胞外囊泡中l(wèi)inc-VLDLR表達(dá)與食管癌發(fā)生及耐藥的關(guān)系

劉亮，胡月陽，巨英超，周榮秒

食管癌是我國(guó)較常見的惡性腫瘤，發(fā)病及病死率較高[1]，其常規(guī)治療方法包括手術(shù)、放療、化療等，手術(shù)仍是食管癌治療的首選方法，術(shù)后輔以放療及化療[2]。對(duì)于一些晚期食管癌患者，失去手術(shù)治療時(shí)機(jī)后，化療及放療成為其主要治療方法，但藥物的毒副作用及耐藥會(huì)嚴(yán)重影響化療效果，甚至導(dǎo)致化療失敗。探尋食管癌多藥耐藥形成機(jī)制，對(duì)于耐藥逆轉(zhuǎn)研究具有重大意義。研究顯示三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ATP binding cassette G2，ABCG2)與多種腫瘤多藥耐藥的形成密切相關(guān)[3-5]。本課題組以往研究也顯示，ABCG2與食管癌多藥耐藥相關(guān)[6]，但是其中機(jī)制目前尚未闡明。近來研究顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥形成密切相關(guān)[7-8]。有研究顯示，在肝癌細(xì)胞中l(wèi)inc-VLDLR通過調(diào)控ABCG2表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞耐藥性進(jìn)行調(diào)控[9]。胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)在細(xì)胞間信息傳遞中起著重要作用，包括細(xì)胞間耐藥性的產(chǎn)生[10-11]。本研究探討linc-VLDLR與食管癌多藥耐藥的關(guān)系以及耐藥細(xì)胞釋放的EVs中攜帶的linc-VLDLR對(duì)食管癌細(xì)胞耐藥性的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人食管癌細(xì)胞株Eca109由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，接種于含10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基中(補(bǔ)充青霉素、鏈霉素各100U/L)，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。噻唑藍(lán)比色法(MTT)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量RCR試劑購(gòu)自美國(guó)Vazyme公司；FC500型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；引物購(gòu)自生工生物公司；紫外可見分光光度計(jì)(NanoDrop，美國(guó)Thermo公司)；熒光定量PCR儀(MX3000P，美國(guó)Agilent公司)。

1.2 MTT法檢測(cè)阿霉素(ADM)作用Eca109細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值 用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/ml，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。24h貼壁后倒去培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的ADM(0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50μg/ml)，陰性對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，反應(yīng)總體積200μl/孔；另設(shè)空白對(duì)照孔，只加培養(yǎng)液，每個(gè)藥物劑量均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2條件下孵育24h，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，傾去培養(yǎng)液；每孔加入180μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm波長(zhǎng)，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A490)，按下列公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，生長(zhǎng)抑制率IR(%)=(1－用藥組A490/對(duì)照組A490)×100%，計(jì)算IC50值。

1.3 EVs提取 根據(jù)ADM對(duì)Eca109細(xì)胞24h的IC50值選擇3個(gè)ADM濃度，分別為0.2、0.4、0.8μg/ml，以生理鹽水代替藥物作為對(duì)照組。不同濃度ADM(0、0.2、0.4、0.8μg/ml)作用Eca109細(xì)胞24h后，利用梯度離心法收集培養(yǎng)液中的EVs，分別標(biāo)記為EVs1、EVs2、EVs3、EVs4。梯度離心法的主要步驟包括，2000r/mim，10min；3000r/mim，30min；11 000r/min，1h，收集離心后的上清，以超高速110 000×g離心16h，棄上清，用適量PBS溶解得到EVs沉淀，Nanodrop法定量，–80℃分裝保存。

1.4 熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)EVs中l(wèi)inc-VLDLR基因表達(dá) 將提取的EVs以冷PBS洗滌1次，加入1ml RNA分離試劑，常規(guī)一步法提取總RNA。按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物如下。linc-VLDLR：上游，5'-AGCAGTCACATTCATCGCAC-3'，下游，5'-GAGGAATAGGTGCGAACTGC-3'；內(nèi)參RNU6B：上游，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游，5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。應(yīng)用2–ΔCt值法計(jì)算linc-VLDLR mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=linc-VLDLR Ct值－RNU6B Ct值。

