卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響因素

蔡嬌嬌 陸文昊 楊歡利 李真法 諸溢揚(yáng)

臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))浙江省臺(tái)州醫(yī)院(317199)

高質(zhì)量的卵母細(xì)胞是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功的重要前提。卵母細(xì)胞質(zhì)量除了受婦女年齡、超排卵治療的影響外，還受到顆粒細(xì)胞功能和子宮內(nèi)膜異位癥等因素的影響。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多專家學(xué)者開始從細(xì)胞水平和分子水平進(jìn)一步闡述這些影響因素的作用機(jī)制。

1 年齡的影響

隨著女性年齡的增加，獲卵數(shù)和卵母細(xì)胞質(zhì)量都明顯下降，妊娠率降低，流產(chǎn)率升高。Wright等[1]統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)<35歲女性ET后臨床妊娠率高達(dá)46%，35～37歲下降至23%，而>42歲則只有4%。研究發(fā)現(xiàn)卵巢儲(chǔ)備功能下降的同時(shí)，卵母細(xì)胞非整倍體增加，熒光原位雜交的方法測(cè)定>35歲婦女卵子的第一、二極體中的13、18、21和性染色體，發(fā)現(xiàn)非整倍體的發(fā)生率分別為21.8%和20.3%[2]。除了染色體層面的異常，隨著年齡的增長(zhǎng)，卵胞質(zhì)中線粒體、皮質(zhì)顆粒等細(xì)胞器相應(yīng)減少，高齡婦女(≥38歲)比年輕婦女的5kb線粒體DNA缺失率增高3.3倍[3]，此外，年齡也影響了顆粒細(xì)胞和卵泡液，通過(guò)改變卵母細(xì)胞外的微環(huán)境間接導(dǎo)致卵子質(zhì)量發(fā)生變化[4]。新的研究發(fā)現(xiàn)，一些調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA往往因年齡和(或)卵巢儲(chǔ)備而差異表達(dá)。有趣的是，體內(nèi)成熟卵的mRNA轉(zhuǎn)錄組在年齡和卵巢儲(chǔ)備不同情況下仍非常穩(wěn)定，說(shuō)明改變發(fā)生在非編碼轉(zhuǎn)錄組，其可能調(diào)控某些轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄前機(jī)制來(lái)影響卵子發(fā)育潛能[5]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場(chǎng)所，在減數(shù)分裂及有絲分裂過(guò)程中位于紡錘體附近，為中心體、細(xì)胞骨架、染色體活動(dòng)提供能量，ATP含量的減少可以干擾紡錘體上微管蛋白的聚合和解聚，從而影響染色體分離，導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生[6]。受精過(guò)程是一個(gè)耗能過(guò)程，卵漿ATP含量下降引起能量代謝異常，ATP含量低的卵子也能受精和早期分裂，僅當(dāng)ATP含量≥2pmol時(shí)，受精的卵子才容易著床和繼續(xù)發(fā)育[7]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)高齡患者卵母細(xì)胞中的端粒長(zhǎng)度明顯短于年輕患者卵母細(xì)胞，端粒酶活性也相對(duì)較差，端粒變短會(huì)影響同源染色體聯(lián)會(huì)、減數(shù)分裂，導(dǎo)致非整倍體的出現(xiàn)[8]。從本質(zhì)上說(shuō)，年齡對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響主要源自線粒體、端粒等結(jié)構(gòu)和功能的變化，繼而影響胚胎后續(xù)發(fā)育潛能。

