補(bǔ)益宗氣方對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠血清前白蛋白及TNF-α水平影響的實(shí)驗(yàn)研究*

★ 宋文龍 陳章生 陳豫生 龔莉 蘭智慧**

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)碩士研究生 南昌 330004；3.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院 南昌 330003)

慢性阻塞性肺疾病( COPD) 不僅是一種氣道和肺部的疾病，也是由多種危險(xiǎn)因素共同參與、多種生物機(jī)制同時(shí)介導(dǎo)的全身多系統(tǒng)性慢性炎癥反應(yīng)性疾病C0PD病變主要損害患者肺部，患者臨床主要表現(xiàn)為慢性的咳嗽，以清晨明顯，有少許黏液性痰及呼吸困難等，同時(shí)也會(huì)引起患者產(chǎn)生全身效應(yīng)，其中合并營養(yǎng)不良較為常見[1]。近年來，有研究表明腫瘤壞死因子、血清前白蛋白與COPD發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切[2-9]。COPD屬中醫(yī)學(xué)“咳嗽”“肺脹”“喘證”等范疇，國醫(yī)大師洪廣祥教授認(rèn)為其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，其中宗氣虛弱為本，痰瘀實(shí)邪為標(biāo)，在臨床應(yīng)用補(bǔ)益宗氣方積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)研究擬通過觀察補(bǔ)益宗氣方對(duì)COPD大鼠氣道結(jié)構(gòu)，體重、血清前白蛋白(Prealbumin)及腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響，探討補(bǔ)益宗氣方改善COPD大鼠營養(yǎng)狀態(tài)的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康純系雄性SD大鼠30只(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào):NO.43004700009069)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 中藥飲片由附屬醫(yī)院小包裝藥房提供；補(bǔ)益宗氣方組成及劑量：西黨參30g、生黃芪30g、炒白術(shù)15g、當(dāng)歸10g、升麻10g、北柴胡10g、鎖陽15g、山萸肉15g、陳皮10g、炙甘草10g。

上述飲片拆封后按趙瑞華[10]文獻(xiàn)內(nèi)所述方法，用冷水浸泡0.5h后用煎藥砂鍋進(jìn)行煎煮，共兩遍，后將所得水劑密封后低溫保存，按需取用。灌胃前室溫下放置1h。

1.2.2 主要試劑 血清前白蛋白及TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒：湖北武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司提供，規(guī)格及批號(hào)：96TL141212626、96T L141122631。脂多糖(LPS)固體 每支含10mg，美國Sigma公司生產(chǎn)，貨號(hào)：Sigma-L2880。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 每10只大鼠為一個(gè)單元飼養(yǎng)，隨機(jī)分為空白組、模型組、觀察組。采用氣管內(nèi)注射脂多糖溶液加香煙煙霧煙熏及冷風(fēng)刺激方法[11]：COPD模型組及觀察組第1、14d在氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)溶液后，2～13d及15～28d則持續(xù)熏煙30min，香煙量約20支/d，香煙煙霧熏煙后，立刻移至室外冷風(fēng)刺激1h(室內(nèi)外溫差約5℃)。29～42d，觀察組則給予補(bǔ)益宗氣湯灌胃進(jìn)行干預(yù)，第43d，將各組大鼠稱重，在乙醚麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈抽血[12]致死,并立即取右肺下葉組織，經(jīng)10%甲醛固定。

