結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制和檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

宋婧 車(chē)南穎

[摘要] 本文綜述了結(jié)核分枝桿菌（MTB）的耐藥機(jī)制和檢測(cè)方法。耐藥機(jī)制分為細(xì)胞壁滲透性降低及外排泵作用的固有性耐藥機(jī)制和靶基因突變的獲得性耐藥機(jī)制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，藥物作用的靶基因突變被認(rèn)為是MTB耐藥的主要機(jī)制。耐藥的檢測(cè)方法主要為表型藥敏檢測(cè)和分子藥敏檢測(cè)。表型檢測(cè)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)周期較長(zhǎng)，而基因突變檢測(cè)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，在結(jié)核病的診斷中有更好的應(yīng)用前景。本文對(duì)MTB的耐藥機(jī)制和檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，以期為開(kāi)發(fā)快速分子診斷工具和抗結(jié)核新藥的研發(fā)提供參考或借鑒。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；耐藥；檢測(cè)方法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R378.91 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）10（b）-0029-06

[Abstract] This article reviews the mechanism and detection methods of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis（MTB）. The mechanism of drug resistance is divided into intrinsic resistance mechanism of cell wall permeability reduction and efflux pump action and acquired resistance mechanism of target gene mutation. With the development of molecular biology techniques， mutations in target genes are considered to be the main mechanism of drug resistance for MTB. The main detection methods for drug resistance are phenotypic susceptibility testing and molecular susceptibility testing. The phenotypic assay method is used as the golden standard， but the detection period is long， while gene mutation detection can be completed within a few hours， so there is a better application prospect in the diagnosis of tuberculosis. In this paper， the mechanism and detection methods of drug resistance in MTB are reviewed in order to provide some reference for the development of rapid molecular diagnostic tools and anti-tuberculosis drugs.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance； Detection method

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致的慢性傳染病。盡管近年來(lái)TB的防治取得了進(jìn)展，但其仍然是全球十大死因之一。根據(jù)2017年WHO最新報(bào)告，2016年全球估計(jì)有1040萬(wàn)TB新發(fā)病例[1]。中國(guó)TB新發(fā)病例在90萬(wàn)左右，新發(fā)耐藥TB患者約5.8萬(wàn)人，且大部分患者未被發(fā)現(xiàn)或未接受治療，我國(guó)TB的形勢(shì)依然嚴(yán)峻，而MTB的耐藥是治療TB亟待解決的難題之一。目前部分闡明的MTB的耐藥機(jī)制分為固有性耐藥機(jī)制和獲得性耐藥機(jī)制，且藥物作用的靶基因突變的獲得性分子耐藥機(jī)制是MTB耐藥的主要機(jī)制[2]。MTB耐藥性的檢測(cè)方法分為表型藥敏試驗(yàn)和耐藥基因突變檢測(cè)兩種方法。本文對(duì)MTB耐藥機(jī)制和檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述與展望。

1 MTB耐藥機(jī)制

1.1 固有性耐藥機(jī)制

1.1.1 MTB細(xì)胞壁滲透性障礙 細(xì)胞壁滲透性障礙，是MTB對(duì)常見(jiàn)的非抗結(jié)核抗生素產(chǎn)生耐藥的原因之一。MTB細(xì)胞壁的脂質(zhì)含量非常高，對(duì)親水性抗生素的滲透性非常低，這一物理屏障特性保護(hù)其免受有毒化合物影響。分枝桿菌的細(xì)胞壁由3個(gè)主要成分組成：肽聚糖（peptidoglycan，PG），阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）和分枝菌酸（mycolic acids，MA）[3]。青霉素結(jié)合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）是參與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖生物合成的酶，在多數(shù)細(xì)菌中，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素滅活PBPs必需的D-D轉(zhuǎn)肽酶從而殺滅細(xì)菌，有研究發(fā)現(xiàn)MTB具有第二類(lèi)轉(zhuǎn)肽酶，即L-D轉(zhuǎn)肽酶，導(dǎo)致MTB對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥[4]。親水性抗生素通常利用通道蛋白穿過(guò)細(xì)菌外膜，有研究表明編碼細(xì)胞壁通道蛋白的MspA基因突變引起的通道蛋白的丟失可能導(dǎo)致MTB對(duì)鏈霉素耐藥[5]。

