葉酸修飾新藤黃酸泡囊對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡作用研究

★ 常佳麗 方清影 張變 陳凱云 余瓊芳 彭代銀 王飄飄 陳衛(wèi)東

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物代謝研究所 合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 合肥 230012；4.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心 合肥 230012)

肝癌作為常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類生命安全[1-2]。因此研發(fā)一種抗癌療效強(qiáng)，毒副作用小的抗癌藥物具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)能特異性抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，具有治療肝癌的潛力[3]。GNA是從中藥藤黃中提取出來(lái)的有效成分，具有抗瘤譜廣，毒性較低的特點(diǎn)，有望成為新的抗腫瘤藥物[4]。

但是GNA水溶性差，體內(nèi)消除快，半衰期非常短，血管刺激性大，從而制約了GNA的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用[5]。泡囊是由非離子表面活性劑在水性介質(zhì)中形成的單層或多層雙分子結(jié)構(gòu)的藥物載體，既可以包裹親水性藥物，又可以包裹疏水性藥物。其具有安全、穩(wěn)定，可減小藥物副作用，提高藥物在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，改善藥物生物利用度，表面可以進(jìn)行修飾等優(yōu)點(diǎn)，已在多種藥物載體得到應(yīng)用[6]。而近年來(lái)，靶向制劑掀起一股熱潮，引起了廣泛關(guān)注。葉酸受體(Folate recptor，F(xiàn)R)[7]是一種糖基化磷脂肌醇連接的膜糖蛋白，在腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)并有較高的活性，在正常組織表達(dá)很少。同時(shí)葉酸( folic acid，F(xiàn)A)[8]無(wú)毒，穩(wěn)定，免疫原性低，與葉酸受體有高度親和性，故利用葉酸配體-受體特異性結(jié)合來(lái)靶向輸送藥物，可以特異性治療惡性腫瘤。本課題組為改善GNA缺陷，提高抗腫瘤作用，將其制備成泡囊并用葉酸進(jìn)行修飾，且在前期已成功制備，做了相關(guān)表征，包封率在80%以上，載藥量10%左右，粒徑在180nm左右，形態(tài)觀察大小均一圓整，均符合藥用要求。故本實(shí)驗(yàn)在課題組前期基礎(chǔ)上繼續(xù)相關(guān)研究，本文以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，探索葉酸修飾新藤黃酸泡囊對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用及凋亡作用。

1 材料

1.1 藥物及試劑 新藤黃酸(黃色干燥粉末，純度>99.0%，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)新藤黃酸課題組提供)；FA-GNA-NISVs、GNA-NISVs(實(shí)驗(yàn)室自制)；RPMI1640培養(yǎng)液(江蘇凱基生物公司)；MTT(美國(guó)Sigma公司)；二甲亞砜(天津?yàn)笊锕井a(chǎn)品)；胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(上海BestBio-貝博生物)；PBS(pH7.2～7.4)(實(shí)驗(yàn)室自制)；其他試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞株HepG2來(lái)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.3 儀器 ELX800uv酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司);ES-315高壓滅菌鍋(日本Tomy KOQYO公司);干燥箱(SHANGHAI BOXUN);371型CO2培養(yǎng)箱(Germany);BHC-1300IIA/B2超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司);FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司);光學(xué)倒置顯微鏡(上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司);AB135-S 電子分析天平(德國(guó)METTLER TOLEDO公司);TDL-5離心機(jī)(德國(guó)EPPENDORF公司);75cm2培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning公司);96及6孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 接種HepG2 細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，相對(duì)飽和濕度的條件下生長(zhǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%的密度時(shí)，胰酶消化后傳代，周期為2-3天。

