矮紫堇化學(xué)成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析*

★ 魏春華曾金祥 史亞夫 羅光明 高燕萍 鐘國(guó)躍 朱繼孝*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心 南昌 330004； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004)

矮紫堇(CorydalishendersoniiHemsl)也稱尼泊爾黃堇，藏藥名桑格絲哇，是罌粟科紫堇屬植物矮紫堇和扁柄黃堇的干燥全草，作為傳統(tǒng)藏藥“日棍”，具有活血散瘀、利氣止痛功效，藏醫(yī)用于治療胃潰瘍、胃炎、跌打損傷、坐骨神經(jīng)痛、疥癖瘡毒、毒蛇咬傷、刀傷等[1]。紫堇屬植物含有多種生物堿成分，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗心律失常、保肝等活性，并且對(duì)心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌等有藥理作用[2]。在藏區(qū)廣泛地應(yīng)用于臨床。本課題組前期研究采用經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛抗炎動(dòng)物模型，綜合評(píng)價(jià)了矮紫堇在解熱鎮(zhèn)痛抗炎方面的藥理活性及作用機(jī)制，但矮紫堇化學(xué)成分方面的報(bào)道較少，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究仍然欠缺。近年來(lái)隨著分析技術(shù)的發(fā)展，UHPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)由于其分離速度快、靈敏度高、測(cè)定準(zhǔn)確性強(qiáng)而被廣泛運(yùn)用于中藥及復(fù)方的分析中[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用 UHPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對(duì)矮紫堇進(jìn)行了分析研究，定性鑒定出10個(gè)生物堿類(lèi)成分、2個(gè)黃酮類(lèi)成分，為矮紫堇的質(zhì)量控制與研究應(yīng)用提供了可靠的方法，為藏藥進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-30A超高效液相色譜儀，PDA紫外檢測(cè)器；Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀，配備 ESI 離子源及 Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件、PeakView數(shù)據(jù)處理軟件(A美國(guó)B SCIEX 公司)；KQ-5200DB 型超聲清洗機(jī)(昆山市超聲波儀器公司)；AL204 型電子分析天平(Mettler Toledo 儀器(上海)有限公司)； Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)(德國(guó)默克密理博公司)。

1.2 試藥 原阿片堿對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：MUST-16012408)、槲皮素對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：MUST-16031804)均購(gòu)自成都曼思特生物科技公司；甲醇(HPLC 級(jí)，美國(guó)天地有限公司)；甲酸(HPLC 級(jí)，山西西亞化工有限公司)；水為Milli-Q 系統(tǒng)純化水(美國(guó)Millipore 公司)。矮紫堇購(gòu)自成都荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心鐘國(guó)躍研究員鑒定為罌粟科植物矮紫堇(C.hendersoniiHemsl)的干燥全草。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 矮紫堇粉碎，稱取約2.0 g置于50 mL錐形瓶，加入25 mL 75% 甲醇超聲提取45min，抽濾、旋干、定容至5mL容量瓶中，取定容后藥液過(guò)0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾，供UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別精密稱取2mg對(duì)照品(原阿片堿、槲皮素)于5 mL容量瓶中，用75%甲醇溶解稀釋至刻度，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待分析。

2.3 LC-MS 條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：YMC-ULtraHT Pro C18色譜柱(100 mm×3 mm，2μm)；流動(dòng)相：0.5%甲酸水溶液(A)，甲醇(B)，梯度洗脫：0～5min，10% ～ 18% B；5～35 min，18% ～50% B；35～55 min，50～ 95% B；55～57min，95%～10% B；57～62min，10%～10% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：32℃；進(jìn)樣量：4μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源(ESI)，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍 m/z 100～1000；噴霧電壓：-4500 V，霧化氣溫度：500 ℃，氣簾氣：140.745kPa，輔助氣：344.74 kPa；去簇電壓(DP)：100V；采用TOF-MS-IDA-MS/MS 方法采集數(shù)據(jù)，TOF/MS 一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描TOF/MS/MS 離子累積時(shí)間分別為200、100 ms，CE 碰撞能量為40eV，CES碰撞能量疊加為(40±10)eV。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用AB Sciex公司 Peak View 1.6軟件，對(duì)UHPLC-Q-TOF-MS/MS采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1 矮紫堇化學(xué)成分分析 采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 對(duì)75%甲醇提取矮紫堇藥材成分進(jìn)行定性分析，(+) ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)(圖1)。(-) ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)(圖2)。應(yīng)用Peak View 1.6軟件分析75% 甲醇提取無(wú)尾果中各化學(xué)成分的保留時(shí)間及其質(zhì)譜信息，并結(jié)合分子離子峰與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行推斷，初步推斷出矮紫堇提取物中生物堿類(lèi)化合物10個(gè)，黃酮類(lèi)成分2個(gè)。

