維生素E對三黃肉雞免疫功能、組織α-生育酚沉積及脂蛋白酯酶、脂肪酸結(jié)合蛋白基因表達(dá)的影響

劉敏燕 卜澤明 劉文濤 甘書灝 穆勝龍 蘇立燧 梁明振*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所，南寧 530001；3.廣西富鳳集團(tuán)，南寧 530001)

動(dòng)物在受到環(huán)境不良因素刺激時(shí)，生理狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變而引起神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)等一系列應(yīng)答反應(yīng)，造成免疫力和抵抗力低下，最終對其生長發(fā)育、生產(chǎn)性能產(chǎn)生不同程度的影響，嚴(yán)重時(shí)甚至引起死亡[1]。故而在不可避免的環(huán)境應(yīng)激下，提高畜禽免疫功能有利于畜禽的健康生長，降低死亡率。已有研究表明，維生素E在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著多樣作用，可作為免疫調(diào)節(jié)制調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)的大部分組織正常執(zhí)行功能[2]，故而在畜禽飼糧適當(dāng)添加維生素E有利于其免疫功能的改善。α-生育酚是維生素E中活性最高一種形式，探索α-生育酚在機(jī)體內(nèi)沉積量是否會(huì)隨著攝入的維生素E量的增加而增加具有重要的意義。肝臟是雞進(jìn)行脂質(zhì)代謝的主要場所，而這些過程得以正常進(jìn)行有賴于許多參與脂質(zhì)代謝的相關(guān)因子，這其中就有脂蛋白脂酶(LPL)與脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)的作用。LPL是參與雞肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要因子，可以使極低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯脂解生成甘油和脂肪酸，而FABPs具有運(yùn)輸長鏈脂肪酸的作用，參與脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸濃度從而調(diào)節(jié)脂肪酸代謝[3]。FABPs分布廣泛，按被分離的組織來命名有9種類型，本研究選取其中與肝臟脂肪代謝聯(lián)系相對更密切的脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP)、心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)進(jìn)行研究[4]。由于維生素E的脂溶和抗氧化的特性，在20世紀(jì)80年代它就被認(rèn)定具有信號(hào)傳導(dǎo)和基因調(diào)控作用[5]。本試驗(yàn)研究飼糧添加不同水平的維生素E對廣西三黃肉雞免疫功能、α-生育酚沉積的影響，并著重研究維生素E能否對動(dòng)物的脂質(zhì)代謝相關(guān)候選基因存在調(diào)控作用，為維生素E是否能通過影響相關(guān)基因表達(dá)來改善動(dòng)物的脂質(zhì)代謝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將256只80日齡健康、體重相近的廣西三黃肉雞(母雞)作為試驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16只雞。試驗(yàn)采用玉米-豆粕型的基礎(chǔ)飼糧，對照組和試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0、50、100、150 mg/kg的維生素E。預(yù)試期5 d，正試期35 d。采用籠養(yǎng)方式。試驗(yàn)添加的維生素E為DL-α-醋酸生育酚，有效成分含量為50%。

1.2 試驗(yàn)飼糧

基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞均在同一雞舍內(nèi)飼養(yǎng)，籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)，采食粉料，不限制采食，自由飲水，自然光照、通風(fēng)，管理與免疫程序按雞場常規(guī)方法進(jìn)行。

1.4 采樣

試雞飼養(yǎng)至120日齡結(jié)束，每重復(fù)隨機(jī)選2只試雞，宰前禁食12 h,只供飲水。屠宰時(shí)剖開體腔,仔細(xì)分離出肝臟及左側(cè)胸、腿肌，用雙蒸水清洗血污雜質(zhì),稱重后取樣至于液氮中冷凍保存,后保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于測定α-生育酚的含量和基因表達(dá)量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有 One kg of premix provided the following：VA 7 000～25 000 IU，VB1≥3 mg，VB2≥8 mg，VB6≥7 mg，VB12≥0.15 mg，VD34 200～12 000 IU，VK34.5～12.5 mg，泛酸pantothenic acid≥35 mg，煙酸nicotinic acid≥80 mg，生物素biotin≥7.0 mg，膽堿choline≥1 000 mg，葉酸folic acid≥1.5 mg，Mn 100～170 mg，Zn 75～120 mg，F(xiàn)e 100～120 mg，Cu 21～80 mg，I 0.35～0.50 mg，Se 0.15～0.40 mg，Co 0.05～0.15 mg，P 2 000～8 000 mg,NaCl 2 000～5 000 mg。

2)粗蛋白質(zhì)、鈣、有效磷為實(shí)測值，其他營養(yǎng)水平為計(jì)算值。Crude protein, calcium and available phosphorus were measured values, while the other nutrient levels were calculated values.

