HLA-B*1502表達與AEDs致敏相關(guān)性的臨床研究

侯蘊祈， 石海琴， 楊紅姬

在中國癲癇發(fā)病人數(shù)近千萬，需要長期服用抗癲癇藥物，包括新舊抗癲癇藥物，臨床上廣泛應用于癲癇、神經(jīng)痛、精神性疾病等方面，大部分為芳香族(aromatic antiepileptic drugs,AEDs)，該類藥物因具有類似的化學結(jié)構(gòu)并均攜帶苯環(huán)，最常見的不良反應是引起皮疹，目前多觀點認為，AEDs在身體經(jīng)酶代謝后與蛋白多肽形成半抗原復合物，誘發(fā)后來的過敏反應[1]。引發(fā)的過敏反應在不同人種、不同民族、地緣遠近地區(qū)中也有所不同。這說明過敏反應可能與基因相關(guān)，有研究顯示中國臺灣和香港地區(qū)癲癇患者應用CBZ引致的SJS、TEN和HLA-B*1502有較強的相關(guān)性[2]。在中國漢族人群中，8%～15%或更多的人可能是HLA-B*1502陽性基因型[3]。目前該基因與所有的AEDs的相關(guān)性尚不確定，需要臨床研究提供進一步的證據(jù)[4]。如能明確HLA-B*1502陽性基因型是AEDs致敏的必要條件，對指導臨床用藥有很大意義，本研究通過對AEDs致敏性和HLA-B*1502關(guān)系進行分析，探尋HLA-B*1502是否可以作為潛在的靶點蛋白，以求為患者預后的判斷提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年1月1日-2017年6月31日我院門診與住院部及廣州醫(yī)科大學附屬二院神經(jīng)科學研究所AEDs致敏性患者75例資料。均為AEDs誘導皮膚不良反應的患者，男性35例，女性40例，診斷為AEDs致敏性，平均年齡為(5.94±1.85)歲。病例隨訪中，最短的隨訪14個月，最長的58個月，中位隨訪時間為45個月，其中單藥致敏組36例，男性18例，女性18例，平均年齡為(5.71±1.96)歲；多藥致敏組39例，男性17例，女性22例，平均年齡為(5.99±1.85)歲；輕型藥疹組40例，男性20例，女性20例，平均年齡為(5.75±1.85)歲；抗癲癇藥物高敏綜合征組35例，男性15例，女性20例，平均年齡為(5.98±1.75)歲；同時納入健康對照組60例，男性31例，女性29例，平均年齡為(5.75±1.79)歲；組間年齡、性別無顯著差異。

1.2 方法 RNA提取及RT-PCR反應：采集入組患者和正常志愿者靜脈血，EDTA抗凝管收集后用德國QIAGEN公司DNA抽提試劑測定DNA純度和濃度，調(diào)至30 μg/ml在-40 ℃保存。順序特異性引物聚合酶鏈反應(sequence spcific primers，PCR-SSP):設(shè)計6對特異性引物(分別為S1、S2、S3、S4/s5、s6)及兩對內(nèi)參引物(C1、C2)。25 μl PCR反應體系：DNA50 ng，dNTPs 200 μmol/L，Taq聚合酶0.05 U/μl,各引物終濃度為1 μmol/L,反應緩沖液終濃度為1×PCP緩沖液。PCR反應：擴增熱循環(huán)：96 ℃預變性60 s,96 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,2 ℃延伸45 s,4個循環(huán)，96 ℃變性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸45 s,21個循環(huán)，96 ℃變性10 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸90 s,9個循環(huán)。 2.0%凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)熒光成像。

1.3 統(tǒng)計學方法 本研究統(tǒng)計學數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，精確概率法、卡方檢驗對計數(shù)資料進行分析，相關(guān)性檢驗通過Pearson相關(guān)分析，數(shù)據(jù)分析以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 AEDs致敏性組織中HLA-B*1502表達 AEDs致敏性組HLA-B*1502表達陽性率顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。分析AEDs致敏性患者病例中HLA-B*1502表達，發(fā)現(xiàn)HLA-B*1502表達在患者年齡、性別等方面無顯著性差異(P>0.05)(見表1)。

2.2 AEDs致敏性組織中HLA-B*1502的表達與致敏藥物的數(shù)量相關(guān)性分析 多藥致敏組HLA-B*1502基因陽性表達高于單藥致敏組；抗癲癇藥物高敏綜合征組HLA-B*1502基因陽性表達高于輕型藥疹組，HLA-B*1502表達水平越高，致敏藥物越多(見表2、圖1)。

