MicroRNA和雪旺細胞自噬與周圍神經(jīng)再生修復(fù)的研究進展*

高 群， 寧昕杰， 王 輝

(中山大學附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科， 廣東 廣州 510630)

周圍神經(jīng)損傷會使神經(jīng)支配區(qū)域的運動、感覺機能下降和缺失，嚴重影響生產(chǎn)和生活質(zhì)量。現(xiàn)代顯微外科技術(shù)的應(yīng)用已大大提高了修復(fù)效果，但由于周圍神經(jīng)的特殊結(jié)構(gòu)和功能，目前的修復(fù)技術(shù)對于神經(jīng)功能的恢復(fù)效果仍然有限，這引起了研究者們對于周圍神經(jīng)損傷后再生修復(fù)機制的探索。周圍神經(jīng)損傷后，損傷處殘存雪旺細胞(Schwann cells)的數(shù)量和增殖分化能力是影響神經(jīng)再生修復(fù)的關(guān)鍵因素[1]。在周圍神經(jīng)損傷后的雪旺細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量溶酶體反應(yīng)陽性的產(chǎn)物，其成分是包裹損傷細胞器和多余蛋白質(zhì)的自噬體。而隨著分子生物學的不斷發(fā)展與進步，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNAs, miRNAs)在神經(jīng)再生修復(fù)過程中起著重要的調(diào)控作用，神經(jīng)損傷后，miRNAs參與調(diào)控神經(jīng)再生過程中雪旺細胞的增殖和分化活動[2]。而我們的近期研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)損傷早期雪旺細胞發(fā)生的自噬現(xiàn)象中，miRNAs也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此，本文將對雪旺細胞自噬以及miRNAs與神經(jīng)再生修復(fù)過程中的關(guān)系進行綜述。

1 自噬對周圍神經(jīng)再生修復(fù)的雙重作用

1.1自噬的簡介 自噬現(xiàn)象廣泛存在于真核細胞中，是指細胞利用雙層膜結(jié)構(gòu)包裹胞漿內(nèi)受損、衰老的細胞器或異常蛋白，通過溶酶體途徑降解、清理，釋放出游離小分子供細胞回收利用的動態(tài)循環(huán)過程[3]。在哺乳動物中，根據(jù)底物的特點、轉(zhuǎn)運類型及調(diào)控機制的不同，自噬可分為分子伴侶介導的自噬、微自噬和巨自噬。分子伴侶介導的自噬僅存在于哺乳動物細胞中，胞漿中分子伴侶(如Hsc70等)可以選擇性識別可溶性蛋白分子的特定氨基酸序列并與之結(jié)合，通過膜轉(zhuǎn)位進入溶酶體腔，分解為氨基酸等被細胞再利用；胞內(nèi)物質(zhì)(如長壽蛋白等)直接被溶酶體膜內(nèi)陷吞噬形成膜泡，并在溶酶體內(nèi)降解的過程為微自噬；巨自噬是胞漿中的可溶性蛋白質(zhì)和變性壞死的細胞器被非溶酶體來源的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬體，自噬體再與溶酶體結(jié)合，包裹物被溶酶體分解成可供細胞利用的氨基酸、核苷酸等小分子物質(zhì)的過程。巨自噬是哺乳動物中最常見和最重要的自噬方式，目前對自噬的研究主要集中在巨自噬，其分子機制也最為清楚[4]。自噬體的形成是細胞發(fā)生自噬的關(guān)鍵步驟，這一復(fù)雜過程主要涉及5個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：(1)自噬誘導：自噬誘導是自噬體形成的起始階段，它與自噬相關(guān)基因1(autophagy-related gene 1, Atg1)/ULK復(fù)合物形成有關(guān)；(2) 囊泡核化：主要是beclin-1與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)復(fù)合物的激活，該復(fù)合物在自噬體形成的起始階段起重要作用[4];(3)囊泡延伸：依賴2個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)Atg12-Atg5·Atg16 和Atg8/微管相關(guān)蛋白 1A、1B-輕鏈3(light chain 3, LC3)而發(fā)揮作用；泛素激活酶E1(Atg7)在2個復(fù)合物形成的過程中發(fā)揮重要作用[4-5];(4) 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運：嵌膜蛋白Atg9及其它相關(guān)蛋白協(xié)同轉(zhuǎn)運脂質(zhì)，同時募集其它嵌膜蛋白；(5)自噬體與溶酶體融合：自噬體及其內(nèi)容物被水解酶降解消化[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，除了饑餓、缺血、缺氧等能量相關(guān)因素發(fā)生改變外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、模式識別受體的激活、細胞因子的缺乏以及放、化療等都可成為自噬的誘因[6-7]。自噬具有兩面性，一般情況下自噬是一種廣泛存在的生理過程，有利于細胞應(yīng)對不良環(huán)境；某些情況下由于自噬的非特異性，又會對機體產(chǎn)生不利的影響[4]。機體感染鏈球菌后，通過自噬可以有效地吞噬降解細菌；而如布魯氏菌則依靠自噬的包裹實現(xiàn)自我復(fù)制，進而出現(xiàn)“波狀熱”。在腫瘤發(fā)生的早期，自噬可以阻礙腫瘤的進展，而在中晚期自噬協(xié)助腫瘤細胞應(yīng)對缺血、缺氧不利條件，有助于腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移?？傊允稍谏窠?jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、免疫以及凋亡過程中發(fā)揮重要作用，貫穿于細胞的生長發(fā)育和病理生理的全過程[7-8]。