1.1.2 MTB藥物外排泵（EPs） EPs是一種膜蛋白，MTB可以通過(guò)EPs排出進(jìn)入細(xì)菌的藥物，使藥物濃度降低產(chǎn)生耐藥。目前已經(jīng)鑒定了分枝桿菌中的幾種藥物EPs，分別屬于以下5個(gè)結(jié)構(gòu)家族：主要異化子超家族（MFS）、小多重耐藥家族（SMR）、耐結(jié)節(jié)細(xì)胞分裂超家族（RND）、ATP結(jié)合盒超家族（ABC）和多藥及毒性化合物外排家族（MATE）。以MTB中MFS泵的研究為例：Rv2459（jefA）基因的轉(zhuǎn)錄增加導(dǎo)致對(duì)異煙肼（Isoniazid，INH）和乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）的耐藥性增加[6]。有研究表明，EPs可能在那些沒(méi)有INH和利福平（Rifampin，RIF）耐藥相關(guān)的基因突變的耐藥MTB菌株中發(fā)揮重要作用[7]。

1.1.3 MTB中的雙組分系統(tǒng)（two component systems，TCS） TCS由組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)子兩部分組成，調(diào)節(jié)細(xì)菌的生理過(guò)程和代謝過(guò)程，在細(xì)菌的毒力及致病性方面發(fā)揮重要作用。休眠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（DosR）是MTB中已被鑒定的TCS，其被誘導(dǎo)以適應(yīng)缺氧等多種應(yīng)激反應(yīng)。MTB中的DosR、mbtB和hspX被報(bào)道參與從休眠到藥物耐受的各種過(guò)程[8]。Nandakumar等[9]的研究表明，用INH處理野生型的MTB可引起DosR基因的表達(dá)增加。MTB TCS與耐藥的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

1.2 獲得性耐藥機(jī)制

1.2.1 一線(xiàn)抗結(jié)核藥物的獲得性耐藥 RIF是最主要的一線(xiàn)抗結(jié)核的藥物，其作用機(jī)制是通過(guò)與RNA聚合酶β亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致細(xì)菌死亡。超過(guò)95%的耐藥菌株在編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因的81 bp（編碼密碼子507～533）利福平耐藥決定區(qū)（rifampin resistance determing region，RRDR）中具有突變，導(dǎo)致RIF不能與RNA聚合酶β亞基結(jié)合引起耐藥，常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是Asp-516-Val、His-526-Tyr/Asp及Ser-531-Leu[10]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)RRDR區(qū)外的突變，146、572、626位點(diǎn)突變與RIF耐藥有關(guān)[11]。少數(shù)菌株RIF耐藥與RNA聚合酶α、β亞單位的編碼基因rpoA、rpoC突變相關(guān)，在非洲國(guó)家比較常見(jiàn)[12]。

INH是目前使用最廣泛的一線(xiàn)抗結(jié)核藥物，其作用機(jī)制較復(fù)雜。INH在過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的作用下轉(zhuǎn)化為異煙酸，異煙酸代替煙酸結(jié)合NAD+，使得NAD+不能催化正常的氧化還原反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)菌死亡。KatG基因編碼過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶，它的突變導(dǎo)致INH不能轉(zhuǎn)化為異煙酸，從而使MTB耐藥。常見(jiàn)突變位點(diǎn)是Ser-315-Thr，占INH耐藥菌株的70%～80%[13]。另一個(gè)常見(jiàn)突變是inhA啟動(dòng)子區(qū)-15C-T位點(diǎn)的突變，導(dǎo)致inhA的過(guò)度表達(dá)，常與低水平耐INH有關(guān)。katG S315T和inhA啟動(dòng)子-15C-T的兩個(gè)突變可以解釋超過(guò)80%的INH耐藥病例[14]。目前發(fā)現(xiàn)沒(méi)有KatG和inhA突變的INH耐藥菌株可能與ahpC、kasA、fabG1和ndh基因的突變有關(guān)，例如ndh基因編碼NADH脫氫酶，該基因突變導(dǎo)致NADH含量增加，干擾INH的過(guò)氧化作用，導(dǎo)致INH耐藥[15]。但這些基因突變?cè)贗NH耐藥中的作用仍需進(jìn)一步研究。

