水貂銅綠假單胞菌檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，王玉茂，楊麗梅，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

水貂銅綠假單胞菌檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，王玉茂，楊麗梅，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

水貂出血性肺炎是由銅綠假單胞菌引起的威脅養(yǎng)貂業(yè)的重要疾病之一。為了解該病相關(guān)檢測方法的最新研究進展，本文從病原學和分子生物學方面，介紹了細菌分離培養(yǎng)、生化試驗、特異性抗原及其抗體檢測、PCR技術(shù)和LAMP技術(shù)等。通過比較各種方法的優(yōu)缺點和實用性，為臨床獸醫(yī)科技工作者快速、簡便、準確、實用地診斷提供參考。

水貂出血性肺炎；銅綠假單胞菌；PCR技術(shù)；LAMP技術(shù)

水貂出血性肺炎（Mink hemorrhagic pneumonia）又稱假單胞菌病或綠膿桿菌病，是由假單胞菌科假單胞菌屬中的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA，又稱綠膿桿菌）引起的一種急性敗血性傳染病。本病以出血性肺炎和急性死亡為主要特征，死亡前出現(xiàn)呼吸困難和鼻孔出血等癥狀，死后剖檢可見整個肺葉彌漫性出血和敗血癥變化。該病在世界各地均有發(fā)生，發(fā)病急，死亡快，常呈地方性暴發(fā)性流行，主要發(fā)生在每年夏季動物毛發(fā)脫落時期，其他季節(jié)亦時有發(fā)生，是嚴重威脅養(yǎng)貂業(yè)的疾病之一。1953年Knox[1]首次在丹麥報道了該病，1982年Gessord從貂體內(nèi)首次分離出病菌。我國于1977年在江蘇省連云港市某貂場首次發(fā)現(xiàn)此病[2]。隨著我國養(yǎng)貂規(guī)模的不斷擴大，該病的發(fā)生呈明顯上升趨勢，已在多地相繼暴發(fā)流行，給養(yǎng)貂業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，嚴重威脅著我國養(yǎng)貂業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。及時、準確、快速檢測是成功防治該病的關(guān)鍵。本文對水貂出血性肺炎的實驗室診斷方法進行綜述，為有效防治該病提供參考。

1 病料直接涂片鏡檢

在無菌條件下，取新鮮病死水貂肝臟、肺臟、脾臟和心血等，分別進行直接涂片、革蘭染色和鏡檢，可見有數(shù)量不等的革蘭陰性，單個、成雙或呈短鏈狀的中等大小桿菌，無莢膜和芽孢。吳娟等[3]用電鏡觀察、鑒定了一株水貂PA，為PA鞭毛蛋白的提取奠定了基礎(chǔ)。

2 細菌分離培養(yǎng)鑒定

PA可在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長，形成圓形、光滑、濕潤、扁平、中央隆起的和大小中等的菌落，菌落周圍培養(yǎng)基呈藍綠色，開蓋后有特殊的香味。PA能產(chǎn)生兩種水溶性色素：一種是綠膿菌素（Pyocynin），為藍綠色的吩嗪類分合物；另一種為熒光素（Pyoverdin），呈黃綠色。后者僅溶于水，不溶于氯仿[4]。純培養(yǎng)物在血液瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈灰褐色，周圍有β型溶血環(huán)；在肉湯培養(yǎng)基表面可見菌膜，且培養(yǎng)基呈淡綠色，隨培養(yǎng)時間延長，則綠色加深；在假單胞菌瓊脂B培養(yǎng)基上呈綠色。細菌涂片可見革蘭氏陰性菌。岳志剛等[5]通過細菌分離培養(yǎng)分離到一株水貂PA，經(jīng)動物試驗鑒定證明為該菌。

3 生化試驗鑒定

張桂賢等[6]應(yīng)用生化試驗分離鑒定了PA。該菌能發(fā)酵葡萄糖、D核糖和D果糖等，不發(fā)酵麥芽糖、D木糖、L阿拉伯糖、棉籽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、水楊苷和七葉樹苷等。過氧化氫酶、氧化酶、觸酶、運動力、硝酸鹽、溶血素和脂酶試驗，呈陽性。不產(chǎn)生吲哚，靛基質(zhì)、MR、VP和H2S試驗陰性。水解明膠而不水解淀粉。

4 血清學診斷

本病可用玻片凝集試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等血清學方法進行診斷。血清玻片凝集試驗只能用同場發(fā)病、經(jīng)治療后病愈的恢復(fù)期貂血清，來檢測該場病貂肺中用普通瓊脂分離得到的純培養(yǎng)物，有一定局限性。ELISA法可用于特異性抗原及抗體水平的檢測，特異性強，敏感性遠強于凝集試驗，但存在抗原制備過程較為復(fù)雜的缺點。Rivera等[7]用從水貂分離的PA A蛋白和G蛋白與過氧化物酶連接制成ELISA檢測試劑，用以檢測PA的血清抗體，發(fā)現(xiàn)A蛋白對抗體具有較高的親和性。

