這進一步證明了mtDNA在激活NLRP3炎癥小體過程中有直接作用[29]。MAVS即線粒體抗病毒信號蛋白（Mitochondrial Antiviral Signaling），是2005年由4個獨立的研究小組通過不同的方法鑒定的RLR（Retinic Acid-induced Gene I-like Recptor，RLR）下游的接頭蛋白，分別命名為MAVS、VISA（Virus-induced Signaling Adapter）、IPS-1（Interferon-β Promoter Stimulator 1）和Cardif（CARD Adapter Inducing IFN-β）[14,20,34]。MAVS基因敲除小鼠的實驗表明，MAVS是RIG-I（Retinin Acid-Induced Gene I）和MDA5（Melanoma Differentiation-Associated Gene-5）共同的唯一接頭蛋白[30]，MAVS的發(fā)現(xiàn)揭示了線粒體在RLR信號傳導中的重要地位。2008年，兩個獨立的研究小組報道了RLR信號通路中MAVS下游的接頭蛋白，分別命名為MITA（Mediator of IRF3 Activation）和STING（Stimulator of Interferon Gene）[10,37]。免疫共沉淀實驗表明，STING的N端與MAVS的C端相互作用，使STING通過MAVS與RLR相互作用，實現(xiàn)RLR所介導的信號傳導。West等[30]研究表明，在誘導基因或者皰疹病毒感染情況下會導致線粒體轉錄因子A(TFAM)的缺損，降低mtDNA穩(wěn)定性造成線粒體擬核的丟失，進入到細胞質中的mtDNA會通過cGAS-cGAMP-STING信號通路來激活先天性免疫反應。AIM2（Absent in Melanoma 2，AIM2）是一種主要定位在細胞質的蛋白質，體外實驗顯示，AIM2可與DNA直接結合，并與DNA狀態(tài)有關：1）只結合雙鏈DNA，不結合單鏈DNA；2）與DNA長度呈正相關，雙鏈DNA越長，AIM2的活性越高，誘發(fā)的免疫反應越強烈；3）DNA無特異性，病毒、細菌、哺乳動物甚至人工合成的雙鏈DNA均可通過AIM2誘導先天性免疫[1]。線粒體DNA作為體內(nèi)的DAMPs，在細胞受損線粒體應激等情況下會泄露到細胞質中，與AIM2結合引發(fā)先天性免疫。

急性大強度運動可以引起一系列包括炎癥反應和氧化應激在內(nèi)的不良反應，但其發(fā)生機制尚未明確。目前關于骨骼肌與先天性免疫的研究鮮有報道，研究主要集中在先天性免疫與癌癥和心臟疾病等方向。有研究結果表明，中等強度運動可使T淋巴細胞產(chǎn)生積極性免疫應答，提高機體免疫功能，而力竭運動和過度訓練則抑制免疫細胞產(chǎn)生免疫應答。肥胖病人機體常處在慢性炎癥狀態(tài)，不同強度運動在提高胰島素敏感性的同時可顯著降低機體炎癥水平，表明運動影響炎癥相關信號通路[25]。對大鼠進行急性不同強度的訓練發(fā)現(xiàn)，急性大強度運動引起的線粒體應激會通過線粒體自噬激活NLRP3炎癥小體觸發(fā)心肌的炎癥反應[18]。McCarthy等[19]對美式橄欖球運動員高血壓發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，肌肉損傷引起的DAMPs（HMGB1和mtDNA）進入外周循環(huán)激活免疫細胞內(nèi)TLR9信號通路誘發(fā)先天性免疫反應。以上研究提示，大強度運動引起炎癥反應與線粒體密切相關。

本研究結果顯示，R15組（中等強度運動）顯著提高了NLRP3、AIM2、STING、MAVS、TLR9等線粒體相關免疫蛋白的表達，促使機體產(chǎn)生積極免疫應答，與前人研究結果一致；R10組（低強度運動）顯示免疫蛋白的表達均有所提高，但只有AIM2和STING具有顯著性差異，提示，急性低強度運動對先天性免疫系統(tǒng)可發(fā)揮積極影響；R20組（高強度運動）顯示免疫蛋白的表達均下降，其中TLR9具有顯著性差異，提示，急性高強度運動抑制了線粒體相關免疫蛋白的表達，對先天性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了消極影響。研究結果似乎并未證明假設的成立，R20組血清游離mtDNA存在顯著性提高而免疫蛋白的表達卻呈下降的現(xiàn)象，表明R20組骨骼肌內(nèi)可能出現(xiàn)明顯的細胞凋亡現(xiàn)象致使血清游離mtDNA含量提高，抑制骨骼肌內(nèi)先天性免疫功能。R10組與R15組血清游離mtDNA含量與安靜組并未產(chǎn)生顯著性差異，但線粒體相關免疫蛋白的表達均成提高的趨勢，其中R15組存在顯著性差異，表明低強度運動和中等強度運動可能通過增加細胞質內(nèi)游離mtDNA發(fā)揮增強先天性免疫的功能。綜上，本研究證明，急性高強度運動可使血清游離mtDNA顯著提高，并抑制先天性免疫反應，但血清游離mtDNA的來源是否來自骨骼肌尚需進一步實驗證明；中、低強度急性運動對血清游離mtDNA含量無顯著性影響，但可提高機體的先天性免疫能力，原因可能是細胞內(nèi)游離mtDNA含量的增加。

4 結論

不同強度的急性運動對先天性免疫通路產(chǎn)生不同影響，中、低強度運動對先天性通路的激活可產(chǎn)生正向影響，原因可能是胞內(nèi)游離mtDNA含量增加。

高強度運動對先天性通路激活產(chǎn)生負向影響，原因可能是細胞受損或凋亡增加，而血清游離mtDNA含量的顯著增加是由此引起的。

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Effects of Acute Exercise on Circulating mtDNA and Innate Immune Signaling Pathways

LI Xing-tian, QI Zheng-tang, DING Shu-zhe

East China University, Shanghai 200241China.

Objective: To discuss the effects of acute exercise with different intensity on circulating mitochondrial DNA (mtDNA) and immune signaling molecules in skeletal muscle of rats. Methods: The mice were randomly divided into rest group (SED, n=8), low intensity group (R10, n=8), medium intensity group (R15, n=8), high intensity group (R20, n=8). The speed of treadmill running is 10m/min for R10, 15m/min for R15, 20 m/min for R20, Each run 40 minutes. Quantitative real time PCR was used to detect the content of mtDNA and skeletal muscle MAVS, NLRP3, TLR9, STING as well as AIM2 mRNA genes expression in each group. Results: 1 )The content of mtDNA in R20 groups improved significantly (P<0.05) ; 2 )The immune molecules’ expression improved in R15 and R10 groups ,but in R15 group improved more obviously (P<0.05) ; however ,the immune molecules’ expression in R20 all declined. Conclusion: The data suggest that acute heavy exercise can make the serum circulating mtDNA increased significantly and inhibit immune response, while the source of the serum free mtDNA from skeletal muscle still needs further experimental proof. The moderate and low intensity acute exercise has no significant effect on serum free mtDNA content, but it can improve the innate immunity ability of the body, which may be the increase of free mtDNA content in the cell.

G804.2

Ａ

1002-9826(2018)01-0123-06

10.16470/j.csst.201801017

2017-03-10；

2017-12-21

國家自然科學基金資助項目（316712141）。

李省天,女,在讀碩士研究生,主要研究方向為運動適應與線粒體信號調(diào)控,E-mail:1838006723@qq.com。