EMB是一種阿拉伯糖類(lèi)似物，通過(guò)抑制阿拉伯糖基聚合入細(xì)胞壁中的阿拉伯半乳聚糖而干擾細(xì)胞壁的生物合成，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。embCAB基因座（MTB中編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶）特別是embB基因的突變（Met-306-Val/Ile/Leu）是MTB中EMB耐藥的主要原因，約占70%[16]。除embB外，embCAB基因座上其他基因突變也可導(dǎo)致EMB耐藥。embC的突變頻率僅次于embB，還有約15%的突變位于embC-embA基因區(qū)間[17]。

吡嗪酰胺（Pyrazinamide，PZA）作用于MTB菌體內(nèi)，pncA基因編碼的酰胺酶使PZA脫去酰胺基，轉(zhuǎn)化為有活性的吡嗪酸而發(fā)揮殺菌作用。MTB pncA基因突變（Asp-12-Ala/Asn，Leu-85-Pro）導(dǎo)致PZA不能轉(zhuǎn)化為吡嗪酸，是MTB對(duì)PZA耐藥的主要機(jī)制，占68%～97%[18]。一些研究還發(fā)現(xiàn)rpsA（編碼核糖體蛋白S1）、panD（編碼天冬氨酸脫羧酶）和clpC1（編碼ATP依賴(lài)性ATP酶）基因的突變也與PZA耐藥有關(guān)[19]，但仍有待研究。

鏈霉素（Streptomycin，Sm）通過(guò)結(jié)合細(xì)菌核糖體的30S亞基抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致翻譯過(guò)程中mRNA信息的錯(cuò)讀而殺菌。Sm的作用靶點(diǎn)是核糖體30S亞基中的核糖體蛋白S12和16S rRNA，70%～95%的耐藥是編碼16S rRNA的rrs基因（A1401G，SNP）突變和編碼核糖體蛋白S12的基因rpsL（Lis-43-Arg）突變所致[20]，因此已成為臨床檢測(cè)的主要耐藥基因。

1.2.2 二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的獲得性耐藥 氨基糖苷類(lèi)藥物中的卡那霉素（Kanamycin，Kan）和阿米卡星（Amikacin，Amk）是治療耐多藥TB和廣泛耐藥TB的二線(xiàn)注射藥物，其殺菌作用機(jī)制也是通過(guò)結(jié)合細(xì)菌核糖體的30S亞基而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。rrs基因（A1401G）突變導(dǎo)致Kan和Amk的高水平耐藥性，占30%～90%[21]。有研究發(fā)現(xiàn)Kan耐藥菌株中存在eis啟動(dòng)子區(qū)域的點(diǎn)突變或whiB7中5'端非翻譯區(qū)的突變，但確切機(jī)制還有待證實(shí)[22]。在Kan、Amk、卷曲霉素和紫霉素（Viomycin，Vim）之間存在各種交叉耐藥[23]。

氟喹諾酮類(lèi)（莫西沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星）藥物作用于兩種必需的細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶，DNA促旋酶（也稱(chēng)為拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ使細(xì)菌不能正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄進(jìn)而殺死細(xì)菌。MTB中的DNA促旋酶是由gyrA和gyrB基因編碼的2個(gè)A亞基和2個(gè)B亞基組成的四聚體。氟喹諾酮耐藥與gyrA（Ala-90-Val、Asp-94-Gly/Tyr）和gyrB（Asn-533-Thr）的喹諾酮耐藥決定區(qū)域（QRDR）的突變有關(guān)[24]。

D-環(huán)絲氨酸（D-Cycloserine，Dcs）是D-丙氨酸的一種類(lèi)似物，通過(guò)抑制MTB的alr和ddl兩種酶，進(jìn)而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的形成，減少其耐酸能力而起到殺菌及抑菌的作用。cycA屬于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族，負(fù)責(zé)D-丙氨酸、D-絲氨酸的運(yùn)輸，參與環(huán)絲氨酸的正常吸收。alrA基因和cycA基因的突變可能是MTB D-環(huán)絲氨酸耐藥機(jī)制之一[25]。

利奈唑胺是一種惡唑烷酮類(lèi)抗生素，通過(guò)與細(xì)菌50S亞基核糖體RNA的23S位點(diǎn)結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。在一項(xiàng)有39例患者的研究中，34例在利奈唑胺治療的6個(gè)月內(nèi)實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰，除出現(xiàn)周?chē)窠?jīng)病變和骨髓抑制的副作用外，還出現(xiàn)了血小板減少癥和視神經(jīng)炎的嚴(yán)重副作用[26]。利奈唑胺使用受限于嚴(yán)重的藥物毒性。目前，在耐利奈唑胺MTB臨床分離株中檢測(cè)到rplC基因和rrl基因的突變[27]。