1.2自噬通過調(diào)節(jié)雪旺細胞穩(wěn)態(tài)影響周圍神經(jīng)再生 周圍神經(jīng)損傷后, 損傷處以及損傷遠端由于缺乏神經(jīng)元胞體的營養(yǎng)供應(yīng)發(fā)生華勒變性[9]，表現(xiàn)為軸索中斷并壞死，髓鞘崩解消失。雪旺細胞作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成細胞，在損傷神經(jīng)再生修復(fù)中發(fā)揮著清除損傷處的髓鞘碎片形成 Bunger帶、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子以及引導軸突的再生等不可替代的作用[10-11]。自噬作為調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)的一種重要機制，能夠使雪旺細胞度過應(yīng)激期，為雪旺細胞的數(shù)量、增殖分化提供保障，從而成為影響神經(jīng)再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1.2.1自噬有利于雪旺細胞清除神經(jīng)損傷處髓鞘碎片 周圍神經(jīng)損傷后，再生修復(fù)的首要過程是清除髓鞘碎片，在損傷后的5～7 d，雪旺細胞的自噬作用可清除40%～50%的髓鞘碎片，接下來，巨噬細胞通過與抗體和補體結(jié)合介導的吞噬作用對髓鞘碎片進行清除。研究者通過觀察CCR2-/-小鼠(該類小鼠中巨噬細胞不再產(chǎn)生對吞噬作用有意義的聚集)，7 d之后的神經(jīng)損傷處髓鞘碎片被正常清除，從而進一步強調(diào)了雪旺細胞自噬對髓鞘碎片清理的重要性[12]。

在小鼠實驗中，通過敲除Atg7抑制雪旺細胞的自噬作用，或者利用藥物作用于溶酶體干擾自噬流，不僅會影響神經(jīng)纖維的崩解，還會減少巨噬細胞聚集，延緩了髓鞘碎片的清除以及神經(jīng)再生的進程。自噬過程正常的小鼠，其損傷后軸突再生及髓鞘化程度明顯好于自噬相關(guān)基因缺失或藥物抑制自噬的小鼠[13]。

1.2.2自噬有利于神經(jīng)損傷后雪旺細胞分化 自噬還有助于雪旺細胞的去分化過程，促使雪旺細胞向增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)變，抑制自噬的同時可能會抑制雪旺細胞的增殖遷移能力[14]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，雪旺細胞主要通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的激活和JNK/c-Jun通路的誘導實現(xiàn)脫分化；研究者利用JNK/c-Jun通路的激活劑神經(jīng)酰胺或氯化鋰處理受損神經(jīng)后，雪旺細胞自噬現(xiàn)象顯著增高；而通過饑餓以及雷帕霉素誘導哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路誘導神經(jīng)斷端雪旺細胞，發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象無明顯改變[12]。

