大鼠脊髓損傷后神經(jīng)連接蛋白1的表達(dá)①

郭永強(qiáng)，趙鑫，陳鐵戈，張東亮，王明，汪靜，李森，王海燕，伍亞民，張海鴻

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州市730030；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所三室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400042

脊髓損傷會(huì)引起肢體運(yùn)動(dòng)、軀體感覺以及內(nèi)臟活動(dòng)等一系列功能障礙，對(duì)患者家庭以及社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1]。促進(jìn)脊髓損傷后突觸再生有助于提高機(jī)體相關(guān)功能恢復(fù)[2-3]，改善預(yù)后。

神經(jīng)連接蛋白(neuroligins,NLs)家族作為突觸后一類細(xì)胞黏附分子，與突觸前軸突蛋白結(jié)合，形成跨突觸的復(fù)合結(jié)構(gòu)[4-5]。NLs在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期具有調(diào)節(jié)突觸形成的作用[6]，后期則主要影響神經(jīng)元興奮性[7]。NL1是目前研究最為清楚的NLs家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，除參與形成興奮性突觸后結(jié)構(gòu)外，NL1還與突觸發(fā)生形成以及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體形成有關(guān)[8-12]。NL1既是形成突觸的結(jié)構(gòu)蛋白，也是影響突觸發(fā)生形成以及信息傳遞的功能蛋白。

本實(shí)驗(yàn)研究動(dòng)態(tài)檢測(cè)大鼠脊髓損傷后NL1表達(dá)的變化，為進(jìn)一步研究脊髓損傷后突觸再生及其相關(guān)影響因素提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)成年雌性Sprague-Dawley大鼠60只，體質(zhì)量(200±10)g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字法，將動(dòng)物編號(hào)后等分為假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組，再用隨機(jī)數(shù)字法將兩組大鼠按照術(shù)后時(shí)間等分為3 d、7 d、14 d、21 d和28 d五個(gè)亞組。實(shí)驗(yàn)大鼠依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)福利與倫理原則進(jìn)行處理。

1.2 主要試劑和儀器

NL1抗體(H-45,OM160293)：OMNIMABS公司。Alexa Flour 647標(biāo)記山羊抗兔(H+L,A0468)：碧云天生物技術(shù)有限公司。FD快速Golgi-Cox染色試劑盒：美國(guó)NEUROTECHNOLOGIES公司。OCT冰凍切片包埋劑：美國(guó)SAKURA公司。Triton X-100、DAPI和Tween 20：SIGMA公司。RM2007 Allen打擊器：美國(guó)新澤西州大學(xué)。冰凍切片機(jī)和SP-2激光共聚焦顯微鏡：德國(guó)LEICA公司。

1.3 模型制作

動(dòng)物常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備。1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，待大鼠角膜反射消失后，背部剃毛備皮，俯臥位固定于鼠板上。定位標(biāo)記T10(兩耳尖連線向尾端三橫指處)，碘伏棉球擦拭消毒備皮術(shù)區(qū)。以T10標(biāo)記為中心，做長(zhǎng)約3 cm縱形切口，逐層分離皮下筋膜及肌肉組織，暴露并切除T9-11椎板，充分顯露T10節(jié)段脊髓。操作過程中不能損傷脊髓并保證硬脊膜完整。

將實(shí)驗(yàn)組大鼠固定到Allen打擊器上，調(diào)節(jié)打擊棒末端以對(duì)準(zhǔn)T10節(jié)段脊髓，打擊力度設(shè)置為10 g×25 mm，按打擊按鈕完成脊髓打擊。打擊成功的標(biāo)志為大鼠雙下肢痙攣性抽搐，尾巴翹起擺動(dòng)后倒下，被打擊部位脊髓立即出現(xiàn)充血水腫。

兩組大鼠均以無菌生理鹽水沖洗手術(shù)切口，逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚，碘伏棉球擦拭消毒手術(shù)切口。術(shù)后腹腔注射青霉素每天16萬U，共3 d?；謴?fù)自主排尿前，每天按壓膀胱協(xié)助排尿，早中晚各一次。

1.4 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

分別于各時(shí)間點(diǎn)，由2名以上熟悉BBB評(píng)分方法的非本實(shí)驗(yàn)組人員，對(duì)大鼠行BBB評(píng)分。大鼠放入曠場(chǎng)讓其爬行，觀察髖、膝和踝關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)情況，以及軀體運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)情況。實(shí)驗(yàn)組大鼠如術(shù)后1 d和3 d評(píng)分偏離平均值≥2分者予以剔除，及時(shí)造模補(bǔ)缺。

