新藤黃酸-pH敏感脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

★ 余瓊芳 周雅麗 張變 常佳麗 彭代銀 陳衛(wèi)東,4 張善堂

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 合肥 230012；3.安徽省立醫(yī)院藥劑科 合肥 230012；4.安徽道地藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心 合肥 230012)

新藤黃酸是從中藥藤黃中分離得到的有效抗腫瘤成分之一，其抗癌譜較廣，抗癌作用強(qiáng)，近年來(lái)的研究證實(shí)新藤黃酸對(duì)宮頸癌、肺癌、皮膚癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[1-7]。 但是，新藤黃酸的水溶性差，幾乎不溶于水，而易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，并且其藥動(dòng)學(xué)研究顯示，由于靜脈給藥血管刺激性強(qiáng)，半衰期短等缺點(diǎn)大大的限制了在臨床的應(yīng)用。為了使新藤黃酸能更好應(yīng)用于臨床并降低其毒副作用，Xia Huang等[8]將其制備成固體脂質(zhì)納米粒，減小了其血管刺激性并提高了其在體內(nèi)的生物利用度，Qing Luo等[9]將新藤黃酸裝載到立方液晶中，從而大大增加了其載藥量和包封率，并延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的生物半衰期。

據(jù)報(bào)道腫瘤微環(huán)境pH值要低于正常組織，因此可以利用這一特性制備一種具有pH敏感的載體，從而達(dá)到“智能”釋藥的目的。Juniala O. Silva等[10]成功制備了一種具有長(zhǎng)循環(huán)和pH敏感性的脂質(zhì)體用來(lái)包裹多柔比星，結(jié)果大大延長(zhǎng)生物半衰期，并且增加了肝、腎攝取量，提高了該藥物對(duì)腫瘤的特異性。因?yàn)橹|(zhì)體具有很好的生物相容性和低毒等特點(diǎn)，結(jié)合“智能”釋藥的目的，將pH敏感的脂質(zhì)體包載新藤黃酸，可改善其毒副作用，同時(shí)增加GNA對(duì)腫瘤的敏感性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠單次尾靜脈分別注射GNA溶液和GNA-PLS，采用HPLC法測(cè)定給藥后不同時(shí)間點(diǎn)新藤黃酸，初步闡明GNA-PLS在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征，為GNA的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-waters 1525高效液相色譜儀，包括Waters 2489紫外檢測(cè)器和Waters 1525泵；CP225D型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；LC-4016低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；XW-80A微型渦旋混合器(上海瀘西分析儀器廠有限公司)。

1.2 藥品與試劑 新藤黃酸對(duì)照品、原料藥以及內(nèi)標(biāo)藤黃酸B(MA)(純度≥98%，安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院GNA課題組提供)；GNA-PLS(實(shí)驗(yàn)室自制)；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3 動(dòng)物 成年SPF級(jí)SD大鼠(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-001)，雌雄各半，體重180～220g，安徽醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥劑量 參考GNA前期研究基礎(chǔ)，結(jié)合GNA靜脈給藥血管刺激性特別強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合制劑GNA-PLS中GNA濃度為0.275mg/mL、大鼠尾靜脈給藥體積不宜過(guò)大等一系列因素，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定給藥劑量為1.5mg/kg。該劑量下12只大鼠無(wú)死亡情況，原料藥組大鼠健康狀況良好。

2.2 給藥方法及血樣采集 健康SD大鼠，12只，雌雄各半，隨機(jī)平均分為兩組(GNA溶液組和GNA-PLS組)，于給藥前禁食12h，自由飲水。本實(shí)驗(yàn)采用單次尾靜脈注射的給藥方式，給藥劑量為1.50mg/kg，兩組均在給藥后0，3，5，10，20，40min及1，2，4，6，8h眼眥靜脈取血約0.3mL，加到肝素處理過(guò)的EP管內(nèi)，3500rpm離心10min后取上層血漿于-20℃避光冷凍保存，待用。

2.3 色譜條件 C18色譜柱(4.6mm×250mm, 5μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸(92:8)，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm，進(jìn)樣量為20μL。

2.4 對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

2.4.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取新藤黃酸5mg置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋溶解并定容到刻度，即得濃度為500μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取藤黃酸B 5mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，然后逐級(jí)稀釋到20μg/mL，4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 血漿樣品的處理 精密吸取大鼠血漿100μL，內(nèi)標(biāo)MA溶液10μL于1.5mL EP管中，渦旋混合后加入乙酸乙酯1mL，再渦旋震蕩5min，3500r/min 離心10min，取出全部上清于37℃氮?dú)獯蹈?，?00μL甲醇復(fù)溶，渦旋混合后15 000r/min離心10min，取20μL進(jìn)樣測(cè)定分析。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 觀察組 專屬性試驗(yàn) 取6只混合空白大鼠血漿、GNA和MA對(duì)照品溶液、GNA和MA空白血漿混合溶液、給藥5min后加內(nèi)標(biāo)處理的樣品、空白血漿加GNA溶液以及空白血漿加內(nèi)標(biāo)MA溶液，按照“2.5”項(xiàng)目方法處理，“2.3”色譜條件進(jìn)樣，考察內(nèi)標(biāo)MA和血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)是否對(duì)GNA的測(cè)定產(chǎn)生干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，MA和GNA分離完全，峰型良好，血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)GNA的測(cè)定無(wú)干擾。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)限 精密吸取大鼠空白血漿8份，每份90μL，置于1.5mL EP 管中，再精密吸取GNA儲(chǔ)備液和MA標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μL，分別配制成25,15,5,1,0.5,0.125,0.05μg/mL的GNA血漿樣品溶液。按“2.5”操作方法，“2.3”色譜條件進(jìn)樣。分別記錄GNA和MA的峰面積，并計(jì)算二者比值(Ratio, Ri)，以Ri為縱坐標(biāo)，GNA濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=3.7797X+0.0317,R2=0.9994，結(jié)果表明，GNA在0.05～25μg/mL之間線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)濃度為0.05μg/mL。

