豬δ冠狀病毒病原學特征及檢測技術研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰

（1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2. 濱州貝爾凱瑞生物技術有限公司，山東濱州 256600）

豬δ冠狀病毒病原學特征及檢測技術研究進展

莊金秋1，2，梅建國1，2，張 穎1，楊麗梅1，李 峰1

（1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2. 濱州貝爾凱瑞生物技術有限公司，山東濱州 256600）

豬δ冠狀病毒是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種能夠引起豬只嚴重水樣腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬死亡的豬腸道冠狀病毒。該病的傳播給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經濟損失。為了解該病毒的研究進展情況，本文綜述了該病毒的由來、分類、形態(tài)、基因組結構和功能、培養(yǎng)特性和致病性等特性，介紹了其檢測技術的相關研究進展，包括病毒的分離培養(yǎng)、血清學檢測技術，以及分子生物學檢測技術（包括RT-PCR技術和熒光定量RT-PCR技術）等，以期為診斷和防控豬δ冠狀病毒病提供參考。

豬δ冠狀病毒；病原學特征；檢測；RT-PCR

豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種能夠引起豬只嚴重水樣腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬死亡的豬腸道冠狀病毒。該病毒導致的臨床癥狀及病理變化與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等非常相似，臨床上較難區(qū)分，若不加以預防和控制，會給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。本文對PDCoV的發(fā)現(xiàn)、病原學特征、培養(yǎng)特性及檢測技術研究進展等方面進行了綜述，以期為更好地診斷和防控該病提供參考。

1 由來和發(fā)現(xiàn)

PDCoV最早于2012年由香港研究人員在鑒定哺乳動物與禽類的新冠狀病毒時被發(fā)現(xiàn)，于2014年在美國腹瀉仔豬和母豬的糞便中首次被成功檢測并分離，隨后陸續(xù)在加拿大、韓國和泰國等國家被檢出[1]。Dong等[2]對2013—2014年間采自我國湖北、江蘇、廣東、河南和安徽等省份規(guī)模化豬場的258份糞便樣品進行檢測，共檢測到21份陽性樣品，陽性率為14.3%，首次證實PDCoV在我國豬場中存在。

2 分類地位

PDCoV屬于冠狀病毒科δ冠狀病毒屬成員。冠狀病毒科分為α、β、γ和δ 4個冠狀病毒屬。α和β冠狀病毒屬主要由哺乳動物冠狀病毒組成，γ冠狀病毒屬主要包括鳥類冠狀病毒，而δ冠狀病毒屬既包括哺乳動物冠狀病毒，也包括鳥類冠狀病毒[3]。PEDV和TGEV均屬于α冠狀病毒屬。δ冠狀病毒屬最初只在禽類體內被發(fā)現(xiàn)。

3 病原學特征

3.1 形態(tài)特征

PDCoV病毒粒子結構與其他冠狀病毒相似，呈典型的冠狀病毒形態(tài)。電鏡觀察顯示，PDCoV病毒粒子呈球形，直徑約120～180 nm，具有囊膜和纖突。

3.2 基因組結構及功能

PDCoV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組結構與PEDV相似，全長約為25.4 kb，是目前已知冠狀病毒家族中基因組長度最小的病毒。PDCoV具有5′端帽子結構和3′端Poly（A）尾巴，共編碼4種結構蛋白（纖突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N）和4種非結構蛋白[1]。N蛋白是冠狀病毒中一種多功能磷酸化結構蛋白，是冠狀病毒在感染細胞中產生最多的病毒蛋白之一，其結構具有保守性和種屬特異性，可用于建立高效、準確和快速的分子生物學檢測技術。S蛋白是受體結合位點、溶細胞作用和主要抗原位點。E蛋白較小，是負責病毒與包膜結合的蛋白。M蛋白負責營養(yǎng)物質的跨膜運輸、新生病毒出芽釋放與病毒外包膜的形成。

3.3 培養(yǎng)特性

Hu等[4]對PDCoV分離及細胞適應性進行了較為詳細的研究，發(fā)現(xiàn)PDCoV可以在豬睪丸細胞（ST）和豬腎小管上皮細胞（LLC-PK）上生長與傳代，并產生明顯的細胞病變（CPE），表現(xiàn)為細胞變圓和聚集，最后脫落。在病毒分離和培養(yǎng)過程中，需要添加胰酶、胰液素或未感染仔豬的小腸內容物（SIC）。若培養(yǎng)基不加胰酶處理，病毒仍能在LLC-PK細胞上復制和生長，但不會產生CPE，且病毒滴度較低。胰酶或SIC是病毒培養(yǎng)過程中非常重要的因素，可影響病毒與受體結合、病毒進入細胞或者復制的某個階段，從而促進病毒復制以及CPE的產生。這表明PDCoV與PEDV在病毒入侵細胞以及病毒復制過程中有相似的機制。

