骨骼肌中與運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展

張海濱 田雪文

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練作為最佳的非藥物學(xué)策略，在多種病理生理?xiàng)l件下能夠預(yù)防或減輕骨骼肌萎縮及損傷，對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生積極效應(yīng)。骨骼肌對(duì)收縮刺激具有顯著的可塑性。在不同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練刺激下，骨骼肌分子和形態(tài)產(chǎn)生不同適應(yīng)性，以滿足其功能需求。盡管運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)骨骼肌在收縮特性、線粒體功能和血管生成等方面的重塑，但運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌重塑反應(yīng)的信號(hào)通路和分子學(xué)機(jī)制尚未明確。由于基因僅僅是遺傳物質(zhì)的載體，同一組基因在不同階段或環(huán)境下轉(zhuǎn)錄翻譯后表達(dá)的蛋白質(zhì)不同，所產(chǎn)生的生理功能不同。隨著后基因時(shí)代的發(fā)展，蛋白質(zhì)組在基因組基礎(chǔ)上被提出，蛋白質(zhì)組學(xué)研究開(kāi)始受到國(guó)內(nèi)外科研工作者的青睞。蛋白質(zhì)組學(xué)是在特定刺激條件下，對(duì)單一細(xì)胞或組織基因組翻譯后表達(dá)的所有蛋白質(zhì)特質(zhì)進(jìn)行分析的科學(xué)?；谫|(zhì)譜和生物信息學(xué)的蛋白質(zhì)組學(xué)，能夠確定與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練相關(guān)的骨骼肌重塑潛在分子標(biāo)記，綜合觀察運(yùn)動(dòng)刺激反應(yīng)的分子通路，更好的解釋運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨骼肌重塑的影響。本文通過(guò)綜述蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，及其對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)骨骼肌重塑的影響，以促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)在運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

1. 骨骼肌差異蛋白分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)能夠分析骨骼肌復(fù)雜混合物中的單個(gè)蛋白質(zhì)，因此可以更深入地了解肌肉多樣性和可塑性。然而因肌纖維類型不同、骨骼肌之間異質(zhì)性以及方法學(xué)方面的因素，對(duì)骨骼肌進(jìn)行全面蛋白質(zhì)組學(xué)分析仍存在一定的挑戰(zhàn)。骨骼肌作為高能量需求的重要組織，線粒體無(wú)疑成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)。骨骼肌釋放的作用于機(jī)體局部或全身的分泌蛋白也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目標(biāo)。借助差速離心、流式細(xì)胞術(shù)等分離純化技術(shù)提取出骨骼肌或其亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組樣品，就可使用基于凝膠或非凝膠方法結(jié)合標(biāo)記或無(wú)標(biāo)記的定量策略進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要涉及蛋白質(zhì)組表達(dá)模式和蛋白質(zhì)組功能模式兩方面的研究，目前大部分集中在蛋白質(zhì)組表達(dá)模式方面。這方面的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)主要指蛋白質(zhì)分離技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)。

1.1 蛋白質(zhì)組的凝膠分離技術(shù)

雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)是分離蛋白質(zhì)最常用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。其原理是第一向中根據(jù)蛋白質(zhì)在特定PH環(huán)境的等電點(diǎn)不同利用等電聚焦分離，在第二向中則按照其分子量不同利用SDS-PAGE分離，將骨骼肌復(fù)雜混合物中的單個(gè)蛋白質(zhì)在二維平面上分開(kāi)。雙向差異凝膠電泳技術(shù)(2D-DIGE)是一種熒光標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。2D-DIGE是唯一使用內(nèi)參標(biāo)志物，并支持在一張凝膠中分離多個(gè)樣品且單個(gè)成像的蛋白電泳分離技術(shù)。該技術(shù)基于蛋白質(zhì)賴氨酸殘基中加入不同熒光的氰化物染料用來(lái)標(biāo)記不同蛋白質(zhì)組學(xué)樣品，隨后利用2-DE技術(shù)進(jìn)行同位素分離保證了樣品所有蛋白質(zhì)位置的共同移動(dòng)，從而減少凝膠或凝膠變異產(chǎn)生的潛在錯(cuò)象。2D-DIGE分離后用胰蛋白酶對(duì)存在于凝膠中條帶或斑點(diǎn)酶切以及質(zhì)譜分析，可鑒定大約3500個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，這為深入研究蛋白質(zhì)組學(xué)提供了更多機(jī)會(huì)。在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(HIT)誘導(dǎo)骨骼肌適應(yīng)性的2D-DIGE蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，鑒定出的800個(gè)檢測(cè)點(diǎn)和匹配點(diǎn)中，HIT組與久坐組相比有13個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生變化。