2.2 對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min，稀釋一定倍數(shù)制成細(xì)胞懸液，按5×104個(gè)/cm2密度將細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度的GNA溶液，GNA-NISVs溶液和FA-GNA-NISVs溶液各100μL(配藥時(shí)用不完全培養(yǎng)基)，使其最終濃度為0.2,1,4,6,8,10,16μg/mL，空白制劑組各濃度按FA-GNA-NISVs組同等稀釋，各實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)不含藥物孔作藥物組陰性對(duì)照，培養(yǎng)基(無(wú)細(xì)胞)作調(diào)零孔。24h后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)3.5～4.0h，棄去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，振蕩15min，待藍(lán)色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490nm處測(cè)量吸光度。然后計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。抑制率IR%=(陰性對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/陰性組OD值×100%。

2.3 對(duì)HepG2 細(xì)胞形態(tài)的影響 0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，離心，配成細(xì)胞懸液后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(5×104)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)成單層后加入培養(yǎng)基稀釋的GNA、FA-GNA-NISVs與GNA-NISVs，終濃度均為8μmol/L。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下觀察，并拍攝照片。

2.4 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) HepG2 細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍。分別加入培養(yǎng)基稀釋的GNA、GNA-NISVs、FA-GNA-NISVs(濃度分別為4μg/mL，8μg/mL)作為給藥組，另設(shè)空白對(duì)照組(不含藥物)，平行3組。在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育24h，收集原含藥培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，收集，加入0.5mL不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，待消化完全，加入培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)2000rpm離心5min，棄去上清。加入預(yù)冷的PBS混懸，離心棄去上清，重復(fù)兩次，收集細(xì)胞，用0.5mL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入1.5mL EP管中，加入5μL的Annexin-V/FITC冰浴下避光孵育15min，再加入10μL的PI染色，充分混勻，繼續(xù)孵育5min，最后轉(zhuǎn)入流式管內(nèi)，上流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用 MTT試驗(yàn)表明，GNA對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯的抑制效應(yīng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且呈劑量依賴性。將GNA制備成泡囊后，對(duì)細(xì)胞的抑制率有所提高，并有顯著性差異(P<0.05)，而空白載體對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性。葉酸修飾組與未修飾組相比，葉酸修飾后的新藤黃酸泡囊顯著抑制了HepG2細(xì)胞的增殖，且與另外兩組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。詳細(xì)見(jiàn)圖1(GraphpPad Prism6.02擬合)。經(jīng)SPSS17.0擬合IC50得出FA-GNA-NISVs的IC50值為1.701μg/mL，分別是GNA-NISVs和GNA Solution的1/3、1/5左右，見(jiàn)表1。再一次證明葉酸修飾的新藤黃酸非離子表面活性劑泡囊，增加了對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)，具有明顯的受體靶向作用和細(xì)胞殺傷性。

3.2 對(duì)HepG2 細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞(見(jiàn)圖2)，可明顯看出，空白組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，呈梭形或不規(guī)則形，給藥組細(xì)胞多呈現(xiàn)變圓固縮狀態(tài)，透亮度變差，且有大量死細(xì)胞漂浮，出現(xiàn)明顯的凋亡趨勢(shì)。給予相同濃度的不同實(shí)驗(yàn)組顯示出，原料藥組細(xì)胞變圓不明顯，而FA-GNA-NISVs處理過(guò)的細(xì)胞凋亡趨勢(shì)較為顯著，活細(xì)胞數(shù)量明顯較少,且倒置顯微鏡下觀察漂浮有大量死細(xì)胞。

注：與GNA游離藥組比較，#P<0.05；與GNA-NISVs組比較，*P<0.05。

Formulations IC50/μg·mL-1FA-GNA-NISVs 1.701±0.135*GNA-NISVs 5.089±0.360*GNASolution9.133±0.151