2 顆粒細(xì)胞的作用

卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是卵子、周圍顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞相互作用的共同結(jié)果。在卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中，顆粒細(xì)胞由扁平單層變成柱狀復(fù)層，合成并分泌包圍卵母細(xì)胞的黏多糖從而形成透明帶，與卵母細(xì)胞形成縫隙連接，進(jìn)行細(xì)胞間營(yíng)養(yǎng)及小分子物質(zhì)交換、信息傳遞[9-10]。自次級(jí)卵泡至形成卵泡竇腔，顆粒細(xì)胞分化成壁層顆粒細(xì)胞和包繞卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞?？p隙連接的基本單位是連接蛋白，卵丘細(xì)胞通過(guò)縫隙連接切斷外層卵丘細(xì)胞減數(shù)分裂抑制信號(hào)從而恢復(fù)減數(shù)分裂，研究表明連接蛋白43的減少在其中有著重要影響[11]。在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，卵冠丘復(fù)合物的很大一部分葡萄糖通過(guò)糖酵解途徑提供能量和底物，葡萄糖濃度的過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)成熟的不同步[12]。此外，卵丘細(xì)胞分泌的小分子物質(zhì)如cAMP、三磷酸肌醇、Ca2+、氨基酸等通過(guò)縫隙連接進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)并調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)與成熟[13]。卵子成熟后，卵丘細(xì)胞上的前列腺素E2受體對(duì)前列腺素E2產(chǎn)生應(yīng)答，繼而決定卵泡破裂的位置[14]。

此外，活性氧(ROS)過(guò)剩會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損壞，如脂類、細(xì)胞膜、蛋白和DNA損傷?；钚匝踝杂苫粌H參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、啟動(dòng)有絲分裂、防御病原體，他的另一個(gè)生理機(jī)能是參與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、排卵、黃體功能及卵泡閉鎖[15]。早在1993年，褪黑素(MT)就被發(fā)現(xiàn)是自由基的強(qiáng)有力清除者，它是一種由哺乳動(dòng)物和人類松果體產(chǎn)生的胺類激素，存在于全身各組織細(xì)胞，在竇卵泡的卵泡液中，其濃度是血清濃度的3倍，MT自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易發(fā)生自氧化，且和自由基相互作用后的代謝產(chǎn)物仍是強(qiáng)有力的抗氧化物質(zhì)。MT受體(MR)有3種亞型(MR1、MR2、MR3)，研究發(fā)現(xiàn)人顆粒細(xì)胞的細(xì)胞膜中可檢測(cè)到MR1和MR2，也就是說(shuō)顆粒細(xì)胞可以通過(guò)MR識(shí)別MT，從而減少活性氧對(duì)卵母細(xì)胞的傷害，最近的研究發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞不僅能識(shí)別褪黑素，同時(shí)還能產(chǎn)生褪黑素[16]。除此之外，卵泡局部產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)能促進(jìn)有絲分裂并起到抗凋亡的作用，MT可通過(guò)顆粒細(xì)胞上的受體刺激其產(chǎn)生IGF-I，從而激活下游信號(hào)通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和代謝[17]。但是顆粒細(xì)胞代謝增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生大量ROS，反過(guò)來(lái)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞促性腺激素和類固醇生成功能喪失，使相應(yīng)卵子失去顆粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能，從而影響其受精、卵裂及后續(xù)的胚胎發(fā)育過(guò)程[18]。顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)基因表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)有差異表達(dá)的基因涉及到卵母細(xì)胞的不同功能?？梢?jiàn)，保持顆粒細(xì)胞功能的正常運(yùn)行對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及后續(xù)胚胎的發(fā)育有著至關(guān)重要的作用。