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 免疫指標(biāo)

血清免疫指標(biāo)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定血清白細(xì)胞介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素含量；采用全自動(dòng)生化分析儀(ACA)測定血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量。

免疫器官指數(shù)：計(jì)算雞的脾臟占體重的百分比得到脾臟指數(shù)。

1.5.2 α-生育酚的含量

按照國標(biāo)方法(GB/T 9695.30—2008)采用高效液相色譜法測定肝臟、胸肌及腿肌的α-生育酚的含量。

1.5.3 基因表達(dá)的測定

總RNA提取采用Trizol法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件及按照GenStar公司的總RNA提取試劑盒說明操作。用酶標(biāo)儀測定提取的總RNA濃度與純度測定。

結(jié)合cDNA合成試劑盒的使用說明與本實(shí)驗(yàn)室的條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

參考GenBank的雞的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、LPL、A-FABP、H-FABP、L-FABP基因的序列,設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物。GAPDH，上游:5′-GGGGAAAGTCATCCCTGAGC-3′,下游:5′-TTGGCTGGTTTCTCCAGACG-3′;LPL，上游:5′-CCGATCCCGAAGCTGAGATG-3′,下游:5′-ACATTCCTGTCACCGTCCAC-3′;A-FABP，上游:5′-ATATGAAAGAGCTGGGTGTGGG-3′，下游:5′-TTTCTGTCATCTGCTGTGGTCT-3′;H-FABP，上游:5′-ACGGTGAAGACCCATAGCAC-3′，下游:5′-TTGACCAAGGACTTGACATGC-3′;L-FABP，上游：5′-ACTGTGACTACTGGCTCCAAAG-3′，下游:5′-TCCCTTCGTCATTGTATGGGTG-3′。

實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×RealStar Green Fast Mixture with ROX Ⅱ 10 μL，RNase-free H2O 7 μL。按體系把各反應(yīng)成分加入PCR管混勻，低速離心使反應(yīng)液集中于底部且使管中無氣泡，放入實(shí)時(shí)定量PCR儀按照設(shè)定好的程序進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性0.5 min，56 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸0.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。采用2-ΔΔCt法對基因表達(dá)量進(jìn)行相對定量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，再用Duncan氏法做多重比較，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 維生素E對廣西三黃肉雞血清免疫指標(biāo)及免疫器官指數(shù)的影響

由表2可見，與對照組相比，飼糧添加50 mg/kg維生素E使雞血清中IgA含量顯著提高(P<0.05)；飼糧添加150 mg/kg維生素E使雞血清中IgM含量顯著提高 (P<0.05)；飼糧添加不同水平的維生素E對雞血清中IL-2、TNF-α、γ干擾素、IgG含量及脾臟指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧不同水平維生素E對廣西三黃肉雞血清免疫指標(biāo)及免疫器官指數(shù)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 維生素E對廣西三黃肉雞肝臟α-生育酚沉積的影響

由表3可見，與對照組相比，飼糧添加50、100及150 mg/kg維生素E均能顯著提高雞肝臟α-生育酚含量(P<0.05)；飼糧添加150 mg/kg維生

素E顯著提高雞胸肌α-生育酚含量(P<0.05)；飼糧添加不同水平維生素E對雞腿肌α-生育酚含量無顯著影響(P>0.05)，但隨著維生素E的增加，雞腿肌α-生育酚含量有所提高。

表3 飼糧不同水平維生素E對廣西三黃肉雞肝臟α-生育酚沉積的影響

2.3 維生素E對廣西三黃肉雞肝臟LPL及FABPs基因表達(dá)量的影響

由表4可知，隨著在飼糧維生素E添加水平的升高，雞肝臟的LPL、H-FABP及L-FABP基因的表達(dá)量均呈升高趨勢。與對照組相比，飼糧添加100和150 mg/kg維生素E顯著提高雞肝臟的LPL基因表達(dá)量(P<0.05)；飼糧添加150 mg/kg維生素E顯著提高雞肝臟的H-FABP基因表達(dá)量(P<0.05)；飼糧添加50、100及150 mg/kg維生素E均顯著提高雞肝臟的L-FABP基因表達(dá)量(P<0.05)；飼糧添加不同水平維生素E對雞肝臟的A-FABP基因表達(dá)量無顯著的影響(P>0.05)。

表4 飼糧不同水平維生素E對廣西三黃肉雞肝臟的LPL及FABPs基因的表達(dá)量的影響

2.4 飼糧維生素E添加水平與廣西三黃肉雞組織α-生育酚含量、LPL及FABPs基因表達(dá)量的相關(guān)關(guān)系

由表5可知，在三黃肉雞中，維生素E添加水平與腿肌α-生育酚含量及肝臟LPL、H-FABP、L-FABP基因表達(dá)量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