1.2 蛋白質(zhì)組的非凝膠分離技術(shù)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，突破凝膠電泳中等電點(diǎn)和分子量限制的非凝膠蛋白分離技術(shù)，能夠在更廣泛的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)覆蓋蛋白質(zhì)組。具有正交分離能力的多維液相色譜法(MDLC)被廣泛使用。最典型的是復(fù)合肽混合物通過(guò)二維液相色譜(2D-LC)結(jié)合強(qiáng)陽(yáng)離子交換和反相，允許肽借助電荷和疏水性完成分離。將高效液相色譜柱用自動(dòng)串聯(lián)質(zhì)譜儀鑒定，可有效減少樣品損失量分析出低豐度蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)組分離成功率。Sollanek等人在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)膈肌表型變化的研究中，使用非標(biāo)記液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)膈肌中分離的可溶性蛋白質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)分析顯示，膈肌膜蛋白質(zhì)總數(shù)分別是813和732。耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著改變可溶性膜蛋白組中70種蛋白和線粒體蛋白組中25種蛋白質(zhì)的豐富度。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)的凝膠液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)

為了進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)組的分離效率，將凝膠和液相色譜結(jié)合使用的凝膠液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的多維分離鑒定。其操作流程一般是通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)，切取凝膠中蛋白條帶或斑點(diǎn)，首先進(jìn)蛋白酶酶切，最后借助液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS )鑒定蛋白質(zhì) 。同位素的相對(duì)與絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技術(shù)通過(guò)2-DE凝膠差異蛋白分析結(jié)合1-DE凝膠泳道中胰蛋白酶肽的定量分析，對(duì)骨骼肌中多達(dá)4或8個(gè)樣品多重分析，實(shí)現(xiàn)差異蛋白評(píng)估。iTRAQ標(biāo)記是在肽水平上完成的，蛋白質(zhì)定量則基于離子強(qiáng)度或MS / MS分析后鑒定蛋白質(zhì)的光譜計(jì)數(shù)。Holloway 等人采用iTRAQ技術(shù)在股外側(cè)肌運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)前后的活檢研究中發(fā)現(xiàn)，2-DE解析了256個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，配對(duì)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了20個(gè)表達(dá)差異。盡管使用高分辨率質(zhì)量分析的混合質(zhì)譜儀對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了改進(jìn)，但其高昂的成本費(fèi)用，標(biāo)記效率的可變性以及低豐度肽的低分辨率等不同程度局限該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌蛋白質(zhì)組可塑性的表征中獲得的大部分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)自2-DE研究。

1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主旨是通過(guò)對(duì)差異表達(dá)蛋白的分離鑒定，描繪出骨骼肌在特定條件刺激下的調(diào)節(jié)分子通路。蛋白質(zhì)組學(xué)信息學(xué)通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的收集和加工，構(gòu)建雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)能夠優(yōu)化蛋白鑒定；并且輔助分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，構(gòu)建出機(jī)體蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。BINGO和ClueGO等生物信息學(xué)工具描繪了鑒定出的蛋白質(zhì)潛在功能和機(jī)體生理變化的動(dòng)態(tài)相關(guān)性，有助于闡明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)骨骼肌重塑反應(yīng)的分子學(xué)機(jī)制。

2. 運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)組學(xué)的影響

運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑起到了良好的促進(jìn)作用，運(yùn)動(dòng)作為獨(dú)立的外界環(huán)境應(yīng)激因素能夠引起骨骼肌產(chǎn)生不同程度的收縮反應(yīng)。骨骼肌對(duì)收縮刺激具有顯著的可塑性，蛋白質(zhì)組學(xué)隨之發(fā)生變化。從蛋白質(zhì)組水平研究骨骼肌在運(yùn)動(dòng)適應(yīng)中的變化，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠從動(dòng)態(tài)、整體的視角更好的揭示了骨骼肌在運(yùn)動(dòng)反應(yīng)和適應(yīng)過(guò)程中蛋白質(zhì)組的變化特征。這可能發(fā)現(xiàn)新的骨骼肌損傷標(biāo)記物，對(duì)預(yù)防骨骼肌損傷具有重要意義。