也有研究表明，通過制造大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷的模型，腹腔連續(xù)注射一定量的雷帕霉素后，電鏡觀察神經(jīng)損傷處自噬體較對照組顯著增多；而注射3-甲基腺嘌呤后，自噬體數(shù)量明顯減少。這一研究結(jié)果表明自噬經(jīng)典通路mTOR通路同樣可以增強損傷處雪旺細胞的自噬，并且誘導自噬增強之后，大鼠運動功能恢復(fù)情況明顯好于對照組[15]。

1.2.3自噬可以促進雪旺細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors, NTFs) Chen等[16]研究表明小鼠坐骨神經(jīng)離斷后，在神經(jīng)斷端遠側(cè)端，ULK復(fù)合物、Atg7、Atg9等自噬體形成的基本組分明顯的增高，從而進一步證實神經(jīng)損傷后雪旺細胞內(nèi)有自噬的發(fā)生。在神經(jīng)損傷后，雪旺細胞分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子與細胞外蛋白，能夠促進神經(jīng)纖維的再生;而抑制自噬的發(fā)生會削弱雪旺細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，繼而影響后續(xù)神經(jīng)再生過程。

1.3自噬壓的升高不利于神經(jīng)再生修復(fù) 在正常的生理情況下，自噬體的形成與分解維持一個動態(tài)的平衡，而當自噬體形成過多或溶酶體降解過程受損時，自噬體的形成超過其分解量，從而導致自噬體的蓄積，這種自噬體的正向積累稱為自噬壓[17]。由于神經(jīng)細胞特殊的結(jié)構(gòu)特點，自噬體形成后要通過微管運輸?shù)饺苊阁w才能完成分解，諸多病理生理情形,例如短時間內(nèi)損傷胞器或異常蛋白質(zhì)大量積累、微管轉(zhuǎn)運受阻或自噬體與溶酶體結(jié)合受損、溶酶體水解酶異常等均可導致自噬體累積，使自噬壓升高。在阿爾茨海默病患者腦的神經(jīng)軸突中含有大量累積的自噬泡，提示自噬泡轉(zhuǎn)運的障礙以及與溶酶體結(jié)合的受阻，自噬泡的累積及降解障礙導致淀粉樣蛋白的蓄積，進而引起神經(jīng)退行性變[18]。神經(jīng)細胞對自噬壓升高的反應(yīng)非常敏感，細胞內(nèi)環(huán)境隨增高的自噬壓改變，正向增強自噬作用，致使神經(jīng)細胞凋亡崩解，從而對多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生影響，如帕金森病、阿爾茨海默病以及由于雪旺細胞過度自噬引起的周圍神經(jīng)疾病等[17]。

2 miRNAs對周圍神經(jīng)再生的調(diào)控作用

2.1miRNAs簡介 miRNAs是一類具有調(diào)控功能的單鏈非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，具有生物間高度保守性和基因簇集性的特點[19]，主要介導轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，對生物的生長、發(fā)育等過程發(fā)揮著重要作用。miRNAs通常位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)，在核內(nèi)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，初產(chǎn)物為pri-miRNA。Pri-miRNA在III類RNA酶Dorsha及其輔助因子作用下被處理成發(fā)夾狀pre-miRNA，隨后核酸酶Dicer將pre-miRNA剪切為22個核苷酸大小的雙鏈RNA產(chǎn)物，這個雙鏈RNA的引導鏈與Argonaute蛋白形成沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)，另一條隨從鏈自行降解[20]。目前在哺乳動物中大約有1 400種miRNA存在，參與大約60%蛋白編碼基因的調(diào)控[21]。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs主要通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)以完全或不完全互補結(jié)合的方式發(fā)揮作用，阻遏翻譯過程或裂解靶mRNA，抑制基因表達，實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄后表達的調(diào)控[2]。

2.2miRNAs參與周圍神經(jīng)再生修復(fù)的調(diào)控 miRNAs對于雪旺細胞的生長至關(guān)重要，miRNAs缺乏的雪旺細胞不能脫分化為未成熟狀態(tài)。研究者利用基因敲除技術(shù)，敲除小鼠雪旺細胞中miRNAs合成所必須的關(guān)鍵酶Dicer，觀察髓鞘再生過程，首次證實神經(jīng)再生過程中需要miRNAs的參與[22]。近年來，研究表明，miRNAs在受損神經(jīng)處的雪旺細胞中表達異常，引起多個基因的表達變化，從而調(diào)控雪旺細胞的分化、分泌等行為。有研究證實，大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，損傷處神經(jīng)組織中多種miRNAs表達特異性增高[23-24]。

