長鏈非編碼RNA在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)研究*

王 婧， 孫 妍， 廖昆玲， 譚華根， 李遠(yuǎn)奇

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院健康管理中心， 廣東 廣州 510700)

結(jié)腸癌(colon cancer)是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率較高，而且預(yù)后較差。關(guān)于近年來我國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析的大數(shù)據(jù)研究表明，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率近年來均保持上升趨勢，其中結(jié)直腸癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中排名第4位，死亡率位居腫瘤死亡原因第5位[1-2]。近年來的研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)具有調(diào)節(jié)多種生物過程的潛能，它參與表觀遺傳調(diào)控、染色體重塑并可通過多種途徑參與基因表達(dá)調(diào)控等過程[3-6]，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，人類許多疾病與lncRNA的異常表達(dá)有關(guān)，尤其是腫瘤，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)lncRNA存在異常表達(dá)，這也提示了lncRNA可能是潛在的致癌或抑癌基因[7-10]。本研究通過對lncRNAtor數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌lncRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出在結(jié)腸癌中有顯著表達(dá)差異的lncRNA，并在60對結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中驗(yàn)證，從而篩選與結(jié)腸癌相關(guān)的lncRNA，為今后lncRNA在結(jié)腸癌的診斷和治療方面提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 標(biāo)本收集

60例結(jié)腸癌臨床腫瘤標(biāo)本均來源于2012年1月～2016年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的患者，術(shù)前均未行放療或化療，術(shù)后病理檢查證實(shí)為結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織(距離癌變部位邊界>2.0 cm)的液氮凍存標(biāo)本。其中男性 39例，年齡為 (69±10)歲，女性21例，年齡為(62±15)歲。60 例結(jié)腸癌組織病理分型均為腺癌，其中低分化8例、中分化43例、高分化9例。本研究所有標(biāo)本采集均經(jīng)過患者家屬簽署知情同意書，并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會審核通過。

2 主要試劑

總RNA提取試劑(Trizol)購自Invitrogen； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT reagent Kit)和real-time PCR試劑盒(SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit)購自TaKaRa； 其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

3 主要方法

3.1篩選結(jié)腸癌lncRNA差異表達(dá)數(shù)據(jù) 首先登陸lncRNAtor數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://lncrnator.ewha.ac.kr/index.htm)，選擇并下載Colon adenocarcinoma: Person neoplasm cancer status數(shù)據(jù)集，以P<0.01且差異表達(dá)倍數(shù)大于2或小于0.5的條件篩選結(jié)腸癌差異表達(dá)的lncRNA，然后在篩選的lncRNA中分別選擇上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)排在前2位的4個lncRNA做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表1 Real-time PCR引物序列

3.2結(jié)腸癌組織及癌旁組織總RNA的提取 使用Trizol試劑在液氮冷凍狀態(tài)下研磨并提取組織(約100 mg)總RNA，然后用紫外可見分光光度檢測RNA的質(zhì)量和濃度。

3.3Real-time PCR驗(yàn)證lncRNA的表達(dá) 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)將上述提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后參照SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行real-time PCR， 檢測3.1中篩選的4個lncRNA的相對表達(dá)水平。總反應(yīng)體積20.0 μL： SYBR?Premix Ex TaqTMII (2×) 10.0 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，RT 產(chǎn)物(cDNA 溶液) 2.0 μL， RNase-free H2O 6.4 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃逆轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃下反應(yīng)5 s。Real-time PCR反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性30 s； 94 ℃變性5 s， 60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸20 s， 40個循環(huán)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0 對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩獨(dú)立樣本間比較使用t檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例數(shù)(n)和百分比(%)表示，兩獨(dú)立樣本的四格表資料采用卡方檢驗(yàn)，對于理論頻數(shù)小于5的四格表資料使用Fisher精確檢驗(yàn)。受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 結(jié)腸癌差異表達(dá)lncRNA的篩選