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的影響

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑的促進(jìn)作用，主要體現(xiàn)在對(duì)線粒體能量代謝和細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)蛋白豐度的提高。尹苗苗等人在有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌蛋白表達(dá)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出6種與線粒體能量代謝、細(xì)胞膜修復(fù)和糖代謝相關(guān)的差異性蛋白表達(dá)均成倍上調(diào)，這提示有氧運(yùn)動(dòng)與骨骼肌重塑密切相關(guān)。Kurt等人研究運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)膈肌表型變化的結(jié)果顯示，耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后幾種關(guān)鍵蛋白的豐度相對(duì)增加，包括線粒體蛋白18(MTP18)、3-巰基丙酮酸硫酸轉(zhuǎn)移酶(3MPST)、微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶3(Mgst3)和熱休克蛋白70kDa蛋白1A / 1B(HSP70)。這些蛋白在幾種細(xì)胞類型中具有細(xì)胞保護(hù)作用，盡管在膈肌纖維中的細(xì)胞保護(hù)作用尚未完全被闡明，但是暗示了耐力運(yùn)動(dòng)預(yù)防非活動(dòng)性肌肉萎縮的功能。Simona等人在研究低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)恢復(fù)mdx小鼠受損骨骼肌的研究中發(fā)現(xiàn)，與久坐mdx小鼠相比，進(jìn)行鍛煉的mdx小鼠股四頭肌中有四個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)顯著改變。經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定為三種碳酸酐酶3(CA3)同系物和超氧化物歧化酶(SODC)。在鍛煉的mdx小鼠股四頭肌中，CA3亞型的蛋白水平明顯上調(diào)，并完全恢復(fù)到野生型(WT)小鼠的值。而SODC的蛋白水平顯著下調(diào)，并恢復(fù)到WT小鼠的值。根據(jù)本研究中發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)，低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)似乎可以通過(guò)對(duì)抗氧化應(yīng)激來(lái)減少mdx肌肉中的細(xì)胞退化過(guò)程。另有研究表明，骨骼肌對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的主要反應(yīng)是線粒體電子傳遞鏈，三羧酸循環(huán)和線粒體呼吸鏈復(fù)合物I裝配的蛋白質(zhì)更豐富。而肥胖/2型糖尿病(T2DM)個(gè)體中這三類蛋白質(zhì)豐度較低，并且耐力訓(xùn)練的個(gè)體骨骼肌更豐富。這提示運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體防御肥胖和葡萄糖不耐受和T2DM的有害作用主要機(jī)制之一發(fā)生在電子傳遞鏈的復(fù)合物I上。

2.2 無(wú)氧運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的影響

無(wú)氧運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌差異蛋白的數(shù)量相對(duì)較少。Kym等人，應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究個(gè)體腓腸肌蛋白的水平是否受短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，腓腸肌蛋白質(zhì)水平一般不受短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的急劇影響，雙向凝膠電泳選擇的61個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)中僅有4中顯著變化。使用液相色譜電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定這些變化的蛋白質(zhì)為肌酸激酶，肌鈣蛋白，熱休克20kDa蛋白和腺苷酸激酶1的組合。這也表明，大多數(shù)個(gè)體骨骼肌蛋白質(zhì)水平不會(huì)立即改變，以相應(yīng)短時(shí)間的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，也提示定量蛋白組學(xué)對(duì)于檢測(cè)骨骼肌蛋白水平的劇烈變化非常敏感。同樣地，Yamaguchi等人研究大鼠進(jìn)行游泳高強(qiáng)度間歇后骨骼肌適應(yīng)性變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，在800個(gè)檢測(cè)點(diǎn)和匹配點(diǎn)中，與對(duì)照組大鼠相比，高強(qiáng)度間歇游泳后大鼠只有13個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出變化。此外，利用western免疫印跡分析，高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)對(duì)呼吸鏈電子傳遞相關(guān)蛋白(NDUFS1)和小清蛋白(parvalbumin ，PV)的表達(dá)進(jìn)行了顯著改變。

3. 總結(jié)

綜上所述，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠誘導(dǎo)骨骼肌蛋白質(zhì)組產(chǎn)生適應(yīng)性變化。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)除了檢測(cè)差異蛋白質(zhì)外，更加深入的探討運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌蛋白質(zhì)組和疾病之間的交流受到越來(lái)越多的關(guān)注。