圖1 矮紫堇提取物在正離子模式下總離子流圖

圖2 矮紫堇提取物在負(fù)離子模式下總離子流圖

3.2 化合物的質(zhì)譜裂解特征 化合物1 tR為10.99min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z356.1856[M+H]+，其分子式為C21H25NO4，分子離子發(fā)生RDA裂解與B環(huán)開(kāi)裂得到碎片離子m/z191.0854、165.0709，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為四氫巴馬汀[5]。

化合物2 tR為11.20min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z342.1699[M+H]+，其分子式為C20H23NO4，分子離子發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z178.0849、165.0717，B環(huán)開(kāi)裂得到碎片離子m/z192.1017、151.0601，分子離子分別失去CH4、CH3OH得到碎片離子m/z326.1393、310.1436，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為四氫非洲防己堿[5]。

化合物3 tR為11.39min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z328.1543[M+H]+，其分子式為C19H21NO4，分子離子發(fā)生RDA裂解與B環(huán)開(kāi)裂得到碎片離子m/z178.0863、151.0760，分子離子失去CH3OH得到碎片離子m/z296.1292，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為金黃紫堇堿[5]。

化合物4 tR為12.55min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z340.1542[M+H]+，其分子式為C20H21NO4，分子離子發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z177.0612、165.0817，B環(huán)開(kāi)裂得到碎片離子m/z192.1015、148.0763，分子離子失去CH2O得到碎片離子m/z309.1119，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為四氫小檗堿[5]。

表1 矮紫堇提取物的化學(xué)成分鑒定結(jié)果

化合物 5 tR為12.60min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z370.1649[M+H]+，其分子式為C21H23NO5，分子離子發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z205.0648、163.0744，α裂解得到碎片離子m/z190.0861、181.0865，分子離子失去CH4及H2O得到碎片離子m/z337.1310，碎片離子m/z205.0648分別失去OH和H2O得到碎片離子m/z190.0861、188.0704，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為別隱品堿[5]。

化合物6 tR為13.81min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z354.1334[M+H]+，其分子式為C20H19NO5，分子離子發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z206.0816、149.0600，α裂解得到碎片離子m/z189.0767、165.0558，碎片離子m/z206.0816分別失去OH和H2O得到碎片離子m/z189.0767、188.0703，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為原阿片堿[6]。

化合物7 tR為17.04min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z321.0987[M+H]+，其分子式為C19H14NO4，分子離子失去2個(gè)氫而形成穩(wěn)定的大π共軛系統(tǒng)得到碎片離子m/z319.0800，分子離子失去CO和2個(gè)氫得到碎片離子m/z291.0847，碎片離子m/z291.0847失去CO得到碎片離子m/z263.0894，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為黃連堿[5]。

化合物8 tR為17.90min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z337.1268[M+H]+，其分子式為C20H18NO4，分子離子失去CH3得到碎片離子m/z322.1031，分子離子失去CO和2個(gè)氫得到碎片離子m/z307.0781，碎片離子m/z307.0781失去CO得到碎片離子m/z278.0763，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為小檗堿[5]。

化合物9 tR為18.12min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z334.1077[M+H]+，其分子式為C20H15NO4，分子離子失去CH3得到碎片離子m/z318.0762，分子離子失去1個(gè)氫得到碎片離子m/z332.0923，碎片離子m/z332.0923失去CO得到碎片離子m/z304.0974，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為二氫血根堿[5]。

化合物10 tR為33.78min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.0361[M-H]+，其分子式為C15H10O7，分子離子峰m/z301.0361分別失去CO、C7H6O2得到碎片離子m/z273.0427、178.9833，碎片離子m/z178.9833失去CO得到碎片離子m/z151.0057，推測(cè)此化合物為槲皮素，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[7]。

化合物11 tR為38.73min，負(fù)離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.0361[M-H]+，其分子式為C15H10O6，分子離子峰失去CO得到碎片離子m/z257.0466，碎片離子m/z257.0466失去CO得到碎片離子m/z229.0509。碎片離子m/z285.0421發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z151.0052、133.0291，推測(cè)此化合物為木犀草素，裂解規(guī)律與文獻(xiàn)一致[8]。

化合物12 tR為50.39min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰為m/z390.1338[M+H]+，其分子式為C23H19NO5，分子離子失去8位的丙酮基形成相對(duì)較穩(wěn)定的苯并菲啶類(lèi)生物堿,得到碎片離子m/z332.0914，碎片離子m/z332.0914分別失去CH3和CO得到碎片離子m/z317.0676,304.0963，碎片離子m/z304.0963失去CO和2個(gè)氫得到碎片離子m/z274.0862，與文獻(xiàn)裂解規(guī)律一致，推測(cè)此化合物為8-丙酮基二氫血根堿[5]。

