歐前胡素通過上調(diào)細胞表面死亡受體5的數(shù)量增強TRAIL對乳腺癌細胞的殺傷活性*

徐正陽， 任瑞平， 萬 鵬， 袁祖國

(寧波市鄞州人民醫(yī)院放化療科， 浙江 寧波 315040)

乳腺癌是在女性群體中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，早期容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，預(yù)后很差，嚴重危害女性健康[1]。在乳腺癌的治療中，手術(shù)治療是目前最有效的治療手段，然而對于中晚期不能進行手術(shù)的病人或在術(shù)后的鞏固治療中，化療或免疫治療是不可缺少的治療手段[2]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族成員。研究表明， TRAIL能選擇性激活腫瘤細胞的凋亡通路而對正常細胞的無明顯影響，因此， TRAIL是一種副作用很小的非常有臨床應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療藥物[3-4]。然而， 某些類型的腫瘤細胞(如乳腺癌細胞)對TRAIL治療的敏感性較低[5]，因此為了提高乳腺癌細胞對TRAIL治療的敏感性，采取一些輔助治療(如輔以中藥活性成分)協(xié)同TRAIL殺傷腫瘤細胞具有十分重要的意義。本研究的目的在于探討中藥活性成分歐前胡素(imperation，IMP)對TRAIL的抗乳腺癌協(xié)同效應(yīng)及分子機制。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞系T-47D和MCF-7購于美國模式培養(yǎng)物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5% CO2。細胞每2～3 d傳代1次，傳代時，用胰酶消化液懸浮細胞， 并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細胞懸液按1∶3稀釋后傳代。

2 實驗試劑

歐前胡素、重組人TRAIL、MTT試劑、二氫乙啶(dihydroe-thidium, DHE)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)和凋亡檢測試劑盒購于Sigma-Aldrich；DMEM培養(yǎng)基購于Gibco；抗死亡受體5(death receptor 5，DR5)、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3和GAPDH抗體購于Cell Signaling；ECL試劑盒購于Pierce；DR5-PE流式細胞抗體購于R&D system；JC-1線粒體膜電位探針染料購于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；DR5 siRNA購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000購于Invitrogen。

3 方法

3.1DR5基因沉默 將DR5 siRNA(終濃度為50 nmol/L)用Lipofectamine 2000按試劑操作說明書步驟進行包裹后，加入到無血清培養(yǎng)基進行混合。將貼壁的T-47D細胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6 h，之后棄去無血清培養(yǎng)基加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

3.2相對細胞活力測定 將T-47D和MCF-7細胞用IMP (10 μmol/L)和不同濃度TRAIL (0～20 μmol/L)處理。實驗分為對照組、歐前胡素組、TRAIL組、歐前胡素+TRAIL組及歐前胡素+TRAIL+DR5 siRNA組。對照組為細胞不加藥物處理48 h；歐前胡素組為細胞加入10 μmol/L歐前胡素處理48 h；TRAIL組為細胞加入2 μg/L TRAIL培養(yǎng)48 h；歐前胡素+TRAIL組為細胞用2 μg/L TRAIL聯(lián)合10 μmol/L歐前胡素處理48 h；歐前胡素+TRAIL+DR5 siRNA組為DR5 siRNA轉(zhuǎn)染的T-47D細胞用2 μg/L TRAIL聯(lián)合10 μmol/L歐前胡素處理48 h。各組細胞經(jīng)藥物處理完畢后加入20 μL 濃度為5 g/L的MTT試劑，并在37 °C恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h， 之后小心棄去細胞上清液并加入150 μL DMSO，振蕩使紫色絮狀物完全溶解，在570 nm波長下用酶標儀檢測吸光度(A)。相對細胞活力=A藥物處理組/A對照組。

3.3Western blot實驗 將T-47D細胞按上述進行分組。藥物處理完畢后用蛋白提取液提取各組細胞中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)用12.5% SDS-PAGE進行分離，分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用抗DR5、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3和GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用ImageJ軟件處理。目標蛋白的相對表達水平用它們的蛋白灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值表示。