4 致病性

PDCoV是豬的一種腸道疾病病原。盡管病毒感染仔豬后出現(xiàn)腹瀉和脫水，但其食欲一般不受影響，且體溫保持正常。PDCoV主要感染部位在小腸上皮細胞，剖檢可見小腸上皮損傷和腸絨毛脫落等病變。這與PEDV和TGEV感染仔豬的剖檢變化極為相似。

5 病毒檢測技術

5.1 分離培養(yǎng)

目前，PDCoV的分離培養(yǎng)主要采用LLCPK和ST細胞。陳建飛等[5]對黑龍江省某豬場的PDCoV陽性樣品無菌處理后，接種LLC-PK細胞并連續(xù)傳代培養(yǎng)，成功分離到我國首株PDCoV，并將其命名為NH株。M基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，NH株與美國及韓國的PDCoV親源關系較近。

5.2 血清學檢測技術

5.2.1ELISA Ma等[6]以PDCoV全病毒作為包被抗原，建立了間接ELISA方法。Thachil等[7]建立了以原核表達純化的PDCoV S蛋白為包被抗原的間接ELISA方法。通過對已知210份血清樣本進行PDCoV抗體檢測，得出該法敏感性和特異性分別為90.6%和94.8%。對355份血清樣品進行檢測，陽性率為8.7%。張帆帆等[8]、蘇明俊[9]和逄鳳嬌等[10]先后建立了以原核表達的PDCoV N蛋白作為包被抗原的間接ELISA方法，并應用建立的方法進行了大量血清學檢測，表明我國不同地區(qū)豬群中都存在PDCoV感染，為PDCoV的流行病學調查及防控提供了重要依據。

5.2.2其他血清學方法 Chen等[11]、Hu等[4]和Okda等[12]先后應用間接免疫熒光法（IFA），在PDCoV病毒分離過程中檢測培養(yǎng)細胞中是否存在病毒。Chen等[11]以兔抗PDCoV M、N和S蛋白抗體作為一抗，建立了PDCoV組織免疫化學分析法（IHC），并利用該法分析了PDCoV感染的豬的組織，結果發(fā)現(xiàn)PDCoV主要集中在空腸中段、末端及回腸部位，說明PDCoV對此部位較為敏感，為PDCoV的臨床診斷、組織分布，以及致病機理研究奠定了基礎。Jung等[13]建立的原位雜交（ISH）和免疫熒光染色法，對PDCoV感染豬后在組織中的復制位點進行了測定，發(fā)現(xiàn)PDCoV在豬的整個腸道均可引起急性感染，但病毒最先在空腸和回腸部位復制。Okda等[12]采用建立的ELISA和熒光微球免疫檢測法（FMIA）方法，對PDCoV感染豬的血清抗體動力學進行了初步研究，實驗室感染條件下，2種方法的檢測結果均表明PDCoV血清抗體轉換發(fā)生在感染后8～14 d。

