ELISA方法在豬瘟抗原抗體檢測上的應(yīng)用

莊金秋，梅建國，張 穎，王 艷，李 峰

（1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2. 濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東濱州 256600）

ELISA方法在豬瘟抗原抗體檢測上的應(yīng)用

莊金秋1，2，梅建國1，2，張 穎1，王 艷1，李 峰1

（1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2. 濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東濱州 256600）

本文總結(jié)了豬瘟抗原檢測，包括雙抗體夾心ELISA、競爭ELISA、抗原捕獲ELISA和NASBAELISA，以及豬瘟抗體檢測方法，包括間接ELISA、競爭ELISA、液相阻斷ELISA和斑點ELISA方面的研究進展。

豬瘟；ELISA；間接ELISA；抗體檢測

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。豬瘟抗體檢測是免疫效果評價的主要手段。目前，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的豬瘟抗體檢測方法是酶聯(lián)免疫吸 附 試 驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和熒光抗體中和試驗（Fluorescent antibody virus neutralization test，F(xiàn)VNT）。由于FVNT對試驗條件和操作人員的要求很高，且耗時長，僅適用于專業(yè)實驗室進行少量樣本檢測，不宜推廣應(yīng)用。因此ELISA方法是目前國際上認可的唯一適合大規(guī)模應(yīng)用的血清學(xué)檢測方法，既可用于測定豬瘟抗體，又可用于測定豬瘟抗原。本文綜述了近年來ELISA方法在豬瘟抗原抗體檢測應(yīng)用方面的研究進展，以期為臨床獸醫(yī)工作者和廣大養(yǎng)殖場戶更好地診斷和防治豬瘟提供參考。

1 豬瘟抗原檢測

1.1 雙抗體夾心ELISA

雙抗體夾心ELISA是檢測CSFV抗原的常用方法。湯賽冬等[1]用提純的高效價CSFV抗體及兔抗CSFV血清作為包被抗體和酶標記抗體，建立了雙抗體夾心ELISA方法，用于檢測CSFV抗原，經(jīng)與進口單抗ELISA同步檢測45份可疑樣品，發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果符合率達97.7%。秦彤[2]利用兔抗豬瘟IgG、豬抗豬瘟IgG和羊抗兔酶標抗體，建立了雙抗體夾心ELISA。曹興萍等[3]用雙抗夾心ELISA法檢測規(guī)?；i場臨床無異常種豬抗凝全血，共檢測22個豬場，檢測樣品361份，檢出陽性率為2.2%。雙抗體夾心ELISA法在種豬隱性感染、疑似疫情診斷、疫源凈化，以及豬瘟病原、流行病學(xué)調(diào)查與防控等方面均有較強的實用性。

1.2 競爭ELISA

張富強等[4]應(yīng)用c2410篩選噬菌體肽庫獲得與其特異性結(jié)合的噬菌體擬位的基礎(chǔ)上，分析噬菌體擬位的免疫反應(yīng)性，建立依賴c2410和噬菌體擬位的競爭性ELISA，用于診斷和檢測臨床組織樣品中的CSFV抗原，并與國際標準的CSFV抗原捕獲ELISA比較，發(fā)現(xiàn)所建立的競爭性ELISA比抗原捕獲ELISA具有更高的敏感性，可作為CSFV抗原的常規(guī)檢測方法在基層推廣應(yīng)用。

1.3 抗原捕獲ELISA（AC-ELISA）

AC-ELISA是一種特異、敏感、快速、簡便且實用的方法，是檢測CSFV的有效方法。高華峰等[5]應(yīng)用抗原捕獲ELISA方法，分別對現(xiàn)行豬瘟疫苗毒、接種疫苗后產(chǎn)生定型熱的兔脾和不同地區(qū)可疑豬瘟組織樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)AC-ELISA對豬瘟強毒組織樣品的檢測效果良好，但對弱毒并不敏感，因而可用于野毒感染鑒別。陸芹章等[6]制備了豬瘟單克隆抗體，用AC-ELISA檢測CSFV，并用PCR方法作比較，發(fā)現(xiàn)30份豬瘟陰、陽性病料的AC-ELISA試驗結(jié)果與PCR檢測結(jié)果相符。劉建文等[7]將篩選的CSFV特異性單抗1E2、3B7和4B6純化后等量混合后包被酶標板（捕捉抗體），與兔抗CSFV IgG（檢測抗體）聯(lián)合應(yīng)用，建立了CSFV抗原捕獲ELISA方法，發(fā)現(xiàn)與病毒分離和RT-PCR方法符合率分別為86.2%和90.3%。該方法將單抗的特異性和ELISA方法的敏感性有機結(jié)合起來，能夠短時間內(nèi)準確、快速、直接檢測大批量樣品中的CSFV抗原，明顯優(yōu)于病毒分離和免疫熒光等方法，更適合于各級獸醫(yī)研究機構(gòu)和生產(chǎn)單位應(yīng)用。