3.1 維生素E對廣西三黃肉雞免疫功能的影響

在雛鴨飼糧中添加維生素E，可顯著提高血清IgA含量，IgG和IgM含量也有升高趨勢[6]。國外研究還表明，在給胚蛋注射維生素E后，其孵化率顯著升高，雞42日齡時(shí)，血清IgM和IgA含量顯著提高，血清IgG含量也有所提高[7]。本試驗(yàn)中，與對照組相比，各試驗(yàn)組肉雞血清IgG、IgA、IgM含量均有不同程度的提高，血清IL-2含量在試驗(yàn)組呈升高的趨勢。這說明在飼糧中添加適宜水平的維生素E能增加肉雞血清免疫球蛋白合成及促進(jìn)IL-2的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力和對外界不良環(huán)境的抵抗力。蔣守群等[8]研究認(rèn)為，維生素E缺乏會(huì)使家禽的免疫器官生長發(fā)育受到抑制甚至損傷，維生素E能顯著降低其血清中TNF-α含量。而本試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上支持了以上觀點(diǎn)，維生素E對TNF-α的分泌有抑制作用，減輕因其引起的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的正常應(yīng)答。綜上，廣西三黃肉雞飼糧中增加適當(dāng)水平的維生素E有利于機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答因子的良好發(fā)展，進(jìn)而一定程度上改善機(jī)體的免疫功能。

表5 飼糧維生素E添加水平與廣西三黃肉雞組織α-生育酚含量及LPL、FABPs基因表達(dá)量的相關(guān)關(guān)系

*表示顯著相關(guān)(P<0.05)。

* mean significant correlation (P<0.05).

3.2 維生素E對廣西三黃肉雞組織α-生育酚含量的影響

α-生育酚是維生素E的最主要活性成分，也是存在最多的一種異構(gòu)體，故其在機(jī)體的含量基本可以代表維生素E的沉積情況。張宏馨等[9]研究表明提高維生素E添加水平，能顯著提高蛋雞肝臟α-生育酚含量。而在肉雞飼糧添加α-生育酚醋酸酯，也可顯著增加其血清中α-生育酚醋酸酯的含量[10]。更早的研究也表明，隨著蛋雞飼糧維生素E水平的升高，蛋黃、肝臟及肌肉的α-生育酚含量顯著提高[11]。本試驗(yàn)的結(jié)果類似，這都表明了維生素E添加量與α-生育酚沉積正相關(guān)性較高，在允許范圍內(nèi)，機(jī)體攝入的維生素E越多其各組織沉積量也會(huì)越多。在3種組織中，可看出肝臟的α-生育酚沉積是胸肌、腿肌的幾倍到十倍，這一定程度上表明了肝臟可能是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)α-生育酚發(fā)揮作用的重要場所。

3.3 維生素E對廣西三黃肉雞LPL及FABPs基因表達(dá)的影響

LPL基因表達(dá)水平與機(jī)體脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，不僅與肌內(nèi)脂肪沉積有積極關(guān)系[12]，還是影響血漿脂質(zhì)水平的關(guān)鍵因素[13]，本試驗(yàn)探討維生素E是否能影響其向積極方面表達(dá)。結(jié)果表明，添加高水平的維生素E可顯著提高肝臟LPL基因表達(dá)量，且兩者呈顯著正相關(guān)，說明維生素E可能影響LPL基因的表達(dá)而間接影響機(jī)體的脂質(zhì)代謝。A-FABP由脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放，參與細(xì)胞間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，是代謝和血管風(fēng)險(xiǎn)生物標(biāo)志物[14]。本試驗(yàn)中，維生素E對肉雞肝臟A-FABP基因表達(dá)量有不顯著的微調(diào)作用，不會(huì)過高而對脂質(zhì)代謝產(chǎn)生不利影響。H-FABP基因與脂肪組織的發(fā)育和功能密切相關(guān),被認(rèn)為是脂質(zhì)代謝的候選基因，能影響脂肪沉積[15]。本試驗(yàn)中，高水平的維生素E可顯著提高試雞肝臟H-FABP基因表達(dá)量，且兩者呈顯著正相關(guān)，說明維生素E可能可以通過影響H-FABP基因表達(dá)量來調(diào)節(jié)機(jī)體組織脂肪的沉積。肝臟中L-FABP基因的表達(dá)量受許多因素的影響，如高脂飼糧會(huì)使大鼠肝臟的L-FABP基因的表達(dá)量升高[16]，增加飼糧中的維生素E水平也能顯著提高騾鴨肝臟中L-FABP基因表達(dá)量[17]。本試驗(yàn)結(jié)果與以上結(jié)論基本一致。綜上表明，維生素E可一定程度影響與機(jī)體脂質(zhì)代謝相關(guān)的LPL、H-FABP、L-FABP基因的表達(dá)，進(jìn)而證明了維生素E可能存在影響相關(guān)基因的表達(dá)來間接對機(jī)體脂質(zhì)代謝產(chǎn)生影響，但具體的影響機(jī)制還有待一步研究。

4 結(jié) 論

飼糧添加高水平(150 mg/kg)的維生素E可以改善廣西三黃肉雞的免疫功能，提高組織中α-生育酚的沉積，調(diào)節(jié)肝臟LPL、H-FABP、L-FABP基因表達(dá)量，從而影響機(jī)體的脂質(zhì)代謝。

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*Corresponding author, professor, E-mail: lmzhen62@163.com