2.2.1miRNAs的表達有利于雪旺細胞存活和遷移 已有的研究證明，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)通過使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)的去磷酸化，實現(xiàn)細胞生長的抑制和促進細胞凋亡，而高表達miR-21可以下調(diào)PTEN的表達，減少雪旺細胞的凋亡，從而有利于周圍神經(jīng)修復(fù)再生[25]。該研究表明在神經(jīng)受損后，雪旺細胞中的miRNAs對于雪旺細胞的再生具有重要的調(diào)控作用[2]。

在體外實驗中，提高miR-221/222的表達可以促進雪旺細胞的增殖和遷移，而沉默它們的表達則會抑制增殖和遷移，研究證實miR-221/222是通過與長壽保障基因2(longevity assurance homologue 2,LASS2)的3’端的UTR結(jié)合，抑制LASS2的表達，提高了雪旺細胞的增殖和遷移能力[26]。神經(jīng)損傷后，若抑制miR-9的表達，則會通過調(diào)控膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1(collagen triple helix repeat-containing protein 1, Cthrc1)靶基因，阻止Rac1 GTPase的激活，促進施萬細胞的遷移[27]。

周圍神經(jīng)損傷后，miR-21在雪旺細胞中高表達，并通過靶基因轉(zhuǎn)化生長因子β誘導蛋白介導G1/S-特異性細胞周期蛋白D1(cyclin D1, Ccnd1)的表達，進而調(diào)控雪旺細胞的增殖生長[28]，揭示了周圍神經(jīng)損傷后雪旺細胞增殖的新機制。

2.2.2miRNAs可以促進雪旺細胞的分化 周圍神經(jīng)損傷后，miRNAs通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制調(diào)節(jié)雪旺細胞的脫分化與再分化,實現(xiàn)了其在神經(jīng)再生修復(fù)中的關(guān)鍵作用。脫分化后的雪旺細胞通過增殖可以重新恢復(fù)受損的髓鞘，形成軸突再生的通道并且引導軸突再生進入靶組織[26]。miRNAs在雪旺細胞由髓鞘前階段向成髓鞘階段轉(zhuǎn)變過程中起關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)Dicer的缺失使大多數(shù)雪旺細胞分化停滯在成髓鞘前階段，表現(xiàn)出在不同分化狀態(tài)轉(zhuǎn)換間的一種延遲[29]，小鼠周圍神經(jīng)損傷后，雪旺細胞的脫分化與再分化的調(diào)節(jié)主要是通過miRNAs的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2]。

對小鼠坐骨神經(jīng)損傷后遠端miRNAs表達的研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可以直接與調(diào)控雪旺細胞增殖和脫分化的調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生聯(lián)系，從而提供了神經(jīng)損傷后miRNAs在調(diào)節(jié)雪旺細胞在不同狀態(tài)下轉(zhuǎn)換的一種機制;miR-34a同時是一種腫瘤抑制基因，異常表達時可導致細胞周期的阻滯。并且周圍神經(jīng)損傷后調(diào)節(jié)雪旺細胞增殖、分化和細胞周期的2個重要基因Notch1和Ccnd1，恰好是腫瘤細胞中miR-34a的作用靶點，通過小鼠實驗，神經(jīng)損傷后，隨著miR-34a表達下降，Notch1和Ccnd1表達增加；反之，上調(diào)miR-34a的表達之后，Notch1和Ccnd1的表達下降，因此在雪旺細胞中，miR-34a至少調(diào)節(jié)2種雪旺細胞增殖分化調(diào)控基因。RT-qPCR檢測表明,在成年小鼠周圍神經(jīng)中miR-34a高表達，而在神經(jīng)擠壓傷或離斷之后，miR-34a的表達迅速下降，雪旺細胞進入細胞循環(huán)周期呈現(xiàn)出分化狀態(tài)。當miR-34a表達恢復(fù)到正常水平時，雪旺細胞退出細胞循環(huán)進而呈現(xiàn)出再分化狀態(tài)[2]。