1.4 依賴核酸序列的擴增技術(shù)（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）

NASBA是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的1項擴增RNA的新技術(shù)，是由1對引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的體外特異核苷酸序列等溫擴增的酶促反應(yīng)過程。聶福平等[8]以CSFV E2基因為研究對象，將NASBA技術(shù)與液相雜交和ELISA相結(jié)合，建立了NASBA-ELISA檢測方法，應(yīng)用該法對采自重慶市部分地區(qū)豬場的125份樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)CSFV陽性檢出率為5.6%，與RT-PCR法的檢出符合率為94.4%，檢測靈敏度是RT-PCR的100倍。本方法的建立為CSFV的檢測提供了一種快速特異的方法。

2 豬瘟抗體檢測

2.1 間接ELISA

間接ELISA是目前檢測CSFV抗體最常用的方法。由于靈敏性高、技術(shù)比較成熟、試劑盒已商品化、質(zhì)量較穩(wěn)定和操作快捷等優(yōu)點，在我國基層和實驗室得到全面推廣。

2.1.1基于CSFV全病毒的豬瘟抗體間接ELISA 劉勝江[9]、于漣等[10]和陳春旺等[11]先后用純化CSFV及豬瘟兔化弱毒乳兔組織凍干疫苗為原料，提取CSFV抗原，以酶標葡萄球菌蛋白A（PPA）代替酶標抗豬IgG，建立了間接PPA-ELISA法，其反應(yīng)能被豬瘟純化抗原或疫苗培養(yǎng)液所抑制。杜偉賢等[12]用豬瘟兔化弱毒犢牛睪丸細胞苗為材料提取CSFV抗原，以羊抗豬IgG-HRP結(jié)合物為免疫試劑，建立了間接ELISA法，也取得了預(yù)期效果。

2.1.2基于E2蛋白的豬瘟抗體間接ELISA 在CSFV結(jié)構(gòu)蛋白中，囊膜蛋白E2是CSFV中免疫功能最重要的蛋白，攜帶有能刺激機體產(chǎn)生保護性免疫的抗原決定簇，可誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生保護性的中和抗體，是近年來研制新型疫苗和血清學(xué)診斷抗原以及研究CSFV抗原變異的主要對象。余興龍等[13]、王海震等[14]、尹雙輝等[15]、謝金文等[16]、李文良等[17]、蘇佰通[18]、馮春花等[19]、劉麗婭等[20]和藺輝星等[21]先后以大腸桿菌表達純化后的重組E2蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法。李嬌等[22]以純化的CSFV重組E2蛋白為包被抗原，以辣根過氧化物酶標記葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA）為酶標二抗，研制了檢測CSFV抗體的間接PPA-ELISA診斷試劑盒，發(fā)現(xiàn)其具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性。何艷[23]、孫元等[24]和徐璐等[25]先后將昆蟲桿狀病毒表達的重組E2蛋白純化后作為ELISA包被抗原，建立了基于重組E2蛋白的間接ELISA方法。李文良等[26]以大腸桿菌表達純化后的重組E2蛋白作為抗原，建立了檢測IgM抗體的間接ELISA方法。基于E2蛋白的豬瘟抗體間接ELISA方法操作簡便、快速、敏感性高且特異性強，為CSFV的快速診斷、疫苗免疫豬群抗體監(jiān)測、疫苗效果評價和CSFV流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、簡便的血清學(xué)檢測方法，適合基層獸醫(yī)單位廣泛推廣應(yīng)用。

2.1.3基于E0蛋白的豬瘟抗體間接ELISA 糖蛋白E0是CSFV包膜蛋白與核酸酶，也是病毒吸附進入敏感細胞的必需蛋白，其活性對病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染有直接關(guān)系，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的保護性抗原之一。目前研究的CSFV基因工程疫苗主要以E2蛋白為抗原，基于CSFV E0蛋白建立相應(yīng)的抗體檢測技術(shù)對監(jiān)測豬瘟的流行情況、區(qū)分E2標記疫苗免疫豬和野毒感染豬具有重要意義。陳振海等[27]、賈洪林等[28]、李鵬等[29]和吳素麗等[30]先后以大腸桿菌表達的CSFV重組E0蛋白經(jīng)純化后作為包被抗原，建立了檢測豬瘟抗體的E0-ELISA方法。劉芳冰[31]利用畢赤酵母表達CSFV E0蛋白，建立了間接ELISA。E0-ELISA方法簡便、特異、穩(wěn)定，在標記疫苗的研制和應(yīng)用上具有重要的血清學(xué)鑒別功能，對于監(jiān)測CSFV的流行情況和疫苗免疫情況及制定免疫程序具有重要作用。