3.4T-47D細胞表面DR5表達水平的檢測 將T-47D細胞分為對照組、歐前胡素組和歐前胡素+DR5 siRNA組處理。收集細胞并用帶PE熒光標記的DR5抗體孵育細胞，后用流式細胞術(shù)檢測3組細胞表面DR5的表達情況。

3.5線粒體膜電位的測定 將T-47D細胞按方法 3.2所述進行分組。藥物處理完畢后按試劑操作說明書步驟將細胞用JC-1染料進行孵育，孵育完畢后用流式細胞儀檢測JC-1發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強度越強，線粒體膜電位越高[6]。

3.6活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平的檢測 將T-47D細胞用藥物處理完畢后按試劑操作說明書步驟將細胞用DHE染料進行孵育，孵育完畢后用流式細胞儀檢測DHE發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強度越強，ROS水平越高[7]。

3.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各組細胞經(jīng)藥物處理完畢后按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶和Annexin V加入細胞中孵育20 min，采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin V陽性細胞為凋亡細胞。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 14.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。所有實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。2組間均數(shù)的比較采用 Student’st檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)后行Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 歐前胡素對TRAIL存在協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)

MTT實驗結(jié)果顯示，雖然歐前胡素(10 μmol/L)單獨處理對細胞活力的抑制作用輕微，但其能顯著提高各濃度TRAIL對T-47D細胞和MCF-7的殺傷活性(P<0.05)。表明歐前胡素對TRAIL存在協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)，能顯著增強TRAIL對乳腺癌細胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，見圖1。

Figure 1. Imperatorin enhanced the cytotoxicity of TRAIL to breast cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1歐前胡素增強TRAIL對乳腺癌細胞的殺傷活性

2 歐前胡素通過ROS途徑上調(diào)乳腺癌細胞表面DR5的數(shù)量

Western blot實驗結(jié)果顯示， 歐前胡素能顯著提高T-47D細胞 TRAIL特異性受體DR5的蛋白表達水平，見圖2A； 流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示， 歐前胡素處理能明顯上調(diào)T-47D細胞表面DR5的數(shù)量，然而轉(zhuǎn)染DR5 siRNA沉默DR5基因表達后，歐前胡素處理不能再增加T-47D細胞表面DR5的數(shù)量，見圖2B。另外，歐前胡素處理能明顯誘導(dǎo)T-47D細胞ROS的產(chǎn)生，見圖2C；用ROS清除劑NAC[7]對T-47D細胞進行處理后，歐前胡素對DR5的上調(diào)作用受到明顯抑制，見圖2D，提示歐前胡素能通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生增加T-47D細胞表面DR5的數(shù)量。這可能是歐前胡素發(fā)揮對TRAIL協(xié)同作用的機制。

3 歐前胡素通過上調(diào)T-47D細胞 DR5的表達促進TRAIL誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡

MTT實驗結(jié)果顯示，在T-47D細胞中轉(zhuǎn)染DR5 siRNA后，TRAIL聯(lián)合歐前胡素對T-47D細胞的殺傷活性受到明顯抑制，見圖3A； 流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示， 歐前胡素聯(lián)合處理能顯著提高TRAIL對T-47D細胞線粒體膜電位的損傷，而轉(zhuǎn)染DR5 siRNA能顯著抑制兩者聯(lián)合對T-47D細胞線粒體膜電位的損傷，見圖3B； Western blot實驗結(jié)果顯示， 歐前胡素聯(lián)合處理能顯著提高TRAIL對T-47D細胞caspase-8和caspase-3的活化，而轉(zhuǎn)染DR5 siRNA能顯著抑制兩者聯(lián)合對T-47D細胞caspase-8和caspase-3的活化，見圖3C； 同時，歐前胡素聯(lián)合處理能顯著提高TRAIL對T-47D細胞凋亡的誘導(dǎo)，而轉(zhuǎn)染DR5 siRNA能顯著抑制兩者聯(lián)合誘導(dǎo)的T-47D細胞凋亡的發(fā)生，見圖3D。這些實驗結(jié)果表明歐前胡素通過上調(diào)T-47D細胞中DR5的表達促進TRAIL誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡。