氯法齊明（clofazimine，Cfz）是WHO推薦的新的短期耐多藥治療方案的組成部分[28]。其殺菌機(jī)制可能與Cfz氧化還原循環(huán)產(chǎn)生活性氧類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，氯法齊明-貝達(dá)喹啉交叉耐藥菌株均在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rv0678基因中有突變。該突變導(dǎo)致EPs MmpL5的表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生對(duì)Cfz和貝達(dá)喹啉的交叉抗性。在Cfz敏感菌株中不存在Rv0678突變，無(wú)Rv0678突變的Cfz耐藥菌株在Rv1979c中具有A155C突變[29]。

貝達(dá)喹啉（Bedaquiline）是40多年來(lái)第一種以新機(jī)制上市的抗結(jié)核藥物。是用于耐多藥TB的二芳基喹啉藥物，結(jié)合并抑制由atpE編碼的分枝桿菌ATP合酶阻止MTB利用ATP導(dǎo)致細(xì)菌死亡。貝達(dá)喹啉耐藥菌株的atpE基因的突變通常在Ala-63-Pro及Ile-66-Met。沒(méi)有atpE突變的耐貝達(dá)喹啉菌株中存在Rv0678的突變，常常與Cfz產(chǎn)生交叉耐藥[30]。

2 MTB耐藥檢測(cè)的主要方法

2.1 表型檢測(cè)方法

2.1.1 傳統(tǒng)藥物敏感性檢測(cè)（drug susceptibility testing，DST） DST是多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）-TB檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，常用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)評(píng)，常用的有絕對(duì)濃度法、抑制率法和瓊脂比例法三種。絕對(duì)濃度法和抑制率法是計(jì)算含梯度濃度藥物培養(yǎng)基上最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的方法，以此反映MTB對(duì)藥物的敏感性。瓊脂比例法是將MTB接種在不含藥物和含有臨界值濃度藥物的培養(yǎng)基上，觀察菌株生長(zhǎng)情況。比例法較前兩種方法操作繁瑣，且只能定性。無(wú)論哪種DST實(shí)驗(yàn)，均存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、耗時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，不能滿(mǎn)足臨床快速診斷的需要。

2.1.2 顯微鏡觀察藥物敏感性檢測(cè)（microscopic observation of drug susceptibility，MODS）技術(shù) MODS技術(shù)的原理是將標(biāo)本接種在含抗結(jié)核藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MTB生長(zhǎng)會(huì)表達(dá)索狀因子，使細(xì)菌聚集呈條索狀結(jié)構(gòu)。若無(wú)此結(jié)構(gòu)，表明MTB對(duì)該藥物敏感。通過(guò)顯微鏡下對(duì)特征性索狀結(jié)構(gòu)的觀測(cè)，來(lái)確定有無(wú)MTB生長(zhǎng)及其對(duì)藥物的敏感狀態(tài)。該法將檢測(cè)周期縮短至1周，且有研究表明此法的敏感性和特異性較高[31]，成本低，操作安全。但因?qū)z測(cè)人員的要求較高限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。

2.1.3 基于MTB代謝反應(yīng)的檢測(cè)方法 BACTEC MGIT960是目前常用的快速M(fèi)TB培養(yǎng)及藥敏鑒定的生長(zhǎng)指示管系統(tǒng)，其將感應(yīng)到的MTB生長(zhǎng)時(shí)氧氣量的變化，轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)被探測(cè)器監(jiān)測(cè)。檢測(cè)周期平均縮短至5～8 d，自動(dòng)化程度較高、污染率低，可用于該系統(tǒng)的標(biāo)本來(lái)源廣，因此WHO批準(zhǔn)其為MTB耐藥性檢測(cè)的推薦方法[32]。

此外，硝酸還原酶試驗(yàn)（NRA）和氧化還原指示劑試驗(yàn)（CRI）試驗(yàn)也是利用細(xì)菌生化代謝反應(yīng)進(jìn)行藥敏鑒定的方法。在加入抗結(jié)核藥物的培養(yǎng)基中觀察MTB與指示劑反應(yīng)后的顏色變化，判斷對(duì)該藥物敏感性[33]。兩種方法檢測(cè)周期均在7～10 d，但因操作步驟沒(méi)有完全標(biāo)準(zhǔn)化，且少數(shù)結(jié)核菌種并不具備上述代謝反應(yīng)使該法未被廣泛使用。