1.5 Golgi-Cox染色

取材前1 d將A、B液等體積混合并避光保存。每組取3只大鼠，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后活取脊髓，雙蒸水漂洗后浸入A、B混合液中，24 h后換液，室溫下避光放置2周。將組織轉(zhuǎn)移至C液中，次日換液，4℃避光放置72 h。吸水紙吸干組織表面液體，少量OCT包埋劑包埋后，置-80℃冰箱中速凍。冰凍切片機(jī)縱切片，厚60μm。組織切片貼在涂有C液、經(jīng)明膠包被的載玻片上。避光風(fēng)干24 h后雙蒸水沖洗兩次，每次4 min。將切片浸入D液、E液和雙蒸水比例為1∶1∶2的混合液中10 min；再依次浸入50%、75%和95%乙醇中脫水，每個(gè)梯度4 min；無水乙醇中脫水4次，每次4 min。二甲苯透明3次，每次4 min，高濃度樹脂封片劑封片。10×40倍鏡下觀察脊髓損傷中心上端白質(zhì)中樹突，10×100倍油鏡下計(jì)數(shù)10μm長(zhǎng)度內(nèi)樹突棘數(shù)。

1.6 免疫熒光染色

每組取3只大鼠，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，分別用0.01 mol/L PBS 200 ml和4%多聚甲醛溶液200 ml經(jīng)左心室灌注固定。以脊髓損傷部位為中心，遠(yuǎn)端和近端各延長(zhǎng)5 mm截取脊髓，浸入4%多聚甲醛溶液4℃冰箱固定24 h后，轉(zhuǎn)移含30%蔗糖0.01 mol/L PBS中脫水，待沉底后取出。OCT包埋劑包埋后，置-80℃冰箱速凍。冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚20μm。貼片后室溫自然風(fēng)干30 min，置-20℃冰箱中備用。

切片室溫復(fù)溫30 min，0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；0.3%Triton X-100破膜30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；5%正常山羊封閉血清封閉20 min；吸棄封閉液，吸水紙吸干，滴加NL1一抗(1∶20)，4℃冰箱孵育過夜；室溫復(fù)溫，吸棄一抗，含0.2%Tween 20的0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；吸水紙吸干；滴加Alexa Fluor 647熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶500)，37℃避光孵育1 h；吸棄二抗，含0.2%Tween 20的0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；滴加DAPI(10 mg/L)，常溫避光反應(yīng)3 min。吸棄DAPI，吸水紙吸干，抗熒光淬滅劑封片。選擇實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)域上段位置相對(duì)統(tǒng)一且組織結(jié)構(gòu)完整的切片，同時(shí)選擇假手術(shù)組相同脊髓節(jié)段切片，激光共聚焦顯微鏡200倍下掃描成像，拍照。Image J1.50i軟件計(jì)算平均光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果均用(xˉ±s)表示，假手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3 d雙后肢基本無自主活動(dòng)；術(shù)后7 d髖、膝關(guān)節(jié)活動(dòng)有所恢復(fù)，踝關(guān)節(jié)及趾跖關(guān)節(jié)均無活動(dòng)；術(shù)后14 d髖關(guān)節(jié)已能廣泛活動(dòng)，膝、踝關(guān)節(jié)輕微或廣泛活動(dòng)；術(shù)后21 d髖、膝及踝關(guān)節(jié)已能廣泛活動(dòng)，同時(shí)伴有爪背面支撐移動(dòng)或爪掌面著地；術(shù)后28 d除髖、膝、踝關(guān)節(jié)自主廣泛活動(dòng)外，已普遍可以用爪掌面承重移動(dòng)，但與前肢活動(dòng)的協(xié)調(diào)性較差，且軀干明顯不穩(wěn)。

假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)髖、膝、踝及趾跖關(guān)節(jié)活動(dòng)均正常。術(shù)后3 d部分大鼠有活動(dòng)時(shí)軀干不穩(wěn)現(xiàn)象，但術(shù)后7 d基本恢復(fù)正常。

術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分均顯著低于假手術(shù)組(P＜0.001)。見圖1。

圖1 各組大鼠BBB評(píng)分比較

2.2 Golgi-Cox染色

400倍光鏡下，各組損傷區(qū)上段結(jié)構(gòu)完整，大致同一區(qū)域白質(zhì)中樹突變化見圖2。與假手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3 d及7 d樹突減少不明顯，術(shù)后14 d、21 d和28 d樹突逐漸稀疏。

