牡荊素對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的緩解作用及對(duì)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白水平的影響

亓洪德 盧 程 李 庭 亓?xí)?高圣龍

(山東省濟(jì)南市人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，濟(jì)南 271100)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 是一種以晨僵、關(guān)節(jié)腫痛、活動(dòng)受限為主要臨床癥狀的慢性炎癥性自身免疫性疾病，最終會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-3]。RA的發(fā)病原因和機(jī)制復(fù)雜，難以根治，新藥物的開發(fā)是治療RA的新希望。牡荊素是從中藥材牡荊葉和牡荊子中提取的天然黃酮類化合物，具有抑菌、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心臟、保護(hù)神經(jīng)等多種生理作用[4-8]，但對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠RA作用機(jī)制尚未明確。輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cell，Th17)是能夠分泌IL-17的T細(xì)胞亞群，輔助性T細(xì)胞23(T helper 23 cell，Th23)是能夠分泌IL-23的T細(xì)胞亞群，在RA患者病灶部位高表達(dá)，并與RA的嚴(yán)重程度有關(guān)[9]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類依賴鈣鋅等金屬離子的內(nèi)肽酶家族，在RA中參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)[10]。本文研究牡荊素對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠RA的作用及對(duì)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，牛Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，牡荊素購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，HE染色試劑盒購(gòu)自舜百生物科技有限公司，BCA試劑盒購(gòu)自上海晶康生物工程有限公司，IL-17和 IL-23 ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)科技生物有限公司。

1.2方法

1.2.1造模 無菌條件下配制1 mg/ml的牛Ⅱ型膠原乳液(0.1 mol/L醋酸溶解的2 mg/ml的牛Ⅱ型膠原與等體積的弗氏完全佐劑混合)。造模方法參考文獻(xiàn)[11]：模型組每只大鼠尾根部分皮內(nèi)注射0.3 ml 牛Ⅱ型膠原乳液，第15天，同等方法同劑量再次注射牛Ⅱ型膠原乳液；對(duì)照組注射等體積生理鹽水。

1.2.2分組及給藥方式 將SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組(Control組)、模型組(Model組)和給藥組[Vitexin(1.5 mg)組、Vitexin(3 mg)組、Vitexin(6 mg)組]5組，每組10只。造模52 d后，給藥組每天分別腹腔注射牡荊素1.5、3、6 mg/kg，連續(xù)3周；健康對(duì)照組和模型組注射等體積生理鹽水。

1.2.3HE染色 將大鼠軟骨組織分離，甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟、酒精至水，蘇木精水溶液和伊紅染色液染色，酒精脫水、二甲苯透明，封片觀察。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白含量 提取總蛋白后用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將待測(cè)蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液中封閉；加入對(duì)應(yīng)的一抗，4℃過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育，暗室中化學(xué)發(fā)光劑顯色成像。

1.2.5ELISA及檢測(cè)IL-17和IL-23表達(dá) 將樣品加入用純化的抗體包被的微孔板，并加入生物素化抗體和 HRP 標(biāo)記的親和素，底物 TMB 顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17+、CD4+IL-23+數(shù)量 分別取抗凝血100 μl加入不同測(cè)定管，加入CD4+IL-17+、CD4+IL-23+抗體混勻，室溫避光孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液混勻，室溫避光孵育10 min，冰PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7RT-PCR檢測(cè)MMP-1、MMP-3、MMP-13表達(dá)水平 Trizol試劑提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。96℃預(yù)變性30 s,96℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸10 s，共30個(gè)循環(huán)；4℃保存。以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1牡荊素減輕RA大鼠軟骨損傷 通過HE染色病理切片鏡檢發(fā)現(xiàn)：Control組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，腔內(nèi)無滲出液，滑膜組織正常；Model組關(guān)節(jié)間隙狹窄，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有血管翳形成；給藥組病理癥狀明顯減輕，且呈劑量依賴性減輕，見圖1。

2.2牡荊素誘導(dǎo)RA大鼠的軟骨細(xì)胞增殖 通過Western blot檢測(cè)Ki67和PCNA蛋白表達(dá)，與Control組相比，Model組Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05，圖2A)，說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠細(xì)胞增殖；與Model組相比，給藥組Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，圖2A)，且效果呈劑量依賴性增強(qiáng)，說明牡荊素呈劑量依賴性誘導(dǎo)RA大鼠的細(xì)胞增殖。

2.3牡荊素抑制RA大鼠的軟骨細(xì)胞凋亡 Western blot檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)，與Control組相比，Model組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，圖2B)，與Model組相比，給藥組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05，圖2B)，且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng)，說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的細(xì)胞凋亡。

2.4牡荊素減輕RA大鼠炎癥 ELISA檢測(cè)大鼠外周血IL-17和IL-23含量，與Control組相比，Model組IL-17和IL-23含量顯著升高(P<0.05，圖3A)，說明牡荊素可抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)；與Model組相比，給藥組IL-17和IL-23含量顯著降低(P<0.05，圖3A)，且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng)，說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

圖1 HE染色(×400)Fig.1 HE staining (×400)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17+和CD4+IL-23+水平，與Control組相比，Model組CD4+IL-17+和CD4+IL-23+所占百分比顯著升高(P<0.05， 圖3B)，說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠的炎癥反應(yīng)；與Model組相比，給藥組CD4+IL-17+和CD4+IL-23+百分比顯著降低(P<0.05，圖3B)，且效果隨給藥劑量的增加而增強(qiáng)，說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

