運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練激活中樞ACE2-Ang(1-7)-MAS軸延緩高血壓進(jìn)展*

趙曉霖， 彭雯雯， 劉國(guó)英， 洪 玲， 李明余， 潘燕霞

(福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院康復(fù)治療學(xué)系， 福建 福州 350004)

高血壓前期(prehypertension)是指血壓處于120～139/80～90 mmHg的特定階段，又稱正常高值血壓。目前我國(guó)高血壓前期患病率為33.6%[1]。高血壓前期發(fā)展成高血壓和發(fā)生心血管病的風(fēng)險(xiǎn)是正常血壓的2倍[2]。因此，應(yīng)當(dāng)在高血壓前期進(jìn)行積極干預(yù)，減少高血壓和心血管病的患病率。從高血壓前期進(jìn)展到高血壓的機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)(如自主神經(jīng)、動(dòng)脈壓力反射和中樞神經(jīng)系統(tǒng))和體液調(diào)節(jié)(如腎素-血管緊張素系統(tǒng))[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，有高血壓家族史但血壓尚正常的年輕人，其血壓調(diào)節(jié)功能開始減弱，動(dòng)脈壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity,BRS)就已降低[4]。高血壓前期患者動(dòng)脈壓力反射功能也低于正常血壓人群[5]。這些研究提示動(dòng)脈壓力反射能力減退可能是高血壓前期進(jìn)展到高血壓的重要機(jī)制。壓力反射功能減弱主要發(fā)生在壓力感受器和反射中樞。高血壓前期壓力感受器功能尚未改變時(shí)，壓力反射功能減弱主要與反射中樞異常有關(guān)。

以往研究表明，壓力反射中樞腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)激活和血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)升高是壓力反射功能降低的關(guān)鍵機(jī)制[6]。壓力反射中樞主要分布在延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla，RVLM)、孤束核(nucleus tract solitarius，NTS)和下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)。近年研究發(fā)現(xiàn)，高血壓時(shí)，RVLM中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2) 降低，而過(guò)表達(dá)ACE2能降低高血壓[7]。ACE2主要作用是降解AngⅡ生成Ang(1-7)， Ang(1-7) 與其受體 MAS結(jié)合，對(duì)抗AngⅡ作用[8]。新近發(fā)現(xiàn)，高血壓時(shí)RVLM和NTS腦區(qū)ACE2和MAS受體水平降低，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增強(qiáng)ACE2和MAS受體在RVLM中表達(dá)并增強(qiáng)NTS腦區(qū)MAS受體表達(dá)[9]。 Agarwal等[10]報(bào)道，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練降壓與上調(diào)高血壓大鼠RVLM及PVN腦區(qū)ACE2和MAS受體表達(dá)相關(guān)。這些研究結(jié)果提示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增強(qiáng)腦內(nèi)ACE2-Ang(1-7)-MAS軸功能可能是運(yùn)動(dòng)降壓的重要機(jī)制。但是，ACE2功能軸是否影響動(dòng)脈壓力反射目前尚不清楚，高血壓前期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)高血壓進(jìn)展和中樞血壓調(diào)節(jié)的影響也鮮有報(bào)道。本研究旨在探討高血壓前期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)高血壓進(jìn)程、血壓調(diào)節(jié)以及中樞ACE2和MAS受體的影響，通過(guò)腦內(nèi)給予Ang(1-7)及其拮抗劑，探討ACE2-Ang(1-7)-MAS軸在延緩高血壓進(jìn)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要儀器和試劑

FT-200動(dòng)物跑臺(tái)、BL-420s機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和BP-300無(wú)創(chuàng)血壓儀(成都泰盟科技有限公司)；68003單臂數(shù)字式腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；7500 PCR儀(ABI)；NanoDrop 2000核酸定量分析儀(Thermo)；垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。苯腎上腺素和Ang(1-7)(MCE)；A779(Genway)；SYBR試劑盒和PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；β-actin、ACE2和MAS引物由上海生工公司合成；兔多克隆抗ACE2抗體(Santa Cruz)；兔多克隆抗MAS抗體(Alomone Labs)；兔多克隆抗GAPDH抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research)；ECL發(fā)光液(GenView)。