在lncRNAtor數(shù)據(jù)庫中選取并下載結(jié)腸癌差異表達(dá)的lncRNA數(shù)據(jù)(Colon adenocarcinoma: Person neoplasm cancer status)，數(shù)據(jù)集包含正常樣本與結(jié)腸癌樣本中差異表達(dá)的基因。然后對該數(shù)據(jù)集以P<0.01的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的lncRNA，結(jié)果篩選出在結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)的lncRNA共50個，其中上調(diào)表達(dá)的lncRNA有28個，下調(diào)表達(dá)的lncRNA有22個，其中“1”代表正常組織樣本共29個，“2”代表結(jié)腸癌組織樣本共36個，見圖1。

Figure 1. Differentially expressed lncRNA heatmap of colon cancer in lncRNAtor.

圖1lncRNAtor中結(jié)腸癌差異表達(dá)的lncRNA熱圖

為了進(jìn)一步篩選出結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中差異表達(dá)的lncRNA，我們篩選出差異表達(dá)倍數(shù)分別排在前十位的lncRNA，見表2。最后我們選擇上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最高的前2個基因(HNF1A-AS1和ZDHHC8P1)及下調(diào)表達(dá)倍數(shù)最高的前2個基因(SUZ12P和AC069513.3)作進(jìn)一步研究。

表2 結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)的lncRNA(前20位)

2 Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果

我們利用real-time PCR定量驗(yàn)證HNF1A-AS1、ZDHHC8P1、SUZ12P和AC069513.3在60例結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織中表達(dá)水平改變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與配對的結(jié)腸癌旁組織相比，HNF1A-AS1和ZDHHC8P1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)是上調(diào)的(P<0.01)；SUZ12P在結(jié)腸癌組織中表達(dá)是下調(diào)的(P<0.05)；AC069513.3在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

3 lncRNA表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)lncRNA在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的相對表達(dá)水平，將60例患者分別分為高表達(dá)和低表達(dá)2組。結(jié)果顯示，HNF1A-AS1的表達(dá)水平與患者性別(男/女)、年齡(<60/≥60)和腫瘤分化程度(高分化/中分化/低分化)無關(guān)，而與結(jié)腸癌患者臨床分期存在顯著相關(guān)性，Ⅰ-Ⅱ期的HNF1A-AS1表達(dá)水平均明顯低于Ⅲ-Ⅳ期(P<0.05)；ZDHHC8P1和SUZ12P的表達(dá)水平與患者性別(男/女)、年齡(<60/≥60)、腫瘤分化程度(高分化/中分化/低分化)和腫瘤分期(TNMⅠ-Ⅱ期/ TNM Ⅲ-Ⅳ期)均無關(guān),見表3。

Figure 2. Expression levels of four lncRNAs in colon cancer tissues and adjacent tissues. Mean±SD.n=60. A: the expression levels of HNF1A-AS1; B: the expression levels of ZDHHC8P1; C: the expression levels of SUZ12P; D: the expression levels of AC069513.3.

圖24個lncRNA在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的相對表達(dá)水平

4 lncRNA與結(jié)腸癌診斷的ROC 曲線分析

采用ROC曲線分析HNF1A-AS1、ZDHHC8P1、SUZ12P和AC069513.3在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌旁組織中診斷的特異性和敏感性。結(jié)果顯示，HNF1A-AS1相對表達(dá)水平的ROC曲線下面積為0.729(95%置信區(qū)間: 0.638～0.820,P<0.01)，敏感性為78%，特異性為67%；ZDHHC8P1相對表達(dá)水平的ROC曲線下面積為0.617(95%置信區(qū)間: 0.514～0.721,P<0.05)， 敏感性為68%，特異性為55%；SUZ12P相對表達(dá)水平的ROC曲線下面積為0.689(95%置信區(qū)間: 0.593～0.786,P<0.01)，敏感性為65%，特異性為55%；AC069513.3相對表達(dá)水平的ROC曲線下面積為0.518(95%置信區(qū)間: 0.413～0.624,P>0.05)，敏感性為52%，特異性為48%，見圖3。這說明HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌旁組織的診斷中均具有一定的特異性和敏感性。