5.3 分子生物學檢測技術

5.3.1RT-PCR技術 目前已建立的PDCoV特異性RT-PCR，都是針對M或N基因保守區(qū)域的。在PDCoV流行初期，Wang等[14]以香港株PDCoV HKU15-155的M和N基因為靶基因，設計了特異性引物，建立了RT-PCR方法，首次確定美國出現(xiàn)了PDCoV。Sinha等[15]采用RT-PCR方法，對來自美國18個州的1 734份樣本進行檢測，證明最晚于2013年8月美國已經出現(xiàn)了PDCoV。逄鳳嬌等[16]根據PDCoV M基因建立的RT-PCR方法的最低檢測限達6.33×104拷貝/μL。鄭麗等[17]根據PDCoV M基因建立了RT-PCR方法，對110份臨床樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為11.8%。張帆帆等[18]根據PDCoV N基因建立了RT-PCR方法，最低能檢測到1.0×103拷貝/μL。陳建飛等[5]根據PDCoV E和M蛋白基因設計引物建立了RTPCR方法，對2014年1月至2015年11月收集的77個豬場的232份臨床腹瀉樣品進行了RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)PDCoV陽性率達10.3%（24/232）。Song等[19]以PDCoV N基因為靶基因建立了巢式RT-PCR方法，對2012年11月至2015年3月在江西采集的356份豬糞便或腸道樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)PDCoV陽性樣品高達33.7%，PDCoV與PEDV共同感染率為19.7%。由于PDCoV與PEDV引起的臨床癥狀極為相似，在普通實驗室很難進行準確診斷，因此建立針對2種病毒的診斷方法是非常必要的。Zhang等[20]在傳統(tǒng)RT-PCR方法的基礎上，以PDCoV和PEDV的M基因為靶基因，建立了一種針對PDCoV和PEDV的雙重RT-PCR，檢出對PEDV的檢測限為7個RNA拷貝，對PDCoV的檢測限為14個RNA拷貝。劉玲玲等[21]根據PDCoV N基因和TGEV N基因序列設計引物建立了能同時檢測PDCoV和TGEV的雙重RT-PCR方法，對252份臨床樣品進行檢測，檢出PDCoV陽性樣品31份，陽性率為12.3%，TGEV陽性樣品12份，陽性率為4.8%，同時感染PDCoV和TGEV的陽性樣品2份，陽性率為0.8%。韓麗等[22]根據PDCoV N基因和PEDV M基因序列設計引物，建立了能同時檢測PDCoV和PEDV的雙重RT-PCR方法，對111份臨床樣品進行檢測，其中PDCoV陽性樣品22份，陽性率為19.8%，PEDV陽性樣品27份，陽性率為24.3%，PDCoV和PEDV共感染的樣品數為10份，陽性率為9.0%。任玉鵬等[23]建立了同時檢測PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法，對222份腹瀉樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV、PDCoV和TGEV的陽性檢出率分別為52.2%、2.7%和2.3%。雙重或多重RT-PCR方法能夠快速、準確地對PDCoV、PEDV和TGEV等單一或混合感染的臨床樣品進行快速檢測，為臨床上豬病毒性腹瀉的鑒別診斷和流行病學調查研究提供了新的技術手段。

5.3.2熒光定量RT-PCR技術 實時熒光定量RTPCR比常規(guī)RT-PCR更具優(yōu)勢，在PDCoV檢測方面也取得了進展。Marthaler等[24]針對PDCoV的ORF1、S1和M基因設計引物并建立了TaqMan熒光定量RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)M基因引物靈敏度高且穩(wěn)定性好。Chen等[11]和Zhang等[20]也先后針對PDCoV的M基因建立了TaqMan熒光定量RTPCR檢測方法。張利衛(wèi)等[25]根據PDCoV M基因序列設計引物，建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法，對198份臨床腹瀉樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率為20.7%（41/198）。Ma等[6]和肖帥等[26]先后根據PDCoV N基因設計引物，建立了PDCoV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。該法能在豬發(fā)病早期或病毒隱性感染時進行確診和實時監(jiān)測，不僅可以應用于PDCoV流行病學調查，也將為PDCoV的定量檢測和快速診斷提供有力的技術手段。

6 小結

PDCoV的傳播給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經濟損失，引起了人們的關注。目前尚無針對PDCoV的商品化疫苗、特效治療藥物或防治方法，人們對PDCoV的認識也較少，與其他引起腹瀉的病毒相比，PDCoV的診斷和檢測工具尚處于起步階段。但隨著人們對PDCoV研究的不斷深入，尤其是對其致病機制和免疫機理的深入了解，相信PDCoV疫苗和更加簡便、有效的檢測技術會相繼發(fā)展和成熟，以控制該病的發(fā)生與流行。

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Research Progress on the Pathogenic Characteristics and Detection Techniques of the Porcine Deltacoronavirus

Zhuang Jinqiu1，2，Mei Jianguo1，2，Zhang Ying1，Yang Limei1，Li Feng1

（1. Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600，China；2. Binzhou Bio-carrier Biotechnology Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256600，China）

Porcine deltacoronavirus（PDCoV）is a newly discovered porcine enteric coronavirus in recent years，which is capable of causing severe watery diarrhea，vomiting，dehydration and death of newborn piglets. Its spread of the disease has brought serious economic losses to the swine industry. In order to understand the latest progress of this virus，the origin，classification，morphology，genome structure and function，culture and pathogenicity，were analyzed. Then the progress research on detection technology were also summarized，such as isolation and culture，serological detection techniques，and molecular biological detection techniques（including RT-PCR technology and fluorescence quantitative RT-PCR Technology），hoping to provide a reference for better diagnosis and prevention and treatment of PDCoV.

Porcine deltacoronavirus；pathogenic characteristics；detection；RT-PCR

山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系生豬產業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-08-17）

S852.65

B

1005-944X（2018）01-0061-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.018

杜憲）