2.1.4基于NS3蛋白的豬瘟抗體間接ELISA NS3蛋白是CSFV的非結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒復(fù)制增殖必需蛋白，是病毒引起細胞病變作用的主要因子，在動物體內(nèi)能產(chǎn)生不同程度的抗體。以NS3蛋白為抗原建立間接ELISA可以作為CSFV的血清學(xué)鑒別診斷方法。蔣大良等[32]和陸欣然等[33]先后以大腸桿菌表達的CSFV重組NS3蛋白純化后作為包被抗原，建立了檢測豬瘟NS3抗體的間接ELISA方法。該檢測方法與IDEXX公司檢測試劑盒具有較高的一致性?；贜S3蛋白的豬瘟抗體間接ELISA方法可以區(qū)分全病毒（包括疫苗毒和野毒）和重組腺病毒（rAd-E0-E2）感染的豬群，極大促進了CSFV的凈化或根除，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 競爭ELISA

抗體測定一般不使用競爭法，但當抗原中雜質(zhì)難以去除或抗原的結(jié)合特異性不穩(wěn)定時，可采用該法測定抗體。梁冰冰[34]用重組桿狀病毒表達的CSFV重組E2蛋白作為ELISA包被抗原，用辣根過氧化物酶標記的E2蛋白中和性單克隆抗體作為競爭抗體，建立了用于檢測CSFV中和抗體的重組E2蛋白競爭抑制ELISA方法（Competitive inhibition ELISA，CI-ELISA），用于檢測CSFV中和抗體。用該法和阻斷ELISA試劑盒方法同時對采自部分省份的370份現(xiàn)地血清進行CI-ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)二者的符合率為96.7%。張新成等[35]選擇3個場共12頭母豬，在產(chǎn)前136～140 d進行豬瘟兔化弱毒（細胞苗）疫苗接種（4 mL/頭），通過競爭ELISA檢測其所產(chǎn)仔豬在7、14、21、28、35和42日齡時血清中抗體水平，監(jiān)測了母源抗體在仔豬體內(nèi)的消長規(guī)律，探索了仔豬豬瘟疫苗最佳首免日齡。

2.3 液相阻斷ELISA

劉勝宇等[36]利用液相阻斷ELISA法測E2蛋白產(chǎn)生的抗體。因其與中和抗體具有高度的正相關(guān)性，在一定區(qū)間內(nèi)可以用阻斷率高低來估測豬群保護性抗體水平。蔣卉等[37]通過比較14種國內(nèi)外豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒的符合率，發(fā)現(xiàn)6種阻斷ELISA試劑盒的符合率均可達到100.0%，在敏感性和特異性上整體優(yōu)于另外8種間接ELISA試劑盒。

2.4 斑點ELISA（Dot-ELISA）

Dot-ELISA不僅保留了常規(guī)ELISA的優(yōu)點，而且彌補了抗原或抗體對載體包被不牢等缺點，具有敏感性高、特異性強、被檢樣品用量少、節(jié)省材料、不需特殊儀器、結(jié)果判定簡單易行和便于長期保存等特點。李勇等[38]、陳永鋒等[39]和鄧何生等[40]先后應(yīng)用Dot-ELISA方法對豬瘟抗體水平進行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)Dot-ELISA適用于規(guī)?；i場豬瘟抗體水平的監(jiān)測。

3 討論

我國現(xiàn)階段豬瘟呈現(xiàn)出區(qū)域性、散發(fā)性流行，其臨床癥狀不典型，容易產(chǎn)生溫和型和非典型豬瘟共存、持續(xù)和隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存，以及母豬繁殖障礙等，使該病防治成為一大難題，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重危害。目前豬瘟ELISA抗體診斷試劑盒種類較多，在實際應(yīng)用過程中均具有合理性。徐璐等[41]認為在我國豬瘟疫苗強制免疫的政策下，選擇間接ELISA抗體試劑盒更適合我國實際情況。間接ELISA更側(cè)重于敏感性，液相阻斷ELISA使用了單克隆抗體，檢測的特異性更高。在進行ELISA檢測方法評價時，一定要尋找敏感性和特異性最佳的平衡點和結(jié)合點。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用，ELISA方法將更為簡便、實用和標準化，成為能夠被廣泛應(yīng)用的抗體檢測方法。

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Application of ELISA Methods in Detection of Antigen and Antibody of Classical Swine Fever

Zhuang Jinqiu1，2，Mei Jianguo1，2，Zhang Ying1，Wang Yan1，Li Feng1

（1. Binzhou Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Binzhou，Shandong 256600，China；2. Binzhou Baer Carrey Biotechnology Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256600，China）

In this paper，the progress of Classical swine fever（CSF）antigen detection methods was summarized，including DAS-ELISA，competitive ELISA，AC-ELISA and NASBA-ELISA. Meanwhile，the progress of detection method of CSF antibody was also introduced，including indirect ELISA，competitive ELISA，liquid phase blocking ELISA and Dot-ELISA.

Classical swine fever；ELISA；indirect ELISA；antibody detection

山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-08-17）

S852.65

B

1005-944X（2018）01-0065-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.019

杜憲）