討 論

lncRNA最初被認(rèn)為是不具有功能的RNA片段，后來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用。研究表明，lncRNA的異常表達(dá)存在于很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中?，F(xiàn)有的lncRNA數(shù)據(jù)庫資源越來越豐富，許多研究者用生物信息學(xué)方法分析這些數(shù)據(jù)，尋找腫瘤相關(guān) lncRNA[11-14]。本研究通過在lncRNAtor數(shù)據(jù)庫下載并分析結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)的lncRNA數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)的lncRNA共50個，其中上調(diào)表達(dá)的lncRNA有28個，下調(diào)表達(dá)的lncRNA有22個，這提示它們可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，并可能在其中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。這與先前的一些研究顯示lncRNA的異常表達(dá)存在于很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的結(jié)果是一致的。有研究發(fā)現(xiàn)，MALAT-1的高表達(dá)與非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌和肝癌等腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[15-16]；PCGEM1在前列腺癌細(xì)胞中過量表達(dá)[17]；HOTAIR在乳腺癌患者及肝癌復(fù)發(fā)的和轉(zhuǎn)移的患者中過量表達(dá)[18]。

Figure 3. ROC curve analysis of four lncRNAs in diagnosis of colon cancer.n=60.

圖34個lncRNA與結(jié)腸癌診斷的ROC曲線分析

表3 lncRNA的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的臨床病理特征之間的關(guān)系

*P<0.05vsTNM stage Ⅰ/Ⅱ.

本研究分別選擇了2個差異表達(dá)倍數(shù)較大的上調(diào)表達(dá)lncRNA和下調(diào)表達(dá)lncRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。驗(yàn)證的結(jié)果為HNF1A-AS1和ZDHHC8P1在結(jié)腸癌組織中均上調(diào)表達(dá)，SUZ12P在結(jié)腸癌組織中下調(diào)表達(dá)。通過ROC曲線分析HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌旁組織中診斷的特異性和敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌旁組織的診斷中均具有一定的特異性和敏感性。這提示它們是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的lncRNA，具有作為結(jié)腸癌診斷潛在分子標(biāo)志物的可能性。

本研究也進(jìn)一步分析HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P的表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者的表達(dá)水平與患者性別、年齡和分化程度均無關(guān)，但HNF1A-AS1表達(dá)水平與患者的臨床分期存在顯著相關(guān)性，Ⅰ-Ⅱ期的HNF1A-AS1表達(dá)水平均明顯低于Ⅲ-Ⅳ期，提示HNF1A-AS1表達(dá)水平越高，結(jié)腸癌的惡性程度可能越高。目前已有研究表明，HNF1A-AS1在肝癌、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤和胃癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)[19-21]。如Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1在肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中上調(diào)表達(dá)，過表達(dá)的HNF1A-AS1通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和S期進(jìn)展從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而敲低HNF1A-AS1表達(dá)后能抑制腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和PCNA的表達(dá)，研究表明HNF1A-AS1可能有助于HCC進(jìn)展。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1在骨肉瘤組織中顯著上調(diào)，HNF1A-AS1表達(dá)水平與骨肉瘤患者的臨床分期，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和總生存期降低呈正相關(guān)；敲除HNF1A-AS1可抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移并影響骨肉瘤細(xì)胞中Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的活性，研究說明HNF1A-AS1可能是治療骨肉瘤的潛在靶標(biāo)。于是我們提出大膽設(shè)想，HNF1A-AS1可能通過某種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，或影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，從而參與結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展過程。

綜上所述，我們通過在60對結(jié)腸癌及癌旁組織中驗(yàn)證所篩選的4個lncRNA的差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P的差異表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)意義，且HNF1A-AS1在結(jié)腸癌的表達(dá)差異性更顯著、敏感性更好。研究結(jié)果提示HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P可能在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用，它們有可能成為結(jié)腸癌的分子診斷和基因治療的新靶點(diǎn)。然而本研究只是對結(jié)腸癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況進(jìn)行初步探索和驗(yàn)證，其具體作用機(jī)制有待于下一步實(shí)驗(yàn)研究。

[1] 鄭海倫, 趙 睿, 李大鵬, 等. miR-625-3p在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國病理生理雜志, 2016, 32(8):1376-1382.