3 控制性超促排卵的利與弊

控制性超排卵(COH)是一個(gè)超生理卵泡募集、發(fā)育、排卵的過(guò)程，其實(shí)質(zhì)是延長(zhǎng)FSH的閾值窗，募集更多的卵泡發(fā)育。這一過(guò)程是不完全同步的，要克服不同步因素才有可能獲得質(zhì)量與自然周期主導(dǎo)卵泡一樣的優(yōu)質(zhì)卵子。目前國(guó)內(nèi)常用的幾種促超排卵方案有促性腺釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長(zhǎng)方案、短方案以及長(zhǎng)效GnRH-a方案，其他還有拮抗劑方案及微刺激等。早在1986年臨床試驗(yàn)已證明卵泡發(fā)育早期的黃體生成素(LH)峰會(huì)降低卵子質(zhì)量，影響胚胎發(fā)育，降低妊娠率[19]。國(guó)內(nèi)外諸多研究也證實(shí)GnRH-a長(zhǎng)方案對(duì)下丘腦有效降調(diào)節(jié)可保證卵泡發(fā)育的同步性，提高卵子質(zhì)量；而長(zhǎng)方案組絨毛膜促性腺激素(hCG)注射日LH水平顯著低于短方案組，這也就說(shuō)明長(zhǎng)方案促排卵過(guò)程中對(duì)LH水平的調(diào)控影響了卵母細(xì)胞質(zhì)量[20]。前文已提到IGF-I是一種細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在卵泡募集、生長(zhǎng)和閉鎖等方面均發(fā)揮了重要作用。已有研究報(bào)道GnRH-ant方案hCG日血清、取卵日血清及卵泡液中IGF-I水平均高于GnRH-a方案，卵母細(xì)胞成熟度也明顯提高，說(shuō)明拮抗劑的使用提高了IGF-I水平，而IGF-I協(xié)同促進(jìn)了卵母細(xì)胞成熟[21]。

當(dāng)然，超促排過(guò)程中外源性Gn的使用并非對(duì)卵子沒(méi)有傷害，有報(bào)道認(rèn)為卵母細(xì)胞代謝異常、ATP含量下降、核/質(zhì)成熟不同步、微管混亂等變化很可能是因?yàn)橥庠葱源傩韵偌に卦诜巧頎顟B(tài)下雖然促進(jìn)了多個(gè)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，但也損害了線粒體功能，影響了細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[22]。此外，促排卵過(guò)程中棕色卵子透明帶色澤改變，與促排卵中使用卵泡刺激素(FSH)與血清FSH濃度有關(guān)，血清高濃度FSH可能造成透明帶顏色異常，最終導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛能低下[23]。在臨床COH過(guò)程中，促排卵藥物的使用導(dǎo)致體內(nèi)各項(xiàng)激素水平發(fā)生改變，同時(shí)部分生長(zhǎng)激素的分泌發(fā)生變化導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量受到影響。為獲得高質(zhì)量的卵子和胚胎以及更好的子宮種植環(huán)境，掌握促排卵藥物的適當(dāng)劑量以及用藥時(shí)間是非常重要的。

4 子宮內(nèi)膜異位癥的影響

子宮內(nèi)膜異位癥(EM)是一種復(fù)雜的炎性疾病，影響了10%～15%的育齡婦女，其對(duì)生育能力造成的損害是多方面的，包括卵巢功能改變、盆腔粘連、腹腔內(nèi)環(huán)境異常、子宮內(nèi)膜異常和卵泡發(fā)育異常等，其中卵泡發(fā)育異常、卵母質(zhì)量下降是導(dǎo)致不孕的主要原因之一。相比于其他原因不孕患者，EM患者卵泡生長(zhǎng)速度減慢，受精率和妊娠率明顯下降，并伴有較多空卵泡和卵泡閉鎖發(fā)生[24]。新的研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者成熟卵數(shù)和正常形態(tài)卵子數(shù)顯著降低，此外，I～I(xiàn)V期子宮內(nèi)膜異位癥患者褐色卵增加，IV期患者比I～I(xiàn)II期患者卵子質(zhì)量更差[25]，顆粒細(xì)胞相對(duì)更易凋亡脫落，透明帶硬度變大[26]。

到目前為止，EM的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為免疫功能紊亂是其導(dǎo)致不孕的重要原因。腹膜炎癥微環(huán)境改變，包括激素水平失衡、氧化應(yīng)激反應(yīng)等都會(huì)引起卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量變差。研究發(fā)現(xiàn)EM患者卵泡液環(huán)境比其他不孕患者易導(dǎo)致更大的氧化應(yīng)激，引起活性氧自由基大量產(chǎn)生，繼而引起卵母細(xì)胞損傷，而受損的子宮內(nèi)膜則直接導(dǎo)致胚胎著床失敗[27-28]。