2 方法

2.1動(dòng)物及分組 5周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)和正常血壓Wistar Kyoto(WKY)大鼠各20只均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001。將SHR和WKY大鼠分別隨機(jī)分成安靜(sedentary， Sed)組和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(exercise training, ExT)組(WKY+Sed、WKY+ExT、SHR+Sed和SHR+ExT組)，每組10只。飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.2運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 5周齡大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境 1 周，測(cè)量基礎(chǔ)血壓。6周齡運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠開始跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的有氧運(yùn)動(dòng)方案[11]，運(yùn)動(dòng)組大鼠跑臺(tái)訓(xùn)練 60 min/d，18～20 m/min，每周訓(xùn)練5 d，共 20周。

2.3無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定 采用尾套法測(cè)定清醒狀態(tài)下大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)，2 周測(cè)量1次。

2.4動(dòng)脈壓力反射功能評(píng)估 運(yùn)動(dòng)結(jié)束后24 h～48 h，用氨基甲酸乙酯(800 mg/kg)和α-氯醛糖(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。股靜脈插管用于給藥，頸動(dòng)脈插管記錄血壓和平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。靜脈注射苯腎上腺素(phenylephrine，PE；8 μg/kg)，引起血壓升高和反射性心率減慢，記錄注藥前后平均動(dòng)脈壓變化(ΔMAP)和心率變化(ΔHR)，術(shù)畢穩(wěn)定30 min，檢測(cè)壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity，BRS)以評(píng)估動(dòng)脈壓力反射功能，每組6只。BRS=ΔHR/ΔMAP[12]。

2.5側(cè)腦室微量注射 為了明確運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否通過(guò)Ang(1-7)影響動(dòng)脈壓力反射功能，在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后，于側(cè)腦室分別注射MAS受體激動(dòng)劑Ang(1-7)和拮抗劑A779，記錄給藥前后BRS變化，每組6只。側(cè)腦室注射點(diǎn)在前囟后0.8 mm，中線旁開1.4 mm，顱骨表面深3.8 mm。將微量注射器固定在三維操縱器上，側(cè)腦室給藥前，向側(cè)腦室注射生理鹽水(1 μL，3 min)作為對(duì)照，隨后靜脈注射PE，測(cè)定BRS。間隔20～30 min，然后側(cè)腦室緩慢注射MAS受體激動(dòng)劑Ang (1-7)(4×10-7mol/L)和阻斷劑A779(5×10-7mol/L)，給藥體積10 μL，注射時(shí)間3～4 min，給藥結(jié)束后立即測(cè)定BRS。Ang(1-7)和A779給藥間隔30 min。

2.6Real-time PCR檢測(cè)ACE2和MAS的mRNA表達(dá) 根據(jù)大鼠腦圖譜進(jìn)行定位[13]，取各組大鼠RVLM、NTS和PVN組織各100 mg，每組4只。Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-time PCR 采用SYBR Green 染料法，反應(yīng)總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 s、60℃ 34 s，共45個(gè)循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。引物見表1。

表1 Real-time PCR反應(yīng)的引物序列

2.7Western blot檢測(cè)ACE2和MAS的蛋白表達(dá) 取RVLM、NTS和PVN組織約50 mg，加入RIPA 裂解液(含PMSF和蛋白酶抑制劑)， 制成10%勻漿液，4 ℃ 12 000×g離心20 min，取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。每泳道上樣總蛋白50 μg，SDS-PAGE(12%分離膠、5%濃縮膠)后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用麗春紅染色，依相對(duì)分子質(zhì)量大小切取條帶，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。洗膜后分別加入 I 抗 [ACE2(1∶1 000)和MAS(1∶2 000)]4 ℃過(guò)夜。次日洗膜后分別加入相應(yīng)的ACE2 II 抗(1∶1 000)和MAS II 抗 (1∶3 000)，室溫下孵育2 h。洗膜后加入ECL 顯影，用凝膠成像儀掃描保存圖像。Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行條帶密度測(cè)定，以GAPDH作為內(nèi)參照，目的蛋白/GAPDH條帶密度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，BRS比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析，側(cè)腦室注藥前后BRS變化采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)高血壓進(jìn)展的影響

運(yùn)動(dòng)前SHR和WKY大鼠間 SBP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。增齡過(guò)程中SHR+Sed組SBP逐漸升高，8周齡達(dá)(146.6±4.5)mmHg，同周齡SHR+ExT組SBP為(135.9±6.2)mmHg, 尚未進(jìn)展為高血壓。SHR+ExT組10周齡進(jìn)展為高血壓，SBP達(dá)(148.2±8.1)mmHg，但顯著低于同齡SHR+Sed組(P<0.05)。隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，SHR+ExT組SBP升高幅度明顯小于SHR+Sed組，20周運(yùn)動(dòng)結(jié)束時(shí)， SHR+ExT組SBP比SHR+Sed組明顯降低(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練也降低WKY大鼠SBP，20周運(yùn)動(dòng)結(jié)束時(shí)， WKY+ExT組SBP亦明顯低于WKY+Sed組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The effects of 20 weeks exercise training on hypertension progression in SHR and WKY rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsWKY+Sed group;#P<0.05,##P<0.01vsSHR+Sed group.