[2] Zheng R, Zeng H, Zhang S, et al. National estimates of cancer prevalence in China, 2011[J]. Cancer Lett, 2015, 370(1):33-38.

[3] 武志娟, 鐘金城. 長鏈非編碼RNA的功能與疾病[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2012, 28(3):203-210.

[4] 徐 靜, 徐秋林, 郭曉華. 長鏈非編碼RNA調(diào)控細(xì)胞凋亡及自噬的研究進(jìn)展[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(8):1525-1530.

[5] Guttman M, Rinn JL. Modular regulatory principles of large noncoding RNAs[J]. Nature, 2012, 482(7385): 339-346.

[6] 鄒阮敏, 余 霞, 張文淼, 等. 長鏈非編碼RNA linc-STXBP5-1 在宮頸癌中的表達(dá)及其干預(yù)效應(yīng)分析[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(6):1127-1131, 1137.

[7] 張明嬌, 吳 勇, 李珉珉, 等. 長鏈非編碼RNAs的生物功能及其與器官發(fā)育和惡性腫瘤的關(guān)系[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11):2107-2112.

[8] Yang G, Lu X, Yuan L. LncRNA: A link between RNA and cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1839(11):1097-1109.

[9] 楊翔宇, 余細(xì)勇. 長鏈非編碼RNA對心臟發(fā)育的表觀遺傳學(xué)調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11):2101-2106.

[10] Gibb EA, Brown CJ, Lam WL. The functional role of long non-coding RNA in human careinomas[J]. Mol Cancer, 2011,10:38.

[11] Kim K, Jutooru I, Chadalapaka G, et al. HOTAIR is a negative prognostic factor and exhibits pro-oncogenic acti-vity in pancreatic cancer[J]. Oncogene, 2013, 32(13):1616-1625.

[12] Yang YR, Zang SZ, Zhong CL, et al. Increased expression of the lncRNA PVT1 promotes tumorigenesis in non-small cell lung cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(10): 6929-6935.

[13] 張浩文, 楊禹丞, 魯 志. 非編碼RNA的生物信息學(xué)研究方法：RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測及其應(yīng)用[J]. 生命科學(xué), 2014, 26(3):219-227.

[14] 張婧婧, 吳 偉, 王 鵬, 等. 長鏈非編碼RNA HOTAIR通過調(diào)控PIK3R3促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[J]. 中國病理生理雜志, 2016,32(10):1775-1781.

[15] 楊孜歡, 馮杏芝, 方樂堃, 等. 長鏈非編碼RNA MALAT1調(diào)控Rac1b表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(8):1417-1421.

[16] 黃勁龍, 沈建箴. 長鏈非編碼RNA MALAT-1在腫瘤中的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國腫瘤臨床, 2016, 43(4):161-165.

[17] Bernard D, Prasanth KV, Tripathi V, et al. A long nu-clear-retained non-coding RNA regulates synaptogenesis by modulating gene expression[J]. EMBO J, 2010, 29(18): 3082-3093.

[18] Tufarelli C, Stanleyj A, Garrick D, et al. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylati on as a novel cause of human genetic disease[J]. Nat Genet, 2003, 34(2):157-165.

[19] Wang C, Mou L, Chai HX, et al. Long non-coding RNA HNF1A-AS1 promotes hepatocellular carcinoma cell proli-feration by repressing NKD1 and P21 expression[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 89:926-932.

[20] Dang Y, Lan F, Ouyang X, et al. Expression and clinical significance of long non-coding RNA HNF1A-AS1 in human gastric cancer[J]. World J Surg Oncol, 2015, 13:302.

[21] Zhao H, Hou W, Tao J, et al. Upregulation of lncRNA HNF1A-AS1 promotes cell proliferation and metastasis in osteosarcoma through activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(8): 3503-3512.