圖3 金黃紫堇堿(A)、小檗堿(B)和槲皮素(C)的質(zhì)譜圖譜

4 討論

藏藥資源豐富，但基礎(chǔ)研究薄弱，很多單味藏藥品種多停留在品種整理、資源調(diào)查或生藥學(xué)鑒定階段，紫堇屬藏藥的情況亦是如此。UHPLC-Q-TOF/MS 聯(lián)用儀的優(yōu)勢(shì)在于: 一次進(jìn)樣，同時(shí)獲得高質(zhì)量的 TOF-MS和 TOF-MS/MS，通過(guò)精確相對(duì)分子質(zhì)量，進(jìn)行目標(biāo)化合物的篩查和確證[9]。本試驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)色譜分離、質(zhì)譜鑒定共鑒別矮紫堇復(fù)雜提取物中的10種生物堿類(lèi)成分，2個(gè)黃酮類(lèi)成分，并初步了解了其質(zhì)譜裂解規(guī)律。金黃紫堇堿、四氫非洲防己堿、四氫小檗堿、四氫巴馬汀等屬于四氫原小檗堿型生物堿，通過(guò)RDA裂解與B環(huán)開(kāi)裂進(jìn)行裂解；別隱品堿與原阿片堿屬于普羅托品類(lèi)生物堿，RDA裂解與α裂解反應(yīng)以及由母核失去1分子H2O形成[M+H-18]+的碎片峰是這類(lèi)生物堿顯著的質(zhì)譜裂解規(guī)律；8-丙酮基二氫血根堿與二氫血根堿屬于二氫苯并菲啶類(lèi)生物堿，這類(lèi)生物堿會(huì)先失去8位或者7位的取代基形成相對(duì)較穩(wěn)定的苯并菲啶類(lèi)生物堿。黃連堿與小檗堿屬于原小檗堿型生物堿，這類(lèi)生物堿母核一般不會(huì)發(fā)生裂解，僅有小分子取代基的裂解與丟失在母核上如果存在鄰二甲氧基，則此鄰二甲氧基會(huì)先失去 1 分子甲基后再失去 1 個(gè)氫從而形成亞甲二氧基，亞甲二氧基會(huì)繼續(xù)丟失1分子一氧化碳從而形成1個(gè)穩(wěn)定的三元氧環(huán)。

本實(shí)驗(yàn)中鑒別出的矮紫堇化學(xué)成分與本實(shí)驗(yàn)室前期文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10-11]，說(shuō)明應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同樣可快速、準(zhǔn)確鑒別中藥復(fù)雜成分。但同時(shí)可以看出，也有部分成分前期未見(jiàn)報(bào)道。如現(xiàn)代化學(xué)研究表明，異喹啉類(lèi)生物堿是紫堇屬植物其的要特征性成分[12]，但矮紫堇中暫未推斷出該類(lèi)成分。但從總離子流圖可以發(fā)現(xiàn)矮紫中還有大量成分結(jié)構(gòu)尚未解析。因此，不能據(jù)此推測(cè)矮紫堇中不存在異喹啉類(lèi)生物堿成分，仍需繼續(xù)進(jìn)行研究以進(jìn)一步闡明其它成分。

[1]舒花,馬學(xué)燕,李鑫,等. 矮紫堇總生物堿的含量測(cè)定及其抗炎活性研究[J].西北藥學(xué)雜志,2015,30(5):602-604.

[2]尚偉慶,陳月梅,高小力,等. 紫堇屬藏藥的化學(xué)與藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2014,13(7):1 190-1 198.

[3]許文,傅志勤,林婧,等. UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定三葉青中10種黃酮類(lèi)成分[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2014,49(12):1 711-1 717.

[4]宋建平,許虎,陳菲,等. 羅布麻葉黃酮類(lèi)成分的UPLC-Q-TOF-MS分析[J].中藥材,2014,37(7):1 199-1 204.

[5]卿志星,程辟,曾建國(guó). 博落回中生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律研究進(jìn)展[J].中草藥,2013,44(20):2 929-2 939.

[6]丁波. 延胡索物質(zhì)基礎(chǔ)及其主要活性單體體內(nèi)代謝的LC-DAD-MS/MS研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué),2007.

[7]李宇航,戴海學(xué),汪明明,等. 槲皮素的電噴霧離子阱質(zhì)譜分析[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2009,30(6):374-378.

[8]李軍茂,何明珍,歐陽(yáng)輝,等. 超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用快速鑒別木芙蓉葉的化學(xué)成分[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2016,51(14):1 162-1 168.

[9]蘇靖,戴榮繼. 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器,2014,12(Z1):38-42.

[10]高燕萍,吳強(qiáng),梁健,等.矮紫堇生物堿成分[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2016,22(17):67-70.

[11]高燕萍,吳強(qiáng),梁健,等.藏族藥矮紫堇化學(xué)成分分離鑒定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2016, 22(18): 60-63.

[12]劉璐,吳立軍,楊春娟. 紫堇屬植物中異喹啉類(lèi)生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的研究進(jìn)展[J].實(shí)用藥物與臨床, 2016, 19(3): 371-380.