1.5 EVs干預(yù)Eca109細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 采用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)Eca109細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml，分別接種于6孔板，37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁后，分別加入50μg/ml EVs(1–4)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置未加EVs(生理鹽水代替EVs)的對(duì)照組，分別標(biāo)記為EVs1、EVs2、EVs3、EVs4及對(duì)照組。培養(yǎng)細(xì)胞48h后收集細(xì)胞。調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)/ml，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2及l(fā)inc-VLDLR基因表達(dá) 取上述細(xì)胞懸液1ml，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，加入1ml RNA分離試劑，常規(guī)一步法提取總RNA。按照說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照標(biāo)準(zhǔn)的real-time PCR流程執(zhí)行，采用SYBR-Green Ⅰ作為熒光染料，每個(gè)樣品重復(fù)3次，引物如下。ABCG2：上游，5'-GGTCAGAGTGTGGTTTCTGTAGCA-3'，下游，5'-GTGAGAGATCGATGCCCTGCTTTA-3'；linc-VLDLR：上游，5'-AGCAGTCACATTCATCGCAC-3'，下游，5'-GAGGAATAGGTGCGAACTGC-3'；內(nèi)參GAPDH：上游，3'-CACTACCGTACCTGACACCA-5'，下游，3'-ATGTCGTTGTCCCACCACCT-5'；RNU6B：上游，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游，5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。應(yīng)用2–ΔCt值法計(jì)算ABCG2及l(fā)inc-VLDLR mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=ABCG2 Ct值－GAPDH Ct值，ΔCt= linc-VLDLR CT值－RNU6B Ct值。

1.7 MTT方檢測(cè)細(xì)胞對(duì)ADM的24h IC50值 取一定量上述制備的單細(xì)胞懸液，接種至96孔板，按照1.2步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算ADM作用細(xì)胞24h的IC50值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取上述制備的單細(xì)胞懸液1ml，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，70%乙醇4℃固定24h；PBS洗滌細(xì)胞2次，100μl PBS液懸浮細(xì)胞，向其中加入1ml碘化丙啶染液，4℃染色；30min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用Multicycle AV分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期進(jìn)行擬合分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)ADM對(duì)Eca109細(xì)胞24h的IC50MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，ADM作用Eca109細(xì)胞24h的IC50為0.44±0.02μg/ml，后續(xù)提取EVs實(shí)驗(yàn)前ADM干預(yù)Eca109細(xì)胞的濃度設(shè)定為0.2、0.4、0.8μg/ml。

2.2 熒光定量RT-PCR法檢測(cè)EVs中l(wèi)inc-VLDLR基因表達(dá) 結(jié)果顯示，EVs1–4中l(wèi)inc-VLDLR基因表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。

2.3 MTT檢測(cè)EVs干預(yù)后Eca109細(xì)胞對(duì)ADM的IC50結(jié)果顯示，EVs1–4組IC50值與對(duì)照組比較明顯增高(P＜0.01)。EVs4組IC50明顯高于EVs1-3組(P＜0.05，圖2)。

2.4 EVs干預(yù)后Eca109細(xì)胞周期的檢測(cè) 與對(duì)照組比較，EVs1–4組Eca109細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)明顯增高(P＜0.01)，細(xì)胞周期G0/1期比例明顯降低(P＜0.01)。EVs4組PI明顯高于EVs1、2、3組及對(duì)照組(P＜0.01)，而G0/1期比例明顯降低(P＜0.01，圖3)。

2.5 EVs干預(yù)后Eca109細(xì)胞中l(wèi)inc-VLDLR及ABCG2基因表達(dá)水平 EVs1–4組Eca109細(xì)胞中ABCG2基因表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。EVs2、3、4組Eca109細(xì)胞中l(wèi)inc-VLDLR基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，而EVs1組Eca109細(xì)胞中l(wèi)inc-VLDLR基因表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。EVs4組細(xì)胞中l(wèi)inc-VLDLR及ABCG2基因表達(dá)水平明顯高于EVs1、2、3組及對(duì)照組(P＜0.05，圖4)。

圖1 熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)EVs中l(wèi)inc-VLDLR基因表達(dá)Fig.1 Expression of linc-VLDLR gene in EVs detected by realtime RT-PCR

圖2 EVs干預(yù)Eca109細(xì)胞后對(duì)ADM的IC50Fig.2 The IC50 of ADM on Eca109 cells intervened with EVs

3 討 論

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用[12-13]；腫瘤細(xì)胞可通過細(xì)胞間的信息傳遞營(yíng)造出更利于腫瘤發(fā)展的微環(huán)境[14-15]，即種子、土壤新學(xué)說。因此，對(duì)這種微環(huán)境改變?cè)斐傻墨@得性耐藥等細(xì)胞應(yīng)激的機(jī)制研究為食管癌的治療提供了新的方向。