研究表明，EM患者體內(nèi)卵泡液中T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞比例增加，T細(xì)胞表達(dá)分泌的T細(xì)胞激活性低分泌因子(RANTES) 顯著增加，而單核細(xì)胞趨化蛋白1 ( MCP-1) 則明顯減少，這兩種趨化因子均能反映免疫系統(tǒng)的局部調(diào)控作用[29]。事實(shí)上，EM患者相對(duì)于輸卵管性不孕患者妊娠率低、流產(chǎn)率高的結(jié)局，似乎也印證了免疫功能紊亂引起的卵泡液微環(huán)境改變導(dǎo)致卵母細(xì)胞及胚胎受損的結(jié)論。同時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白介素、腫瘤壞死因子在EM患者卵泡液中的增加也擾亂了顆粒細(xì)胞正常細(xì)胞周期，對(duì)卵泡形成產(chǎn)生病理性作用，同時(shí)顆粒細(xì)胞內(nèi)部芳香化酶活性和孕激素降低，合成類固醇激素的能力變差[30]。因此，EM患者卵母細(xì)胞質(zhì)量受到多方面的共同作用，目前尚未有定論，專家學(xué)者對(duì)此觀念也不一致，本文更多傾向于免疫功能紊亂起到更大的影響。

綜上所述，影響卵母細(xì)胞的因素是多方面的。雖然學(xué)者們對(duì)卵母細(xì)胞評(píng)估在輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用做了大量的研究，但每個(gè)具體的卵子異常特性對(duì)胚胎發(fā)育、妊娠結(jié)局的影響仍存在爭(zhēng)議。輔助生育技術(shù)迅速發(fā)展，如何得到高質(zhì)量的胚胎和高臨床妊娠率一直是關(guān)注的焦點(diǎn)，了解卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響因素，通過(guò)新技術(shù)手段改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，從而提高胚胎的發(fā)育能力，獲得最具著床潛能的胚胎意義重大。

參考文獻(xiàn)

[1] Wright VC, Chang J, Jeng G, et al. Assisted reproductive technology surveillance-United States,2004 [J].MMWR Surveill Summ, 2007,56(6):1-22.

[2] Hull MG, Fleming CF, Hughes AO, et al.The age-related decline in female fecundity：a quantitative controlled study of implanting capacity and survival of individual embryos after in vitro fertilization[J].Fertil Steril,1996,65(4):783-790.

[3] Tarín JJ, Brines J, Cano A. Long-term effects of delayed parenthood[J].Hum Reprod, 1998,13(9):2371-2376.

[4] Iwata H. Age-associated changes in granulosa cells and follicular fluid in cows[J]. J Reprod Dev, 2017,63(4):339-345.

[5] Barragán M, Pons J, Ferrer-Vaquer A,et al. The transcriptome of human oocytes is related to age and ovarian reserve[J]. Mol Hum Report, 2017,23(8):535-548.

[6] Cohen J, Scott R, Alikani M, et al. Ooplasmic transfer in mature human oocytes [J].Mol Hum Reprod, 1998,4 (3): 269-280.

[7] Van Blerkom J, Davis PW, Lee J.ATP content of human oocytes and develop mental potential and outcome after in-vitro fertilization and embryo transfer[J].Hum Reprod,1995,10 (2):415-424.

[8] Yamada-Fukunaga T, Yamada M, Hamatani T, et al. Ageassociated telomere shortening in mouse oocytes[J].Reprod Biol Endocrinol, 2013,11:108.

[9] Bruzzone R, White TW, Paul DL. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling[J].Eur J Biochem,1996,238(1):1-27.

[10] Isobe N, Maeda T, Terada T. Involvement of meiotic resumption in the disruption of gap junctions between cumulus cells attached to pig oocytes[J].J Reprod Fertil, 1998,113(2):167-172.

[11] Shimada M, Maeda T, Terada T. Dynamic changes of connexin-43, gap junctional protein, in outer layers of cumulus cells are regulated by PKC and PI 3-kinase during meiotic resumption in porcine oocytes[J].Biol Reprod.,2001,64(4):1255-1263.