在周圍神經(jīng)損傷后，miR-140的表達也迅速下降，并且一直維持在較低水平，進而調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子早期生長反應(yīng)蛋白2(early growth response protein 2, Egr2)，伴隨著雪旺細胞呈現(xiàn)出再分化狀態(tài)，miR-140恢復(fù)到傷前水平，這說明miR-140的下調(diào)對雪旺細胞的再分化具有正向調(diào)控作用[2]。

3 miRNAs和自噬在周圍神經(jīng)再生修復(fù)的調(diào)控過程中可能存在相關(guān)性

miRNAs是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控目的基因的功能性小RNA 分子[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)途徑調(diào)控某些自噬相關(guān)基因及其調(diào)節(jié)因子[19]。

研究人員通過螢光素酶為基礎(chǔ)的篩選方法，證實了miR-101可以明顯抑制乳腺癌細胞中的自噬流，從而增加對他莫西芬的敏感性[8]；在肝癌細胞中miR-375的濃度很低，當肝癌細胞在缺血缺氧環(huán)境中誘發(fā)自噬時，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-375可以通過抑制PDK的表達，調(diào)控PDK/AKT/mTOR通路抑制自噬流，從而抑制腫瘤生長[30]。miR-204在抑癌基因VHL(von Hippel-Lindau)丟失的腎癌細胞內(nèi)水平極低，在饑餓狀態(tài)下，通過增加細胞內(nèi)miR-204含量能影響細胞產(chǎn)生完整的自噬體，導致腫瘤增殖受限[31]。在腫瘤細胞中，beclin-1被認為是miR-30a的潛在作用靶點，抑制miR-30a表達時，beclin-1表達產(chǎn)物增多，當利用雷帕霉素誘導細胞自噬后，高表達miR-30a可以通過抑制beclin-1的表達抑制自噬的活躍度[32]。已有的研究表明，在乳腺癌組織中，miR-34通過BCL-2 /beclin-1/PI3K途徑調(diào)節(jié)細胞自噬。在細胞因子作用下，PI3K活化，生成3位磷酸化的磷脂產(chǎn)物磷酸化PKB，活化的PKB從細胞膜脫離，進入胞質(zhì)和胞核，使其下游分子發(fā)生磷酸化，從而促進細胞自噬[32]。

周圍神經(jīng)損傷后，為了修復(fù)神經(jīng)的功能，雪旺細胞會經(jīng)歷一個包含脫分化、增殖以及再分化的反應(yīng)過程。許多研究已證實，雪旺細胞的自噬過程參與周圍神經(jīng)損傷后再生修復(fù)的調(diào)控，雪旺細胞作為軸突再生的紐帶，對其自噬的調(diào)控可以調(diào)節(jié)雪旺細胞的塑形性以及分化狀態(tài)，進而影響軸突再生。而miRNAs通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制調(diào)控雪旺細胞的脫分化以及再分化。當今miRNAs對自噬調(diào)節(jié)的研究主要集中于腫瘤學，在神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域自噬與miRNAs的關(guān)系尚處于探索階段。已有的研究發(fā)現(xiàn)自噬與miRNAs均與軸突再生、雪旺細胞塑形、增殖、分化、凋亡等有關(guān)，進一步我們推測miRNAs可能通某些轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)控周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)過程中的雪旺細胞的自噬作用。

4 展望

目前的研究表明，自噬與miRNAs均通過調(diào)控雪旺細胞的增殖、分化能力以及神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌影響損傷后神經(jīng)的再生修復(fù)，通過本文可以初步了解到自噬、miRNAs與周圍神經(jīng)損傷后再生修復(fù)過程中雪旺細胞的關(guān)系，但目前三者之間是否相互溝通聯(lián)系并不清楚，且在神經(jīng)學領(lǐng)域暫無相關(guān)報道，因此，探究周圍神經(jīng)損傷后雪旺細胞自噬與miRNAs的關(guān)系成為了一個亟需解決的問題，并為我們研究周圍神經(jīng)再生修復(fù)的分子機制提供了一個嶄新的方向。