EVs是細(xì)胞遭受刺激時(shí)產(chǎn)生并釋放的超微囊性結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞旁分泌的生物活性物質(zhì)之一，包括微泡(MVs)和外泌體(exosomes)[16]。EVs是一種由細(xì)胞來源的脂質(zhì)雙分子層包繞的球狀膜性結(jié)構(gòu)，其是一組直徑40～5000nm的囊泡狀小體，多種細(xì)胞均可向其生存的微環(huán)境中釋放EVs[17-19]，包括多種造血系統(tǒng)的細(xì)胞，如血小板、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、T及B淋巴細(xì)胞等，腫瘤細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，肺泡上皮細(xì)胞等。在細(xì)胞培養(yǎng)液、血清、唾液、惡性腹水、乳汁及尿液中均可檢測(cè)到EVs的存在[20-22]。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期Fig.3 Cell cycle of Eca109 cells detected by flow cytometry

圖4 EVs干預(yù)后Eca109細(xì)胞中l(wèi)inc-VLDLR及ABCG2基因表達(dá)Fig.4 linc-VLDLR and ABCG2 gene expression of Eca109 cells intervened with EVs

在EVs的形成過程中，會(huì)功能性地選擇與來源細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)、mRNA及非編碼RNA等信號(hào)分子，這些信號(hào)分子在EVs與靶細(xì)胞相互作用后被釋放到靶細(xì)胞中，通過改變靶細(xì)胞表型、遺傳型而發(fā)揮作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤細(xì)胞所釋放的EVs通過作用其微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞及免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管形成、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[24-25]。Takahashi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞所分泌的EVs通過linc-VLDLR調(diào)控靶細(xì)胞ABCG2表達(dá)，從而引起靶細(xì)胞肝癌細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥。本課題組在以往的研究中發(fā)現(xiàn)ABCG2與食管癌的多藥耐藥性密切相關(guān)，但ABCG2的調(diào)控機(jī)制并未闡明。因此，考慮腫瘤微環(huán)境中EVs在細(xì)胞間的信號(hào)傳遞對(duì)多藥耐藥的形成可能起關(guān)鍵性的調(diào)控作用，切斷腫瘤微環(huán)境-EVs-非編碼RNA-細(xì)胞表型蛋白通路，可有效防止腫瘤多藥耐藥的形成。

本研究結(jié)果顯示，通過不同濃度的ADM干預(yù)食管癌Eca109細(xì)胞24h，建立短暫的耐藥細(xì)胞模型后，收集釋放的EVs，可檢測(cè)到EVs中l(wèi)inc-VLDLR表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，且隨著ADM藥物濃度的遞增，EVs中l(wèi)inc-VLDLR的表達(dá)水平遞增。與對(duì)照組比較，ADM干預(yù)Eca109細(xì)胞后，用細(xì)胞自身釋放的EVs再干預(yù)Eca109細(xì)胞48h，可檢測(cè)到細(xì)胞對(duì)ADM產(chǎn)生了不同程度耐藥，其IC50值明顯升高；細(xì)胞中l(wèi)inc-VLDLR及ABCG2基因表達(dá)水平亦明顯增高；PI明顯增高，細(xì)胞周期G0/1期比例明顯降低，且具有ADM濃度依賴性。高濃度的ADM作用Eca109細(xì)胞后，釋放的EVs中的linc-VLDLR基因表達(dá)水平明顯高于低濃度ADM及NS作用Eca109細(xì)胞，攜帶高表達(dá)linc-VLDLR的EVs干預(yù)Eca109細(xì)胞后使細(xì)胞中l(wèi)inc-VLDLR及ABCG2基因表達(dá)水平升高，ABCG2高表達(dá)則使Eca109細(xì)胞具有多藥耐藥性。

綜上所述，linc-VLDLR及ABCG2高表達(dá)參與了食管癌多藥耐藥的形成，食管癌耐藥細(xì)胞釋放的EVs中攜帶的linc-VLDLR通過調(diào)控靶細(xì)胞中ABCG2表達(dá)，從而引起靶細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥。本研究探尋了EVs-linc-VLDLR-ABCG2通路引起食管癌多藥耐藥形成，為食管癌多藥耐藥的基礎(chǔ)和臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新思路。

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