[12] Sutton -McDowall ml, Gilchrist RB, Thompson JG. The pivotal role of glucose metabolism in determining oocyte developmental competence [J].Reproduction,2010,139(4):685-695.

[13] Tanghe S, Soom AV, Nauwynck H, et al. Minireview: Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation and fertilization. Mol Reprod Dev ,2002,61:414-424.

[14] Harris SM，Aschenbach LC，Skinner SM，et al. Prostaglandin E2 receptors are differentially expressed in subpopulations of granulosa cells from primate periovulatory follicles [J]. Biol Reprod, 2011, 85(5): 916-923.

[15] Das S, Chattopadhyay R, Ghosh S, et al. Reactive oxygen species level in follicular fluid--embryo quality marker in IVF? [J] Hum Reprod, 2006,21(9):2403-2407.

[16] Kim MK，Park EA，Kim HJ，et al. Does supplementation of in-vitro culture medium with melatonin improve IVF outcome in PCOS?[J]. Reprod Biomed Online,2013,26(1):22-29.

[17] Picinato MC, Hirata AE, Cipolla-Neto J, et al. Activation of insulin and IGF-I signaling pathways by melatonin through MT1 receptor in isolated rat pancreatic islets. J Pineal Res,2008,14(1):88-94.

[18] Ebisch IM, Thomas CM, Peters WH, et al.The importance of folate，zinc and antioxidants in the pathogenesis and prevention of subfertility[J].Hum Reprod Update,2007,13(2):163-174.

[19] Howles CM, Macnamee MC, Edwards RG, et al. Effects of high tonic levels of luteinising hormone on outcome of in vitro fertilization[J].Lancet,1986,2(8505):15l-152.

[20] 崔媛媛, 劉冬娥, 李玉梅, 等. GnRH-a長(zhǎng)方案與改良短方案對(duì)IVF-ET妊娠結(jié)局的影響[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究,2010,27(9):1712-1715.

[21] 張俊娣, 郝桂敏, 王少卿, 等. 兩種超促排卵方案在體外受精-胚胎移植中的應(yīng)用[J]. 河北醫(yī)藥,2016,38(11):1673-1675.

[22] 戴蜜蜜, 葛紅山, 呂杰強(qiáng). 控制性超排卵和體外成熟培養(yǎng)對(duì)卵子線粒體膜電位及細(xì)胞骨架的影響[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 32(16):2625-2628.

[23] 徐鴻毅, 鄧鍇, 羅清炳, 等. 棕色卵子形成原因及在體外受精胚胎移植中對(duì)妊娠結(jié)局的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào), 2016,37(2):258-264.

[24] Omland AK, Fedorcsák P, Storeng R, et al. Natural cycle IVF in unexplained, endometriosis-associated and tubal factor infertility[J]. Hum Reprod,2001,16(12):2587-2592.

[25] Shebl O, Sifferlinger I, Habelsberger A, et al. Oocyte competence in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection patients suffering from endometriosis and its possible association with subsequent treatment outcome: a matched case-control study[J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2017, 96(6):736-744.

[26] Goud PT, Goud AP, Joshi N, et al. Dynamics of nitric oxide, altered follicular microenvironment, and oocyte quality in women with endometriosis[J].Fertil Steril,2014,102:151-159.

[27] Miller JE, Ahn SH, Monsanto SP, et al. Implications of immune dysfunction on endometriosis associated infertility[J]. Oncotarget, 2016,10:1-10.

[28] Saito H, Seino T, Kaneko T, et al. Endometriosis and oocyte quality[J].Gynecol Obstet Invest, 2002, 53(1):46-51.

[29] Xu H, Schuhze MA, Agic A, et al. Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) and monocyte chemotactic protein 1 in follicular fluid accumulate differentially in patients with and without endometriosis undergoing in vitro fertilization[J]. Fertil Steril,2006,86(6):1616-1620.

[30] Monteleone P, Giovanni Artini P, Simi G, et al. Follicular fluid VEGF levels directly correlate with perifollicular blood flow in normoresponder patients undergoing IVF[J].J Assist Reprod Genet,2008,25(5):183-186.