1.4 肺組織病理切片的制備 取出固定好的肺組織，常規(guī)石蠟包埋，4μm 切片。切片用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗；蘇木素染色后自來水沖洗；鹽酸乙醇分化；自來水浸泡15 min；置伊紅液2 min；常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測腫瘤壞死因子及血清前白蛋白水平 使用離心機(jī)提取血清并用相關(guān)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)盒測定腫瘤壞死因子、血清前白蛋白水平。將酶標(biāo)板除第1孔(對(duì)照孔)外的空白微孔按順序，分別加入100μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入100μL的血清；將100μL pH為7.0～7.2的PBS 液加入到空白對(duì)照孔。將50μL的酶標(biāo)記溶液加入到除對(duì)照孔外各孔中后。 將微孔板輕輕搖動(dòng)后密封，放置37℃孵育箱中，1h后，將微孔板取出,去掉反應(yīng)物，使用洗滌液清洗酶標(biāo)板，將顯色劑A 50μL、B 50μL次序加入各孔中后，在37℃下，避光反應(yīng)，15min后，將終止液50μL，加入各孔中。最后使用450nm光，測定各孔的吸光度OD值后，輸入橫、縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為標(biāo)注品的6個(gè)濃度值，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，畫出曲線，應(yīng)用軟件分析得出計(jì)算的公式，將血清樣本所測得的OD值，使用分析得出公式算出各血清樣本中各相關(guān)指標(biāo)濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的表現(xiàn) 在造模期間，觀察組和模型組大鼠均出現(xiàn)煩躁不安，并且先后出現(xiàn)咳嗽、氣促、少動(dòng)，遲緩，蜷縮一團(tuán)、精神萎靡，飲食減少、毛發(fā)枯槁，體重增長緩慢，個(gè)別大鼠體重減輕，從造模開始后第6d起有大鼠出現(xiàn)噴嚏、流涕，此后陸續(xù)有大鼠出現(xiàn)噴嚏及呼吸加快癥狀，模型組有一部分大鼠持續(xù)至第43d，觀察組通過服用中藥癥狀逐漸減輕，至第43d處死時(shí)基本恢復(fù)；空白組表現(xiàn)正常。

2.2 對(duì)模型組大鼠肺組織病理的初步觀察 對(duì)大鼠進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺體積明顯增大，外觀蒼白、粗糙不平。固定切片后在光鏡下可以觀察到支氣管纖毛柱狀上皮增厚，氣管黏膜下腺體增生肥大，杯狀細(xì)胞增生明顯，淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜下及外膜膠原纖維增生，支氣管平滑肌明顯增厚，終末細(xì)支氣管炎癥浸潤明顯，同時(shí)肺泡、肺泡囊擴(kuò)大以及排列結(jié)構(gòu)紊亂。

2.3 光鏡下對(duì)大鼠肺組織切片的病理形態(tài)觀察 在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察三組大鼠的支氣管肺組織病理改變，以下分別為HE染色圖片、馬松染色圖片(見圖1、圖2)。

空白組上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，小氣道及肺泡未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組上皮細(xì)胞壞死，脫落，可見巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，小氣道可見彈力纖維、膠原纖維，肺泡壁變薄，甚至斷裂；觀察組上皮細(xì)胞壞死較模型組減輕，炎性浸潤亦減輕，仍可見少許彈力纖維。

空白組小氣道周圍僅少量藍(lán)色膠原纖維沉積；模型組小氣道周圍大量藍(lán)色膠原纖維沉積，氣道壁增厚；觀察組小氣道周圍藍(lán)色膠原纖維較模型組減少。

圖1 三組大鼠支氣管肺組織HE染色所顯示的病理改變(×200)

圖2 三組大鼠支氣管肺組織Masson染色顯示的病理改變(×400)

光鏡下觀察肺組織切片發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織細(xì)支氣管纖毛上皮結(jié)構(gòu)不完整，部分缺失，杯狀上皮細(xì)胞增生明顯，氣管粘膜下層可見大量炎性細(xì)胞浸潤(主要為淋巴細(xì)胞)，觀察組氣道及肺組織炎癥浸潤程度較模型組輕，而空白組肺組織中未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，提示COPD大鼠模型建立成功。

2.4 大鼠的體重 造模前三組大鼠體重?zé)o明顯差異，造模后模型組及觀察組大鼠間體重增長無明顯差異，但顯著低于空白組，而以補(bǔ)益宗氣方對(duì)觀察組進(jìn)行干預(yù)后，該組大鼠體重增長值顯著高于模型組，低于空白對(duì)照組。各組大鼠體重增長，情況見表1。

表1 三組大鼠體重

注：與空白組比較，*P<0. 05；與模型組比較，#P<0. 05；與治療前比較，△P<0. 05 。

2.5 血清前白蛋白的比較 造模后模型組及觀察組大鼠血清前白蛋白水平顯著低于空白組，模型組及觀察組間血清前白蛋白水平差異則無顯著性，而以補(bǔ)益宗氣方對(duì)觀察組進(jìn)行干預(yù)后，其血清前白蛋白水平顯著高于模型組，仍低于空白組，具體見表2。