圖120周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠高血壓進(jìn)展的影響

2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)動(dòng)脈壓力反射功能的影響

20周運(yùn)動(dòng)結(jié)束，SHR+Sed組的BRS明顯低于WKY+Sed組[(0.7 ± 0.1)vs(1.9 ± 0.1)；P<0.01]，但SHR+ExT組的BRS明顯高于SHR+Sed組[(1.6±0.1)vs(0.7 ± 0.1)；P<0.01]。WKY+ExT組的BRS與WKY+Sed組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)壓力反射中樞ACE2和MAS mRNA及蛋白表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示， SHR+Sed組ACE2和 MAS的mRNA表達(dá)在RVLM、NTS和PVN等部位均明顯低于WKY+Sed組(P<0.05)；與SHR+Sed組相比，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著增強(qiáng)SHR ACE2和MAS的mRNA表達(dá)(P<0.05)；運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)WKY大鼠ACE2和MAS的mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響，見表2。

表2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)壓力反射中樞ACE2和MAS mRNA表達(dá)的影響

*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

Western blot結(jié)果顯示， SHR+Sed組RVLM、NTS和PVN等部位ACE2和MAS的蛋白表達(dá)水平均明顯低于WKY+Sed組(P<0.05)；運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著增強(qiáng)SHR這3個(gè)部位的ACE2蛋白表達(dá)，使SHR+ExT組ACE2蛋白水平正?；?；在NTS和PVN，SHR+ExT組的MAS蛋白表達(dá)不僅高于SHR+Sed組(P<0.01)，也高于WKY+Sed組(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)WKY大鼠這3個(gè)部分ACE2和MAS蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，見圖2～4。

Figure 2. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in RVLM. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

圖220周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)RVLM中ACE2和MAS蛋白表達(dá)的影響

4 側(cè)腦室微量注射Ang(1-7)和A779對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善壓力反射功能的影響

SHR+ExT組大鼠側(cè)腦室注射A779后，對(duì)基礎(chǔ)血壓無(wú)明顯影響，但給藥后BRS較注藥前明顯降低(P<0.01)，抵消了運(yùn)動(dòng)改善SHR大鼠BRS的益處，但對(duì)SHR+Sed組大鼠的BRS無(wú)明顯影響。側(cè)腦室注射Ang(1-7)后可短暫降低SHR+Sed組和SHR+ExT組大鼠基礎(chǔ)血壓5 mmHg左右，與注藥前相比，Ang(1-7)明顯提高SHR+Sed組和SHR+ExT組的BRS(P<0.05)，見表3。

Figure 3. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in NTS. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05，**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

圖320周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)NTS中ACE2和MAS蛋白表達(dá)的影響

Figure 4. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in PVN. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

圖420周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)PVN中ACE2和MAS蛋白表達(dá)的影響

表3Ang(1-7)和A779對(duì)SHRBRS的影響

Table 3. The effects of Ang (1-7) and A779 on BRS in SHR (Mean±SD.n=6)

GroupA779Ang(1-7)Pre-injectionPost-injectionPre-injectionPost-injectionSHR+Sed0.67±0.100.67±0.200.58±0.201.38±0.20**SHR+ExT1.55±0.100.77±0.20**1.24±0.201.82±0.30*

*P<0.05,**P<0.01vspre-injection in the same group.

討 論

1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)高血壓進(jìn)展及血壓調(diào)節(jié)的影響

