黃體酮陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)檢測的方法學(xué)研究

邱順晨 姚小東 劉振齊 谷翊群 寧美英

國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所藥物和醫(yī)用材料研究中心(北京，100081)

黃體功能不全不僅能導(dǎo)致閉經(jīng)、功能性子宮出血等，還是造成不孕和流產(chǎn)的重要原因。因此，給予黃體支持成為多數(shù)輔助生殖技術(shù)的常規(guī)步驟之一。目前應(yīng)用的黃體支持藥物主要有人絨毛膜促性腺激素(hCG)、天然黃體酮及人工合成的孕酮類激素。研究報(bào)道稱合成孕酮類激素具有致畸胎作用而天然黃體酮未見相關(guān)報(bào)道[1]。因此，以黃體酮為原料藥開發(fā)的黃體支持產(chǎn)品具有良好的市場前景和經(jīng)濟(jì)效益。陰道給藥是一種新興的給藥系統(tǒng)，黃體酮緩釋凝膠Crinone是一種由微粉化黃體酮制備而成的供陰道給藥的凝膠劑。大量研究表明，Crinone不僅與肌注具有相同的療效[2-5]，還兼具陰道給藥的優(yōu)點(diǎn)。然而，Crinone仍然存在以下缺點(diǎn)：需要每天使用，患者順應(yīng)性不好；藥物釋放不夠平穩(wěn)；凝膠易流出污染衣物。陰道環(huán)也是陰道給藥系統(tǒng)中的一個(gè)劑型[6]，相對(duì)于陰道凝膠，具有不需要每天給藥；患者可自行取放，順應(yīng)性更好；不會(huì)污染衣物；藥物釋放更加平穩(wěn)等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用了注塑成型法制備黃體酮陰道環(huán)[7]，建立了黃體酮陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜(HPLC)檢測方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，旨為黃體酮陰道環(huán)制劑的體外質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

黃體酮原料藥(云南麗江映華生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1511001W)；MED-6382液體硅橡膠(美國Nusil Technology，批號(hào)：63227)；辛酸亞錫催化劑(美國Nusil Technology，批號(hào)：63227)；乙腈(Fisher公司，色譜純，批號(hào)：150011)；甲醇(Fisher公司，色譜純，批號(hào)：150939)。

1.2 儀器

Sartorius-BT224S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；CSR-4-10超純水機(jī)(北京愛斯泰克科技開發(fā)有限公司)；陰道環(huán)模具(北京東洛機(jī)電有限責(zé)任公司)；ED23型烘箱(德國賓得公司)；藥物光照試驗(yàn)箱(YG120,上海一恒科技有限公司)；RT5型磁力攪拌器(ZKA公司)；Waters2695高效液相色譜儀，Waters2487檢測器(Waters公司)；Diamonsil C8型液相色譜柱(北京迪科瑪科技有限公司)。

1.3 黃體酮陰道環(huán)的制備

將陰道環(huán)模具置80℃的烘箱中預(yù)熱15min。稱取黃體酮1.33g，MED6382硅橡膠10g，混合均勻后按照100:0.5的比例加入辛酸亞錫催化劑，繼續(xù)攪拌15s?？焖賹⒒旌衔锛尤氲?0ml注射器中，勻速且快速地注入到預(yù)熱好的模具中。將模具放到80℃烘箱中加熱30min，成型后開模取出即得。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 HPLC檢測條件色譜柱Diamonsil C8(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)；檢測波長241 nm；流速1.5 ml/min；進(jìn)樣量10 μl；柱溫30℃。

1.4.2供試品溶液的配制取黃體酮基質(zhì)型陰道環(huán)(含黃體酮400 mg)，切成0.5mm薄片，置于裝有100 ml甲醇的錐形瓶中，室溫下磁力攪拌24h后， 經(jīng)0.45μm 濾膜濾過。取續(xù)濾液1ml于100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取1 ml稀釋液于25 ml的容量瓶中，加甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀釋至刻度，搖勻，于4℃冷藏，備用。

1.4.3自身對(duì)照溶液的配制精密量取1.4.2項(xiàng)下黃體酮供試品溶液1.0 ml，置于100 ml量瓶中，用甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀釋至刻度，搖勻，得黃體酮自身對(duì)照溶液，于4℃冷藏，備用。

1.5 專屬性試驗(yàn)

1.5.1空白干擾按照1.3的方法制備2個(gè)空白陰道環(huán)，再將其均勻切成薄片(厚度0.5 mm)，置于裝有100ml甲醇的具塞錐形瓶中，磁力攪拌24h，經(jīng)0.45μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液1.0 ml置于10 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，HPLC法檢測，記錄色譜圖。