組別治療前前白蛋白(ug/mL)治療后前白蛋白(ug/mL)空白組234．82±7．87237．7±6．58模型組 98．94±5．41? 101．60±4．27?觀察組 99．05±5．68? 182．78±7．34?#△

注：與空白組比較，*P<0. 05；與模型組比較，#P<0. 05；與治療前比較，△P<0. 05。

2.6 血清腫瘤壞死因子的比較 造模后模型組及觀察組大鼠血清TNF-α水平顯著高于空白組，模型組及觀察組間血清TNF-α水平差異則無顯著性，以補(bǔ)益宗氣方對(duì)觀察組進(jìn)行干預(yù)后，其血清TNF-α水平顯著低于治療前，治療后的模型組大鼠，仍高于空白組，具體見表3。

組別治療前TNF-α(ng/L)治療后TNF-α(ng/L)空白組131．05±6．59133．17±5．69模型組 199．41±70．32? 208．73±91．0?觀察組 181．05±6．59? 150．92±14．35?#△

注：與空白組比較，*P<0. 05；與模型組比較，#P<0. 05；與治療前比較，△P<0. 05。

3 討論

COPD屬中醫(yī)學(xué)“喘證”“咳嗽”“肺脹”范疇，主要表現(xiàn)為長期反復(fù)的咳嗽、咳痰，逐漸出現(xiàn)喘促、胸膺膨滿、憋悶如塞，重者可有唇甲青紫，心悸，肢腫等癥，發(fā)展成肺心病。目前，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜是慢性阻塞性肺疾病證候的基本特點(diǎn)。國醫(yī)大師洪廣祥教授根據(jù)臨床上COPD合并營養(yǎng)不良患者存在咳嗽喘促，少氣不足以息，語言低微，身倦乏力等特征，認(rèn)為慢阻肺病人普遍存在營養(yǎng)障礙的情況，是緣于宗氣虛衰，元?dú)獠荒艿玫匠漯B(yǎng)，肺脾氣弱，不能正常運(yùn)化水谷精微，輸布障礙，供給不足，臟腑及肌膚失養(yǎng)，故肺氣脹滿，又呼吸過度，耗氣傷津過甚，形體逐漸消瘦，日趨羸弱[13]?！鹅`樞》曰:“大氣入于臟腑者,不病而卒死矣”。說明了宗氣虛衰，導(dǎo)致患者死亡的病理過程。

目前對(duì)肺脹的治療，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為急則治其標(biāo)，緩則治其本。洪教授則指出慢阻肺在急性發(fā)作期與穩(wěn)定期均可出現(xiàn)虛中夾實(shí)，提出宗氣虛弱是慢性阻塞性肺疾病發(fā)生發(fā)展的重要內(nèi)因，在疾病全程皆可治以補(bǔ)益宗氣[14-18]。

COPD 患者最顯著的特征就是體質(zhì)量下降、血液營養(yǎng)指標(biāo)下降及免疫力下降加重感染。目前認(rèn)為機(jī)體的過度能量消耗、高代謝以及患者本身攝入不足是COPD 合并營養(yǎng)不良的主要原因，有研究表明腫瘤壞死因子等炎癥因子引起的代謝紊亂可能是患者營養(yǎng)狀況下降的重要原因[19]。本實(shí)驗(yàn)以上述幾種指標(biāo)為切入點(diǎn)，通過觀察COPD模型大鼠肺部組織形態(tài)的變化以及對(duì)血清前白蛋白、腫瘤壞死因子的定量檢測，觀察補(bǔ)益宗氣湯對(duì)COPD模型大鼠體內(nèi)血清前白蛋白、腫瘤壞死因子含量水平及體重的影響。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，證明補(bǔ)益宗氣湯可以有效的降低腫瘤壞死因子含量，增加血清前白蛋白含量，以達(dá)到改善COPD大鼠營養(yǎng)狀態(tài)的作用。