注：與GNA Solution組比較，*P<0.05。

1.空白對(duì)照組；2.新藤黃酸游離藥8μg/mL；3.非葉酸修飾新藤黃酸泡囊8μg/mL；4.葉酸修飾新藤黃酸泡囊8μg/mL；

3.3 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 正常細(xì)胞和早期凋亡的細(xì)胞膜是完整的，Propidium iodide (PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能透過(guò)細(xì)胞膜和細(xì)胞核結(jié)合而呈現(xiàn)紅色，故將Annexin V與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期細(xì)胞及壞死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。流式結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，藥物干預(yù)24h后，細(xì)胞成活率明顯降低。當(dāng)給予4μg/mL的各組藥物時(shí)，F(xiàn)A-GNA-NISVs組顯示了較高的凋亡率，早期凋亡及晚期凋亡都明顯增加，說(shuō)明葉酸修飾后的GNA泡囊可提高誘導(dǎo)凋亡的能力。相比于4μg/mL藥物組，當(dāng)濃度增加一倍時(shí)，細(xì)胞卻呈壞死趨勢(shì)，且FA-GNA-NISVs誘導(dǎo)壞死細(xì)胞最多。

A.空白對(duì)照組；B.新藤黃酸游離藥4μg/mL；C.非葉酸修飾新藤黃酸泡囊4μg/mL；D.葉酸修飾新藤黃酸泡囊4μg/mL；E.空白對(duì)照組；F.新藤黃酸游離藥8μg/mL；G.非葉酸修飾新藤黃酸泡囊8μg/mL；H.葉酸修飾新藤黃酸泡囊8μg/mL

4 討論

泡囊是類似于脂質(zhì)體的新型藥物載體，其成膜材料生物相容性好、易降解、安全無(wú)害，用來(lái)運(yùn)載藥物具有選擇性高、緩釋的優(yōu)勢(shì)[9]。再利用葉酸配體修飾藥物載體表面，可達(dá)到抗癌藥物的主動(dòng)靶向輸送[10]。葉酸修飾泡囊運(yùn)載藥物治療癌癥時(shí)可運(yùn)輸藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞表面，因此可減少藥物的給藥劑量，降低藥物毒副作用，提高藥物抗腫瘤作用。

Fenggen Yan[11]發(fā)現(xiàn)新藤黃酸能抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且凋亡機(jī)制與Phospho-Erk1 / 2和Phospho-p38 MAPK在HepG2細(xì)胞中的蛋白表達(dá)變化有關(guān)。課題組研制出葉酸修飾新藤黃酸泡囊新劑型，研究其對(duì)HepG2細(xì)胞體外藥效。MTT試驗(yàn)表明FA-GNA-NISVs對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用顯著，抑制率也明顯高于其它組，且呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。AnnexinV-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在兩個(gè)劑量濃度下FA-GNA-NISVs均呈現(xiàn)較高的凋亡率和死亡率，提示藥物抑制細(xì)胞增殖主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及壞死導(dǎo)致，表明修飾后的藥物包載小劑量的藥物即可達(dá)到抗腫瘤效果。但流式實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞呈兩種不同形式的細(xì)胞死亡狀態(tài)，在低劑量下，細(xì)胞主要呈凋亡式死亡，高劑量時(shí)，細(xì)胞壞死比較明顯。細(xì)胞凋亡和壞死一般是細(xì)胞死亡的兩種不同形式，且在發(fā)生機(jī)制、形態(tài)上、過(guò)程和結(jié)局上都有著明顯的不同，但兩種在某些狀態(tài)下有一定的相關(guān)性，細(xì)胞凋亡在一定條件下可轉(zhuǎn)化為細(xì)胞壞死[12]。本文出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于藥物劑量較大時(shí)，激活了誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的某種程序，從而引發(fā)細(xì)胞壞死。

但無(wú)論細(xì)胞以哪一種狀態(tài)死亡，葉酸修飾組的細(xì)胞存活率都明顯低于其它組，顯示出一種優(yōu)良的抗腫瘤療效，增加了對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向的能力。但具體的凋亡及壞死機(jī)制尚不明確，本課題后期也將對(duì)GNA溶液、GNA-NISVs和FA-GNA-NISVs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡及壞死的具體路徑及機(jī)制，對(duì)實(shí)體腫瘤的抗癌效應(yīng)等進(jìn)一步探討。

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