5 分子生物學診斷

5.1 PCR技術(shù)

相對于其他病原菌來說，因PA可在普通瓊脂平板和肉湯培養(yǎng)基中產(chǎn)生肉眼可見的水溶性綠色素，所以其鑒別比較容易，但并非所有菌株都能產(chǎn)生綠色素，有的菌株產(chǎn)褐色素，且同屬菌株無法區(qū)分。為此，Saint等[8]和Kureishi等[9]分別報道應(yīng)用PCR技術(shù)檢測PA。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，細菌的分類鑒定從傳統(tǒng)表型和生理生化分類進入到各種基因型分類水平。外毒素A（ETA）基因是PA中保守基因。Song等[10]曾根據(jù)其設(shè)計引物，用于PA的檢測，檢出率非常高。16SrDNA鑒定是指利用細菌16SrDNA序列測序的方法，對細菌進行種屬鑒定，是一種快速獲得細菌種屬信息的方法[11]。高玉偉等[12]和孫見等[13]根據(jù)PA 16SrDNA基因保守序列設(shè)計引物，建立了快速檢測PA的PCR方法。該法可準確地將PA與假單胞菌屬的其他菌種區(qū)別開，可以迅速對水貂的出血性肺炎作出確診，為及時控制該病提供幫助。

5.2 環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，是由日本學者Notomi[14]于2000年開發(fā)的一種恒溫核酸擴增技術(shù)。與PCR技術(shù)相比，該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上更精準，無需任何專門儀器設(shè)備即可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR技術(shù)。Motoki等[15]針對PA oprL基因的保守區(qū)域設(shè)計了6條引物，研制了快速檢測PA感染的LAMP方法，對快速確診PA感染提供了強大的技術(shù)支持。姜莉莉等[16]和韓明明等[17]先后建立了檢測水貂PA外毒素A基因的LAMP檢測方法。LAMP檢測方法適合于基層使用，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

6 討論

PA是一種條件致病菌，廣泛分布于土壤、水、空氣及動物的腸道內(nèi)和皮膚上，可引起多種動物發(fā)病，機體抵抗力降低時，可能引起感染[18]，是一種人獸共患性傳染病原。近年來，由PA引起的動物疫病越來越多。該菌對毛皮動物，如水貂、狐貍和貉等，危害嚴重。水貂養(yǎng)殖密集的山東和遼寧等省份時有養(yǎng)殖場出現(xiàn)大規(guī)模水貂出血性肺炎的報道，給水貂養(yǎng)殖戶造成了嚴重經(jīng)濟損失。臨床證明，該菌對大多數(shù)防腐劑和抗菌藥物表現(xiàn)為天然或獲得性多重耐藥，可供選擇的有效抗菌藥物很少，嚴重困擾著本病的有效治療，因此本病重在預(yù)防。PA有12個血清型，市售的疫苗主要以滅活疫苗為主，只能用于預(yù)防疫苗中包含的血清型菌株，尚未開發(fā)出能保護所有血清型的疫苗。

由于血清型十分復(fù)雜，在對PA進行鑒定時，不能僅僅滿足于細菌形態(tài)和凝集試驗等常規(guī)診斷結(jié)果，特別是在提出新的血清型時，更要慎之又慎，需要綜合考慮多種診斷手段的結(jié)果，多進行比較。通過細菌培養(yǎng)特性、生化試驗和凝集試驗等進行細菌鑒定，操作簡單，對試驗技能和試驗條件要求也不高，可以快速地做出初步判斷。PCR和LAMP檢測方法特異性很高，且十分方便、快速。隨著對PA的分子生物學和免疫原性等方面的深入研究，希望建立更多快速、有效的檢測方法，以便為臨床診治和免疫預(yù)防提供科學依據(jù)。

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Research Progress on Detection Methods of Mink Pseudomonas aeruginosa

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Wang Yumao，Yang Limei，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600，China）

Mink hemorrhagic pneumonia is an important infectious disease，which is harm to mink industry. In order to recognize the development of laboratory detection methods，the isolation and culture of bacteria，biochemical tests，specific antigen and antibody detection，PCR technology and LAMP technology were introduced from aspects of etiology and molecular biology. The advantages and disadvantages of various methods and practicability were compared，which could provide a reference for the rapid，simple，accurate and practical diagnosis for the clinical veterinary scientists and technicians.

Mink hemorrhagic pneumonia；Pseudomonas aeruginosa；PCR；LAMP

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系特種經(jīng)濟動物創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-21-15）

S855.1

B

1005-944X（2018）01-0070-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.020

杜憲）