討 論

歐前胡素是從白芷根中提取的香豆素類天然活性物質(zhì)。研究表明， 歐前胡素對一些腫瘤細胞有一定的抑制作用，如歐前胡素能抑制結(jié)腸癌細胞中低氧誘導(dǎo)因子1α 的表達，從而抑制結(jié)腸癌的增殖和血管生成；又如歐前胡素能通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中一些熱休克蛋白的表達，誘導(dǎo)其發(fā)生程序性死亡。另外，歐前胡素還被報道能作為一種增敏劑，在宮頸癌的輔助治療中，歐前胡素能下調(diào)腫瘤細胞中Mcl-1 的表達，提高其對凋亡信號的敏感性，從而增強化療藥物的抗腫瘤活性[8-10]。然而，歐前胡素對免疫治療是否有協(xié)同增效作用，至今仍報道較少。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)歐前胡素能顯著增強TRAIL對乳腺癌細胞系T-47D和MCF-7的殺傷活性，表明歐前胡素與TRAIL存在協(xié)同效應(yīng)，能提高TRAIL的抗乳腺癌活性。

Figure 2. Imperatorin (IMP) upregulated the level of DR5 on the surface of T-47D cells through the ROS pathway. A: IMP upregulated the expression of DR5 in T-47D cells; B: treatment with IMP increased the levels of DR5 on the surface of T-47D cells; C: IMP increased the production of ROS in T-47D cells; D: NAC abolished the effect of IMP on increasing the DR5 expression level in T-47D cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIMP group;△P<0.05vsTRAIL group;&P<0.05vsIMP+TRAIL group.

圖2歐前胡素通過ROS途徑上調(diào)T-47D細胞表面DR5的表達水平

在TRAIL依賴的凋亡信號通路中，TRAIL首先與細胞表面的DR4或DR5結(jié)合形成死亡受體復(fù)合物，該復(fù)合物能募集細胞中的caspase-8并使之發(fā)生活化；活化的caspase-8通過BID途徑使腫瘤細胞的線粒體發(fā)生失能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[11-13]。DR5的表達受細胞中多種刺激因子的調(diào)控，腫瘤細胞中ROS的聚集能誘導(dǎo)細胞DR5的顯著表達[14-15]。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)歐前胡素能顯著誘導(dǎo)乳腺癌細胞中ROS的產(chǎn)生并上調(diào)TRAIL的特異性受體DR5的表達水平，提示歐前胡素能通過ROS途徑上調(diào)乳腺癌細胞表面DR5的數(shù)量，從而對TRAIL發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)用siRNA下調(diào)乳腺癌細胞中DR5的表達后，歐前胡素對TRAIL的協(xié)同效應(yīng)受到明顯抑制，證明歐前胡素是通過增加乳腺癌細胞中DR5的表達水平增強TRAIL依賴的凋亡信號，促使乳腺癌細胞發(fā)生caspase-8的活化，導(dǎo)致細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。

綜上所述，本研究證明了歐前胡素對TRAIL有協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)，其機制可能在于歐前胡素能上調(diào)乳腺癌細胞中DR5的表達水平。這些研究結(jié)果為更有效地將TRAIL應(yīng)用于臨床提供了新的策略和思路。

Figure 3. Imperatorin (IMP) enhanced the mitochondrial apoptosis induced by TRAIL through increasing the expression of DR5. A: transfection withDR5 siRNA inhibited the IMP-promoted cell death induced by TRAIL in T-47D cells; B: transfection withDR5 siRNA inhibited the IMP-promoted damage of mitochondrial membrane potential induced by TRAIL in T-47D cells; C: co-treatment with IMP and TRAIL significantly triggered the activation of caspase-8 and caspase-3 in T-47D cells; D: co-treatment with IMP and TRAIL significantly induced the apoptosis of T-47D cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsTRAIL group;&P<0.05vsIMP+TRAIL group.

圖3歐前胡素通過上調(diào)T-47D細胞中DR5的表達促進TRAIL誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡

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