高血壓前期的治療以改變生活方式為主，有氧運(yùn)動(dòng)是主要治療措施[3]。其他學(xué)者和本課題組前期研究均發(fā)現(xiàn)，適度運(yùn)動(dòng)具有降低血壓、改善壓力反射功能和減少高血壓危險(xiǎn)因素等作用[12，14-15]，但運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)高血壓的預(yù)防作用及其機(jī)制報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)以SHR大鼠為研究對(duì)象，于高血壓前期進(jìn)行中低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)，并持續(xù)20周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能延緩高血壓發(fā)生時(shí)間窗，SHR運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組較SHR安靜組推遲2周進(jìn)入高血壓。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)SHR和WKY大鼠均有降壓作用，對(duì)高血壓大鼠的降壓作用大于正常大鼠，這一結(jié)果提示，始于高血壓前期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練雖然不能阻止高血壓發(fā)生，但明顯推遲高血壓發(fā)生時(shí)間窗，并降低高血壓幅度。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練降壓機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明。動(dòng)脈壓力反射是體內(nèi)重要的血壓調(diào)節(jié)機(jī)制，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練恢復(fù)動(dòng)脈壓力反射功能和改善壓力反射敏感性是運(yùn)動(dòng)降壓的關(guān)鍵機(jī)制[12, 15 ]。這是因?yàn)閯?dòng)脈壓力反射能適時(shí)監(jiān)測(cè)血壓變化，通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制維持動(dòng)脈血壓相對(duì)穩(wěn)定。對(duì)于正常人或高血壓前期人群，壓力反射功能受損增加患高血壓風(fēng)險(xiǎn)。高血壓患者壓力反射功能減弱，血壓變異性增大，發(fā)生心腦血管意外事件風(fēng)險(xiǎn)增加，提示預(yù)后不良[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，始于高血壓前期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練也能增強(qiáng)動(dòng)脈壓力反射功能，提高血壓調(diào)節(jié)作用，這可能是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練延緩高血壓進(jìn)展的機(jī)制之一。

2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)壓力反射中樞ACE2-Ang(1-7)-MAS軸功能的影響

研究表明，腦內(nèi)RAS激活，AngⅡ興奮RVLM、PVN等處前交感神經(jīng)元，一方面交感神經(jīng)傳出活動(dòng)增強(qiáng)，另一方面抑制壓力感受器傳入信號(hào)(感受器傳入信號(hào)抑制RVLM交感神經(jīng)活動(dòng))，升高血壓[5-6]。ACE2主要功能是降解AngⅡ生成Ang(1-7)，后者與MAS受體結(jié)合，構(gòu)成ACE2-Ang(1-7)-MAS軸，以對(duì)抗ACE-AngⅡ-AT1軸作用[8]。本研究觀察到SHR安靜組RVLM、NTS和PVN等處ACE2 mRNA表達(dá)較WKY安靜組降低約40%～60%， ACE2 蛋白表達(dá)也較WKY安靜組降低了35%～43%。 Yamazato等[7]也報(bào)道SHR RVLM處ACE2 mRNA較WKY明顯降低。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著提高SHR ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)，并使之正常化。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不僅上調(diào)心血管中樞ACE2表達(dá)，而且也增強(qiáng)主動(dòng)脈[17]和心臟組織[18]ACE2表達(dá)。對(duì)于MAS受體，SHR安靜組上述3個(gè)部位MAS的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于WKY安靜組，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著上調(diào)SHR MAS的mRNA和蛋白表達(dá)，SHR運(yùn)動(dòng)組這3個(gè)部位的MAS 蛋白表達(dá)較SHR安靜組提高了1.0～1.5倍。Ren等[9]和Agarwal等[10]報(bào)道，高血壓大鼠進(jìn)行12～16周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，不僅降低高血壓，而且增強(qiáng)ACE2和MAS在RVLM、NTS和PVN的表達(dá)， 但沒有觀察對(duì)壓力反射功能的影響。Lopes等[19]報(bào)道， 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合ACE2激動(dòng)劑能改善高血壓大鼠壓力反射功能。因此，其他學(xué)者和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增強(qiáng)腦內(nèi) ACE2和MAS表達(dá)可能是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善高血壓大鼠壓力反射功能的分子機(jī)制。Ang(1-7)是ACE2-Ang(1-7)-MAS軸的樞紐，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能增強(qiáng)心肌組織Ang(1-7)水平[18]。由于本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)腦內(nèi)Ang(1-7)水平，為了解運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)Ang(1-7)影響，采用側(cè)腦室注射Ang(1-7) 拮抗劑A779，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A779抵消了運(yùn)動(dòng)改善SHR BRS的作用，而Ang(1-7)能提高SHR安靜組和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組BRS。這一結(jié)果間接證明Ang (1-7)介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善壓力反射中樞調(diào)節(jié)的作用。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明，始于高血壓前期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練具有降低高血壓、改善動(dòng)脈壓力反射功能及增強(qiáng)中樞ACE2-Ang(1-7)-MAS軸功能等作用，這可能是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練延緩高血壓進(jìn)展的中樞機(jī)制。

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