1.5.2酸破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5mm 薄片，置于具塞錐形瓶中，再加1mol/L 鹽酸溶液適量，于室溫放置24h，加0.1mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)至中性，加100ml甲醇。室溫下磁力攪拌24h，經(jīng)0.45μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液1 ml于100 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取1 ml稀釋液于25 ml的容量瓶中，加甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀釋至刻度，搖勻，HPLC法檢測，得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.3堿破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5mm 薄片，置于具塞錐形瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液適量， 于室溫放置24h， 加0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，再加100ml甲醇。同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC法檢測，得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.4氧化破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5 mm薄片。加3% 過氧化氫試液適量，室溫放置8h，加100ml甲醇。同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC法檢測，得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.5高溫破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5mm 薄片，置于具塞錐形瓶中，于60℃烘箱中放置24h后取出，放至室溫，加100ml甲醇。同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC法檢測，得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.6光照破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5 mm 薄片。于( 4500±500) Lx光照條件下放置48h，置于具塞錐形瓶中，加100 ml甲醇。 同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC法檢測，得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.6 檢測限

將黃體酮對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，按照1.4.1 HPLC檢測條件進(jìn)行HPLC檢測， 直到信噪比(S/N)為3/1，計(jì)算得到檢測限。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.4.2方法平行制備黃體酮供試品溶液，按1.4.3方法平行制備黃體酮自身對(duì)照溶液各6份，進(jìn)行HPLC檢測。按主成分自身對(duì)照法計(jì)算黃體酮中未知雜質(zhì)含量。

1.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取黃體酮供試品溶液，按照1.4.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0，4，8，12，24h時(shí)進(jìn)行HPLC檢測， 記錄主成分、有關(guān)物質(zhì)及雜質(zhì)的峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。

1.9 有關(guān)物質(zhì)檢查

取3批黃體酮陰道環(huán)，制備黃體酮供試品溶液及自身對(duì)照溶液，分別精密量取10μl及自身對(duì)照溶液10μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液和對(duì)照液各10μl，分別進(jìn)行HPLC檢測，記錄色譜圖至黃體酮峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，用自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)的含量。

2 結(jié)果

2.1專屬性實(shí)驗(yàn)

2.1.1空白干擾試驗(yàn)黃體酮檢測條件下的空白陰道環(huán)HPLC檢測圖譜見圖1。結(jié)果表明，在黃體酮相應(yīng)的保留時(shí)間并無其他峰出現(xiàn)，說明空白陰道環(huán)的硅橡膠輔料并不會(huì)對(duì)黃體酮的相關(guān)檢測產(chǎn)生干擾。

2.1.2強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果見圖2所示。黃體酮陰道環(huán)經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后，黃體酮會(huì)有輕微的降解，但是各降解產(chǎn)物峰與主要兩峰均可達(dá)到良好分離。

圖1黃體酮檢測條件下空白陰道環(huán)HPLC檢測圖譜

圖2在未處理(A)、酸(B)、堿(C)、氧化(D)、高溫(E)、光照(F)條件下黃體酮陰道環(huán)HPLC檢測圖譜

2.2 檢測限

黃體酮陰道環(huán)中黃體酮HPLC檢測限為0.5 ng/ml。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

6份供試品溶液中黃體酮雜質(zhì)總和的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8 %，重復(fù)性良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

黃體酮供試品溶液在24 h內(nèi)雜質(zhì)峰面積總和RSD為1.9 %，表明黃體酮供試品溶液在24 h內(nèi)均基本穩(wěn)定。

2.5 有關(guān)物質(zhì)檢查

3批樣品測定結(jié)果見表1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，所制備的3批樣品在黃體酮HPLC檢測條件下，單雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量均<0.5%，符合藥典要求。

表1 黃體酮陰道環(huán)中黃體酮HPLC檢測的雜質(zhì)含量(%)

3 討論

本研究對(duì)2015版藥典中黃體酮的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)過不斷的摸索，將原有的甲醇-乙腈-水(25:35:40，v/v)調(diào)整為甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該比例下分離效果更好，峰形也更優(yōu)。

由于陰道環(huán)制劑的特殊性，藥物從硅橡膠中的徹底提取相對(duì)困難，因此對(duì)于藥物的提取方法也進(jìn)行了優(yōu)化，通過對(duì)超聲法、磁力攪拌法及兩者結(jié)合法的考察，篩選了甲醇、乙腈兩種提取溶劑，考察了不同的磁力攪拌時(shí)間，最終選擇室溫下磁力攪拌24h作為藥物的提取方法。

本研究采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)黃體酮陰道環(huán)中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測。專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明輔料完全不干擾主藥黃體酮的測定。有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果表明，單雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量均<0.5%，也不會(huì)對(duì)主藥的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。

國內(nèi)尚無關(guān)于黃體酮陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的檢測方法的報(bào)道，本研究優(yōu)化了流動(dòng)相比例，將HPLC法應(yīng)用于黃體酮陰道環(huán)的有關(guān)物質(zhì)的檢測，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，此法的專屬性強(qiáng)，靈敏度高，符合相關(guān)規(guī)定的要求，可以為黃體酮陰道環(huán)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)。

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