圖2 Western blot檢測(cè)Ki67、PCNA、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of Ki67,PCNA,Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blotNote: Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

圖3 各組大鼠IL-17、IL-23、CD4+IL-17+和CD4+IL-23+水平Fig.3 IL-17,IL-23,CD4+IL-17+and CD4+IL-23+ levels in each group of ratsNote: A.IL-17 and IL-23 levels were detected by ELISA;B.CD4+IL-17+and CD4+IL-23+levels were detected by flow cytometry.Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

2.5牡荊素抑制RA大鼠MMP mRNA相關(guān)的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)大鼠MMP-1、MMP-3和MMP-13 RNA表達(dá)，與Control組相比，Model組MMP-1、MMP-3和MMP-13相關(guān)mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，圖4A)，說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA能誘導(dǎo)大鼠MMP相關(guān)RNA表達(dá)；與Model組相比，給藥組MMP-1、MMP-3和MMP-13 RNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05，圖4A)，且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng)，說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的MMP相關(guān)mRNA表達(dá)。

Western blot檢測(cè)MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)，與Control組相比，Model組MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，圖4B)，說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠MMP相關(guān)蛋白表達(dá)；與Model組相比，給藥組MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05，圖4B)，且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng)，說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的MMP相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.6牡荊素抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2通路 Western blot檢測(cè)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá),與Control組相比，Model組TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠TGF-β1/Smad2通路激活；與Model組相比，給藥組TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng)，說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2通路激活。見圖5。

圖4 各組大鼠的MMP-1、MMP-3和MMP-13表達(dá)水平Fig.4 MMP-1,MMP-3 and MMP-13 expression levels in each group of ratsNote: A.RT-PCR was used to detect expression levels of MMP-1,MMP-3 and MMP-13 rekatuve mRNA;B.Western blot was used to detect expression levels of MMP-1,MMP-3 and MMP-13.Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

圖5 Western blot檢測(cè)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)Fig.5 Detection of TGF-β1 and p-Smad2 protein expression by Western blotNote: Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

3 討論

RA發(fā)病可能與遺傳、感染和性激素等有關(guān)，病理主要是滑膜襯里細(xì)胞增生、間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及微血管的新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等[12]。本研究通過HE染色發(fā)現(xiàn)RA大鼠的關(guān)節(jié)間隙狹窄、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有血管翳形成；而給藥組大鼠病理癥狀明顯減輕，這說明牡荊素能夠減輕Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠的軟骨損傷。

RA通常會(huì)抑制軟骨細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡，從而使軟骨組織破壞，因此，有效抑制軟骨組織破壞可減輕RA。Che等[7]報(bào)道牡荊素抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟起保護(hù)作用，因此，牡荊素有望抑制軟骨組織破壞從而減輕RA。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素可顯著上調(diào)RA大鼠的Ki67和PCNA表達(dá)，顯著下調(diào)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，說明牡荊素誘導(dǎo)RA大鼠的軟骨細(xì)胞增殖、抑制RA大鼠的軟骨細(xì)胞凋亡。

RA通常存在間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，因此，有效抑制炎癥反應(yīng)可減輕RA。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)牡荊素通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡來減輕大鼠急性阿霉素的心臟毒性，因此，牡荊素有望抑制炎癥反應(yīng)從而減輕RA。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素可顯著降低RA大鼠的IL-17和IL-23含量，說明牡荊素抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群平衡紊亂在RA關(guān)節(jié)局部的炎癥發(fā)展和全身免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。Canete等[14]發(fā)現(xiàn)RA滑膜淋巴細(xì)胞因子Th17/23的高表達(dá)和較高的疾病活性有關(guān)。Th17/23高表達(dá)除了能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)外，還增強(qiáng)了關(guān)節(jié)膠原破壞、重建、使骨質(zhì)破壞，及軟骨破壞，并在急性滑膜炎轉(zhuǎn)變?yōu)槁云茐男躁P(guān)節(jié)炎中起關(guān)鍵作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著降低RA大鼠CD4+IL-17+和CD4+IL-23+所占百分比，說明牡荊素能抑制大鼠RA。

MMPs在正常的滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中無活性，而在RA患者滑膜液中高表達(dá)[16，17]，Okada等[18]研究發(fā)現(xiàn)活性MMPs具有使幾乎所有軟骨成分(蛋白聚糖、層黏連蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白Ⅳ)變性的能力。因此，有效抑制MMPs表達(dá)能夠減輕RA癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著下調(diào)RA大鼠MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)，說明牡荊素抑制RA大鼠的MMPs相關(guān)蛋白表達(dá)。

TGF-β/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、黏附及胞外基質(zhì)的產(chǎn)生中具有非重要的作用，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[19，20]。Hase等[21]研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)TGF-β/Smad2信號(hào)通路抑制OPG的產(chǎn)生有助于RA的治療，Xiong等[22]報(bào)道m(xù)iR-21通過TGF-β/Smad信號(hào)通路減輕RA，證明TGF-β/Smad信號(hào)通路在RA的治療中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著下調(diào)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)，說明牡荊素抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2信號(hào)通路。

綜上所述，牡荊素能夠減輕RA大鼠的軟骨組織損傷、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖、抑制軟骨細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，并顯著下調(diào)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白表達(dá)，從而對(duì)RA起緩解作用。這為牡荊素開發(fā)利用提供新的參考依據(jù)，為RA的預(yù)防和治療奠定理論基礎(chǔ)。