2.6.3 日間和日內(nèi)精密度試驗(yàn) 精密吸取90μL空白血漿樣品于1.5mL EP中，并按配制GNA低、中、高三種質(zhì)量濃度(分別為0.1、1.5、20μg/mL)，每種濃度各5份，再分別精密吸取10μL上述GNA濃度樣品和MA內(nèi)標(biāo)溶液于EP管中，按“2.5”方法處理，“2.3”色譜條件進(jìn)樣，將得到的Ri值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)測(cè)濃度，連續(xù)進(jìn)樣3天，考察日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果低、中、高三個(gè)質(zhì)量濃度樣品日內(nèi)精密度RSD%為14.12%、5.10%、6.29%；日間精密度RSD%為13.06%、1.36%、2.46%，結(jié)果表明該方法符合生物樣品分析要求。

2.6.4 回收率試驗(yàn) 精密吸取90μL空白血漿樣品于1.5mL EP中，并按配制GNA低、中、高三種質(zhì)量濃度(分別為0.1、1.5、25μg/mL)，每種濃度各5份，再分別精密吸取10μL上述GNA濃度樣品和MA內(nèi)標(biāo)溶液于EP管中，按“2.5”方法處理，“2.3”色譜條件進(jìn)樣，將得到的Ri值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算回收率。結(jié)果三個(gè)濃度平均回收率(n=5)分別為(97.93±6.24)%、(99.66±6.15)%、(93.82±7.18)%。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取低濃度0.1μg/mL、高濃度20μg/mL的質(zhì)控樣品各6份，按“2.5”方法，將樣品于室溫放置6h后處理與處理后放置6h，進(jìn)樣后與放置0h比較，RE%分別為-1.06%、0.976%；-2.46%、-0.255%。結(jié)果可知GNA大鼠血漿樣品在該條件下穩(wěn)定。

2.7 血藥濃度測(cè)定以及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)擬合 按照“2.2”方法收集血樣后，以“2.5”方法處理，“2.3”色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算血藥濃度。將得到的GNA血漿藥物濃度數(shù)據(jù)用DAS2.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行參數(shù)擬合。兩組平均藥時(shí)曲線如圖2，為了更清楚的看到圖2，分別繪制了3～20min藥時(shí)曲線和40～480min藥時(shí)曲線，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)涉及的GNA-pH敏感脂質(zhì)體為實(shí)驗(yàn)室自制，其最優(yōu)處方為GNA5.5mg、磷脂酰乙醇胺(PE)35mg、琥珀酸膽固醇單酯(CHEMS)8mg和膽固醇(CHOL)10mg，溶于2mL有機(jī)溶劑中為有機(jī)相，以0.1%的吐溫80為表面活性劑，加入到pH7.4 PBS的水相，采用溶劑揮發(fā)法制備，制備的GNA-pH敏感脂質(zhì)體的粒徑為200nm左右，包封率在80%以上。

圖1 各樣品的高效液相色譜圖

注：從上至下依次為：GNA+MA甲醇溶液；GNA+MA空白血漿溶液；MA血漿溶液；給藥后5min GNA-PLS溶液；空白血漿溶液；GNA空白血漿溶液

圖2 GNA-PLS和GNA在血漿中平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n=5)

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)GNA組GNA-PLS組Cmax(mg/L)4.672±2.03513.084±2.087**T1/2(min)48.074±14.70714.155±5.477**MRT0-480(min)71.226±22.810119.413±33.455*AUC0-480(mg/L*min)135.077±47.699240.243±32.427**AUC0-∞(mg/L*min)165.718±55.833340.950±71.355**

注：與GNA原料藥相比，*P<0.05，**P<0.01。

本實(shí)驗(yàn)初步考察了GNA-PLS與GNA在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLS包載GNA后可能改變了GNA在大鼠體內(nèi)的代謝行為，與GNA溶液相比，其Cmax、MRT0-480、AUC0-480、AUC0-∞都顯著增加，顯著提高了GNA在大鼠體內(nèi)的生物利用度，這可能是因?yàn)?/p>

GNA為脂溶性藥物，在體內(nèi)溶解度低，進(jìn)入體內(nèi)后不能很好的被完全吸收，而本研究選用的PE、CHEMS[11]等材料制備的GNA-PLS，增加了GNA的溶解性，減小了GNA的血管刺激性，提高了GNA的生物利用度。但是與GNA原料藥相比其T1/2確減小了，原因可能是制備脂質(zhì)體的腦磷脂為不飽和腦磷脂[12]，該磷脂的立體形狀為圓錐體，而且有文獻(xiàn)報(bào)道說(shuō)具有PE結(jié)構(gòu)的磷脂在血清中穩(wěn)定性不高[13]，所以GNA-PLS雖然增加了GNA在體內(nèi)的溶解度，吸收效率提高，但是并沒(méi)有延長(zhǎng)其半衰期，這也是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)缺陷，在后期研究中，將會(huì)加以改進(jìn)，為GNA進(jìn)入臨床研究進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

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