3.1 體重變化 在試驗(yàn)中，造模前三組大鼠間體重?zé)o明顯差異。造模后模型組、大鼠體重較空白組增長更慢，體重較空白組輕。經(jīng)補(bǔ)益宗氣方干預(yù)后觀察組高于治療前及治療后的模型組，仍低于空白組，由此，我們發(fā)現(xiàn)，通過補(bǔ)益宗氣方可促進(jìn)大鼠攝食，有效增加COPD大鼠體重,從而改善COPD大鼠營養(yǎng)狀況。

3.2 血清前白蛋白 血清前白蛋白(prealbumin，PA)是存在于血漿中的一種急性相反應(yīng)蛋白，主要存在于血液和腦脊液中，其水平與蛋白質(zhì)的代謝有關(guān)，可靈敏反映機(jī)體的營養(yǎng)狀態(tài)及肝臟合成功能，與機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

造模后，模型組大鼠前白蛋白含量較空白組顯著降低；觀察組治療后大鼠血清前白蛋白較治療前顯著升高，較模型組治療后升高明顯。說明通過補(bǔ)益宗氣方，可提升COPD大鼠血清前白蛋白水平，營養(yǎng)狀態(tài)得到相應(yīng)改善。

3.3 腫瘤壞死因子 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，能誘導(dǎo)腫瘤組織出血壞死的物質(zhì)，除抗腫瘤作用外，還參與炎癥、發(fā)熱以及機(jī)體脂肪、蛋白質(zhì)的分解代謝等病理生理過程[20]。通過抑制脂肪細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝入，降低脂生成關(guān)鍵酶如乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的表達(dá)，促進(jìn)脂肪分解，抑制脂肪細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞及前脂肪細(xì)胞凋亡，參與了眾多慢性消耗性疾病惡病質(zhì)的發(fā)生。Schols等[21]研究認(rèn)為TNF-α與COPD的高代謝有關(guān)，TNF-α可能通過增加能量消耗導(dǎo)致COPD患者的營養(yǎng)不良。本研究結(jié)果也證實(shí)該觀點(diǎn)，且大鼠血清TNF-α水平與前白蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，提示TNF-α生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮對(duì)血清前白蛋白有影響。

本研究結(jié)果顯示，造模后，COPD模型及觀察組大鼠血清TNF-α濃度明顯高于對(duì)照組，且血清TNF-α濃度與體質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān)；觀察組治療后大鼠血清TNF-α較治療前顯著降低，較模型組治療后降低。結(jié)合治療前后各組大鼠血清前白蛋白水平的變化，提示TNF-α參與了COPD營養(yǎng)不良的發(fā)生，證實(shí)通過補(bǔ)益宗氣方，可降低COPD大鼠血清TNF-α水平， 抑制炎癥反應(yīng)，改善COPD大鼠營養(yǎng)狀態(tài)。其中，模型組中有個(gè)別大鼠治療前后TNF-α水平遠(yuǎn)高于該組平均值，考慮可能為造模刺激后誘發(fā)腫瘤導(dǎo)致。

綜上所述，營養(yǎng)不良是COPD 的常見肺外表現(xiàn)，也是COPD 預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可加重COPD 疾病的進(jìn)展，本研究提示：補(bǔ)益宗氣方能改善COPD營養(yǎng)不良大鼠的營養(yǎng)狀況，其作用機(jī)制在于能降低大鼠血清腫瘤壞死因子水平，提高血清前白蛋白水平。結(jié)合目前國內(nèi)外對(duì)COPD合并營養(yǎng)不良傾向于在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上配合營養(yǎng)支持及適當(dāng)鍛煉的觀點(diǎn)，我們認(rèn)為，在臨床治療中，對(duì)COPD 患者進(jìn)行營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)篩查及營養(yǎng)評(píng)價(jià)，制訂不同的長期分級(jí)營養(yǎng)支持治療方案，合理、均衡地搭配腸內(nèi)和(或)腸外營養(yǎng)，并輔以具有代謝支持作用的物質(zhì)，結(jié)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，配合辨證服用補(bǔ)益宗氣湯，可改善臨床預(yù)后。我們將在下一步工作中繼續(xù)深入研究，為補(bǔ)益宗氣方的臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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