1000倍油鏡下各組樹突棘變化見圖3。與假手術(shù)組相比，脊髓損傷后樹突棘密度隨時(shí)間進(jìn)展逐漸降低(圖 4)。

2.3 免疫熒光染色

與假手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3 d NL1熒光信號(hào)開始增強(qiáng)，至術(shù)后14 d時(shí)最強(qiáng)；隨后逐漸減弱；術(shù)后28 d時(shí)仍高于假手術(shù)組(圖5、圖6)。

圖2 假手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)各組樹突形態(tài)(Golgi-Cox染色,bar=20μm)

圖3 假手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)各組樹突棘形態(tài)(Golgi-Cox染色,1000×)

圖4 各組大鼠樹突棘密度比較

圖5 各組大鼠NL1免疫熒光平均光密度比較

圖6 假手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)各組NL1表達(dá)(免疫熒光染色,200×)

3 討論

脊髓損傷后突觸再生與重塑有助于神經(jīng)功能恢復(fù)。突觸形成是一個(gè)包括多步驟的復(fù)雜過程，存在很多影響因素[13-14]。由于神經(jīng)系統(tǒng)再生能力差，且損傷后大量星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕增生，以及小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，使脊髓損傷后突觸再生受到限制[15-17]。脊髓損傷后，由于血-脊髓屏障被破壞，大量血管活性肽、細(xì)胞因子以及炎癥細(xì)胞進(jìn)入脊髓組織[18]，進(jìn)入組織的炎癥趨化因子可以通過與其受體結(jié)合，影響突觸形成[2]。NL1作為形成興奮性突觸的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，在突觸形成和發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

NL1是由神經(jīng)元合成的突觸后跨膜蛋白，在細(xì)胞內(nèi)與興奮性突觸后膜上的突觸后致密蛋白質(zhì)95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)通過-C端PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合序列相結(jié)合[19]，且與橋尾蛋白通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中部的一致性序列相結(jié)合[20]；同時(shí)NL1與突觸前軸突蛋白-1β通過細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域相連接[21]。NL1與軸突蛋白-1β在突觸發(fā)生和成熟過程中發(fā)揮重要作用[22]。既往研究表明[9-12]，NL1在神經(jīng)元中過表達(dá)，可促進(jìn)突觸生成；NL1被沉默時(shí)，突觸數(shù)量減少。

樹突棘作為構(gòu)成突觸后成分的特異性結(jié)構(gòu)，其密度和結(jié)構(gòu)改變可間接反映脊髓損傷后突觸修復(fù)情況[23]。本研究顯示，脊髓損傷后，樹突和樹突棘密度呈持續(xù)下降趨勢(shì)，而NL1的表達(dá)則呈先增高后降低的趨勢(shì)。由于NL1由神經(jīng)元合成，而脊髓損傷后有大量神經(jīng)元壞死和凋亡，導(dǎo)致樹突和樹突棘密度降低；而在損傷后28 d內(nèi)，NL1的表達(dá)都高于假手術(shù)組，NL1表達(dá)的升高并未與樹突及樹突棘密度的變化趨勢(shì)一致，提示NL1并未對(duì)突觸再生發(fā)生影響。另一方面，由于NL1是一種結(jié)構(gòu)和功能蛋白分子，即使NL1參與脊髓損傷后突觸再生，樹突棘密度在短期內(nèi)的變化并不能充分反映突觸再生情況。脊髓損傷后NL1對(duì)于突觸再生的影響還需進(jìn)一步研究。

Xu等[24]發(fā)現(xiàn)，NL1是血小板反應(yīng)蛋白-1促進(jìn)突觸生成的效應(yīng)分子；而血小板反應(yīng)蛋白-1在小鼠大腦損傷后表達(dá)升高，且是損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)所必需[25]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NL1在大鼠脊髓損傷后28 d內(nèi)表達(dá)都高于假手術(shù)組，但這一變化不足以引起損傷脊髓的突觸再生。其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]Shah RR,Tisherman SA.Spinal Cord Injury[M]//Falter F,Screaton NJ.Imaging the ICU Patient.London:Springer,2014:377-380.

[2]Freria CM,Hall JCE,Wei P,et al.Deletion of the fractalkine receptor,CX3CR1,improvesendogenousrepair,axon sprouting,and synaptogenesis after spinal cord injury in mice[J].J Neurosci,2017,37(13):3568-3587.