2.2 基因檢測(cè)方法

2.2.1 GeneXpert MTB/RIF和Xpert MTB/RIF Ultra GeneXpert MTB/RIF是由Cepheid 公司開(kāi)發(fā)的以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，rpoB基因?yàn)榘谢?，系統(tǒng)自動(dòng)運(yùn)行并同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本中是否含有MTB，RIF是否耐藥的診斷平臺(tái)，其減少了人為操作誤差，且檢測(cè)周期只需要2 h，是目前WHO推薦用于檢測(cè)RIF耐藥的方法。李妍等[34]的研究顯示痰標(biāo)本的Xpert MTB/RIF敏感度最高可達(dá)97.5%，特異度為95%～99%，對(duì)肺外結(jié)核診斷也有一定的價(jià)值。此方法的缺點(diǎn)是檢測(cè)不到少數(shù)突變發(fā)生在RRDR序列以外的RIF耐藥菌株。另外，當(dāng)檢測(cè)涂片陰性的痰標(biāo)本和含有較低水平MTB的肺外組織標(biāo)本時(shí)，其靈敏度稍差。由Cepheid開(kāi)發(fā)的新的Xpert MTB/RIF Ultra試劑盒與現(xiàn)有的Xpert MTB/RIF相比有了更好的靈敏度，將PCR反應(yīng)中純化DNA的數(shù)量加倍，添加了針對(duì)IS6110和IS1081的實(shí)時(shí)熒光定量TB檢測(cè)探針，并結(jié)合探針熔解曲線(xiàn)的雙鏈DNA熔點(diǎn)（Tm值）進(jìn)行分析。最新的研究顯示TB陽(yáng)性痰標(biāo)本Xpert MTB/RIF Ultra檢出的靈敏度比Xpert大約提高了8倍[35]。Bahr等[36]的研究報(bào)道Xpert MTB/RIF Ultra檢測(cè)疑診或確診結(jié)核性腦膜炎的患者腦脊液標(biāo)本的敏感性為70%，Xpert MTB/RIF為43%，細(xì)菌培養(yǎng)法也為43%。WHO推薦使用Xpert MTB/RIF Ultra作為疑似結(jié)核性腦膜炎的初步診斷測(cè)試。

2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量探針熔解曲線(xiàn) 在PCR體系中加入兩端分別標(biāo)有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針，根據(jù)探針與標(biāo)本中不同的靶序列雜交后形成的雙鏈DNA Tm值的差異可推斷靶序列的突變信息。如果靶序列與探針完全匹配，則探針與該序列雜交的Tm值最高，如果序列發(fā)生點(diǎn)突變、插入或缺失，則探針與該序列雜交的Tm值低于完全匹配的Tm值，即有耐藥突變的發(fā)生。相關(guān)研究表明熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法和表型藥敏試驗(yàn)檢測(cè)RIF、INH耐藥結(jié)果具有較高的一致性，臨床上熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法可用于INH、RIF、EMB、Sm、喹諾酮類(lèi)等藥物的耐藥基因檢測(cè)[37-38]。

2.2.3 線(xiàn)性探針技術(shù)（line probe assays，LPA） LPA又稱(chēng)固相雜交分析，MTB DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)先固化在試紙條上的特異性探針雜交，通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)判定耐藥相關(guān)基因突變[39]。商品化線(xiàn)性探針技術(shù)主要包括GenoType MTBDRplus和INNO-LiPA Rif.TB兩種試劑盒[40]。由德國(guó)Hain公司推出的GenoType MTB-DRplus耐多藥檢測(cè)試劑盒，可同時(shí)檢測(cè)RIF（rpoB）和INH（katG、inhA）的耐藥性，且研究表明，該技術(shù)無(wú)論對(duì)痰涂陽(yáng)性還是痰涂陰性標(biāo)本的RIF、INH耐藥檢測(cè)均有較高靈敏度和特異性[41]。比利時(shí)Innogenetics公司INNO-LiPA Rif.TB試劑盒也可檢測(cè)RIF的rpoB基因突變。這兩種試劑盒檢測(cè)周期短，但檢測(cè)結(jié)果需人工判斷，操作流程復(fù)雜，且檢測(cè)位點(diǎn)少，不能完全檢出廣泛耐藥TB。