[3]Deng LX,Deng P,Ruan Y,et al.A novel growth-promoting pathway formed by GDNF-overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration,synapse formation,and partial recovery of function after spinal cord injury[J].J Neurosci,2013,33(13):5655-5667.

[4]Bottos A,Rissone A,Bussolino F,et al.Neurexins and neuroligins:synapses look out of the nervous system[J].Cell Mol Life Sci,2011,68(16):2655-2666.

[5]Ma?kowiak M,Mordalska P,W?dzony K.Neuroligins,synapse balance and neuropsychiatric disorders[J].Pharmacol Rep,2014,66(5):830-835.

[6]Krueger DD,Tuffy LP,Papadopoulos T,et al.The role of neurexinsand neuroliginsin the formation,maturation,and function of vertebrate synapses[J].Curr Opin Neurobiol,2012,22(3):412-422.

[7]Schapitz IU,Behrend B,Pechmann Y,et al.Neuroligin 1 isdynamically exchanged at postsynaptic sites[J].J Neurosci,2010,30(38):12733-12744.

[8]Kwon HB,Kozorovitskiy Y,Oh WJ,et al.Cortical synaptogenesis and excitatory synapse number are determined via a neuroligin-1-dependent intercellular competition[J].Nat Neurosci,2012,15(12):1667.

[9]Soler-Llavina GJ,Fuccillo MV,Ko J,et al.The neurexin ligands,neuroligins and leucine-rich repeat transmembrane proteins,perform convergent and divergent synaptic functions in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(40):16502-16509.

[10]Feng P,Akladious AA,Hu Y.Hippocampal and motor fronto-cortical neuroligin1 is increased in an animal model of depression[J].Psychiatry Res,2016,243:210-218.

[11]Suzuki K,Hayashi Y,Nakahara S,et al.Activity-dependent proteolytic cleavageof neuroligin-1[J].Neuron,2012,76(2):410-422.

[12]Budreck EC,Kwon OB,Jung JH,et al.Neuroligin-1 controls synaptic abundance of NMDA-type glutamate receptors through extracellular coupling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(2):725-730.

[13]Heikkinen A,Pihlajaniemi T,Faissner A,et al.Neural ECM and synaptogenesis[J].Prog Brain Res,2014,214:29-51.

[14]Giannone G,Mondin M,Grillo-Bosch D,et al.Neurexin-1βbinding to neuroligin-1 triggers the preferential recruitment of PSD-95 versus gephyrin through tyrosine phosphorylation of neuroligin-1[J].Cell Rep,2013,3(6):1996-2007.

[15]Smith GM,Strunz C.Growth factor and cytokine regulation of chondroitin sulfate proteoglycans by astrocytes[J].Glia,2005,52(3):209-218.

[16]Garland P,Broom LJ,Quraishe S,et al.Soluble axoplasm enriched from injured CNSaxons reveals the early modulation of the actin cytoskeleton[J].PLoSOne,2012,7(10):e47552.

[17]David S,Kroner A.Repertoire of microglial and macrophage responsesafter spinal cord injury[J].Nat Rev Neurosci,2011,12(7):388.

[18]Matsushita T,Lankford KL,Arroyo EJ,et al.Diffuse and persistent blood-spinal cord barrier disruption after contusive spinal cord injury rapidly recovers following intravenous infusion of bone marrow mesenchymal stem cells[J].Exp Neurol,2015,267:152-164.

[19]Südhof TC.Synaptic neurexin complexes:a molecular code for the logic of neural circuits[J].Cell,2017,171(4):745-769.

[20]Poulopoulos A,Aramuni G,Meyer G,et al.Neuroligin 2 drives postsynaptic assembly at perisomatic inhibitory synapses through gephyrin and collybistin[J].Neuron,2009,63(5):628-642.

[21]Südhof TC.Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitivedisease[J].Nature,2008,455(7215):903.

[22]Craig AM,Kang Y.Neurexin-neuroligin signaling in synapse development[J].Curr Opin Neurobiol,2007,17(1):43-52.

[23]Darian-Smith C.Synaptic plasticity,neurogenesis,and functional recovery after spinal cord injury[J].Neuroscientist,2009,15(2):149-165.[24]Xu J,Xiao N,Xia J.Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1[J].Nat Neurosci,2010,13(1):22-24.

[25]Liauw J,Hoang S,Choi M,et al.Thrombospondins 1 and 2 are necessary for synaptic plasticity and functional recovery after stroke[J].J Cerebr Blood FMet,2008,28(10):1722-1732.