2.2.4 基因芯片 基因芯片技術(shù)的原理是將MTB的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在芯片上的探針雜交，掃描芯片及判讀結(jié)果，從而發(fā)現(xiàn)突變的耐藥基因?；蛐酒夹g(shù)是一種快速、安全、高通量的檢測(cè)手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于結(jié)核的菌種鑒定、耐藥性檢測(cè)及基因組比較分析等研究領(lǐng)域。有研究顯示基因芯片技術(shù)診斷MDR-TB的靈敏度和特異度分別為64.62%和97.75%[42]?；蛐酒蛔阒幵谟跇悠返臏?zhǔn)備與標(biāo)記繁瑣，檢測(cè)成本較高，相關(guān)檢查設(shè)備昂貴。

2.2.5 DNA測(cè)序技術(shù) DNA測(cè)序是指對(duì)MTB特定基因片段或全部基因組進(jìn)行測(cè)序，然后與已知的標(biāo)準(zhǔn)株基因序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)耐藥基因突變。目前，美國(guó)Illumina MiSeq和Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序（Thermo Fisher Scientific）的二代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing，NGS）系統(tǒng)已被用于檢測(cè)與MTB耐藥相關(guān)的突變。Illumina測(cè)序的技術(shù)原理是采用可逆性末端邊合成邊測(cè)序反應(yīng)，在堿基延伸過(guò)程中，根據(jù)4種不同的熒光信號(hào)確認(rèn)堿基種類(lèi)。Ion Torrent是利用摻入的脫氧核糖核苷酸（dNTP）聚合過(guò)程中釋放H+離子，半導(dǎo)體芯片感應(yīng)pH變化，每一步洗去未結(jié)合的dNTP進(jìn)行測(cè)序[43]。NGS的快速發(fā)展，使MTB全基因組測(cè)序（WGS）越來(lái)越快速和準(zhǔn)確，成本也不斷降低，有利于發(fā)現(xiàn)TB新的耐藥分子機(jī)制。更值得期待的是，利用鳥(niǎo)槍宏基因組學(xué)（SMS）從臨床樣本例如痰樣本中直接測(cè)序進(jìn)行快速耐藥檢測(cè)診斷，但少量的細(xì)菌基因組和人類(lèi)脫氧核糖核酸的競(jìng)爭(zhēng)不占優(yōu)勢(shì)，需要有針對(duì)性的方法專(zhuān)門(mén)捕捉MTB細(xì)胞或DNA[44]。由于存在對(duì)技術(shù)人員要求高、檢測(cè)設(shè)備昂貴的問(wèn)題，DNA測(cè)序難以在短期時(shí)間內(nèi)廣泛用于臨床MDR-TB檢測(cè)。

3 總結(jié)與展望

本文分別對(duì)MTB耐藥機(jī)制和檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，理解MTB的耐藥機(jī)制有助于分子診斷工具的發(fā)展和抗結(jié)核新藥的研發(fā)。目前MTB的耐藥機(jī)制尚未完全研究清楚，雖然藥物作用的靶基因突變的獲得性耐藥為主要機(jī)制，但表型耐藥與基因突變耐藥的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。有些耐藥菌不能用現(xiàn)有的耐藥機(jī)制解釋?zhuān)源嬖谏形窗l(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制。MTB耐藥異質(zhì)性的問(wèn)題需要進(jìn)一步研究，了解耐藥TB發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，有助于建立更有效的治療方案。在檢測(cè)方法方面，臨床診斷MTB的耐藥性需要快速和準(zhǔn)確，基因突變檢測(cè)是目前診斷MTB耐藥最快的方法，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，它挑戰(zhàn)了作為MTB耐藥檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)的表型檢測(cè)方法，在TB的診斷中有更好的應(yīng)用前景。NGS技術(shù)可以更多地檢測(cè)出耐藥性相關(guān)的基因，未來(lái)需要對(duì)這些基因進(jìn)一步研究補(bǔ)充評(píng)估以確定它們?cè)谀退幮灾械淖饔谩?/p>

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（收稿日期：2018-04-09 本文編輯：張瑜杰）