表1 患者的血液標本中HLA-B*1502表達情況

與健康對照組比較#P<0.05

表2 AEDs致敏性HLA-B*1502的表達與致敏藥物的數(shù)量、皮膚不良反應的臨床表現(xiàn)的嚴重程度情況

多藥致敏組與單藥致敏組比較#P<0.05；抗癲癇藥高敏綜合征組與輕型藥疹組比較*P<0.05

圖1 HLA-B*1502表達水平與致敏藥物數(shù)量相關(guān)性分析

3 討 論

癲癇是小兒與成人神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一。據(jù)統(tǒng)計全球平均每年每10萬人就有50例新發(fā)病例，總共約有5000萬癲癇患者，其中又以兒童及青少年居多，常常影響患兒的神經(jīng)生理發(fā)育及生活質(zhì)量[5]。目前口服抗癲癇藥物仍是臨床上治療的主要方法，包括新舊抗癲癇藥物，簡稱AED，臨床上廣泛應用于癲癇、神經(jīng)痛、精神性疾病等方面，大部分為AEDs，該類藥物最常見的不良反應是引起皮疹，輕者為斑疹、丘疹或斑丘疹(MPE)，嚴重時甚至出現(xiàn)超敏綜合征(HSS)、史蒂文斯-約翰綜合征(SJS)或中毒性表皮松解壞死(TEN)等，表現(xiàn)為皮膚水泡樣皮疹，皮膚脫落，累及皮膚黏膜、內(nèi)臟軀干及四肢，整體皮膚表面積分離，致死率高達40%[6～8]。臨床常用的芳香族抗癲癇藥物主要包括卡馬西平、奧卡西平、拉莫三嗪、苯妥英鈉、苯巴比妥等，可有新近研究也提示非芳香族抗癲癇藥也可誘導機體高敏反應。雖然由AEDs誘發(fā)的嚴重過敏反應發(fā)病率較低，但是因其嚴重威脅患者的生命和用藥安全，越來越受到相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍W者的重視[9]。

目前認為藥疹的發(fā)生是一種免疫應答反應，目前多觀點認為，AEDs在身體經(jīng)酶代謝后與蛋白多肽形成半抗原復合物，誘發(fā)后來的過敏反應。引發(fā)的過敏反應在不同人種、不同民族、地緣遠近地區(qū)中也有所不同[10]。這說明過敏反應可能與基因相關(guān)，而近年來的研究報道指向AEDs致敏反應與HLA等位基因具相關(guān)性，而且該基因在中國人群中比例較高。HLA是人類基因調(diào)控人體免疫應答特異性及影響個體疾病易感性差異的主要多態(tài)性系統(tǒng)，有研究表明，HLA-B*1502基因與CBZ引起的SJS、TEN密切相關(guān)，且mRNA表達水平顯著高于耐受組[11]。有研究顯示中國臺灣和香港地區(qū)癲癇患者應用CBZ引致的SJS、TEN和HLA-B*1502有較強的相關(guān)性[12]。在中國漢族人群中，8%～15%或更多的人可能是HLA-B*1502陽性基因型。目前該基因與所有的AEDs的相關(guān)性尚不確定，需要臨床研究提供進一步的證據(jù)[13]。目前大陸地區(qū)相關(guān)方面的臨床研究少見報道，且已有報道樣本尚少，佛山地區(qū)尚缺乏相關(guān)地區(qū)的基因篩查及流行病學調(diào)查[14]，本課題就是進一步研究我地區(qū)AEDs引起的過敏反應是否和HLA-B*1502基因相關(guān)，如能明確HLA-B*1502陽性基因型是AEDs致敏的必要條件，對指導臨床用藥有很大意義，可以在長期服藥前進行基因篩查，避免致敏的可能，減少病患的痛苦及減輕不必要的醫(yī)療支出。

在本研究中，我們通過對75例AEDs致敏性組織HLA-B*1502的陽性表達情況，分析致敏藥物的數(shù)量、皮膚不良反應不同與HLA-B*1502基因表達的差異性，結(jié)果顯示，在AEDs致敏組中陽性表達要遠高于陰性表達，差異具有統(tǒng)計學意義，與王蕊艷等[15]研究結(jié)論相似。結(jié)果表明HLA-B*1502表達陽性率增高與AEDs致敏性的發(fā)生可能有密切的關(guān)系。目前國內(nèi)外研究顯示，常見的芳香族類AEDs包括多個種類，芳香族類AEDs的化學結(jié)構(gòu)中均含有芳香環(huán)，氧化代謝產(chǎn)生含有芳香環(huán)的中間產(chǎn)物，在細胞色素P450酶的作用下，該中間產(chǎn)物在環(huán)氧化物羥化酶的作用下生成能溶于水的代謝產(chǎn)物，當肝臟環(huán)氧化物羥化酶缺乏或功能缺陷時，經(jīng)腎臟排出體外，芳香類氧化物大量堆積，進而誘導細胞凋亡，結(jié)合形成大分子物質(zhì)，同時激活特異性T淋巴細胞，誘導皮膚不良反應的發(fā)生，啟動機體免疫反應，因此芳香族類AEDs誘發(fā)皮膚不良反應的發(fā)生率較高[16]。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS) 被越來越多地應用于遺傳異質(zhì)性的研究中，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，遺傳異質(zhì)性與人類白細胞抗原(human leukocytes antigen,HLA)基因密切相關(guān)[17]。已有研究證實了，AEDs致敏導致的皮膚不良反應與HLA-B*1502基因型有關(guān)[18]。既往研究僅分析AEDs所致皮膚不良反應與HLA-B*1502等位基因的相關(guān)性。但并未對比輕型藥疹與重癥藥疹、多藥致敏與單藥致敏之間HLA-B*1502等位基因表達的差異。本研究分析了HLA-B*1502的表達與AEDs致敏性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)且多藥致敏組HLA-B*1502基因陽性表達高于單藥致敏組，抗癲癇藥物高敏綜合征組HLA-B*1502基因陽性表達高于輕型藥疹組，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HLA-B*1502表達越高致敏藥物數(shù)量越多。

本研究未收集HLA-B*1502的表達與AEDs致敏性預后的影響，因此我們將在之后的研究中進一步擴大樣本量，詳細收集AEDs致敏性藥物干預對AEDs致敏性預后的影響，分析HLA-B*1502的表達在藥物治療效果的差異性和耐藥性中的作用。綜上所述，HLA-B*1502在AEDs致敏性的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，HLA-B*1502可能成為AEDs致敏性的治療的新靶點，對AEDs致敏性診斷及預后有重要的價值。

[1]Chung WH,Hung SI,Chen YT.Genetic predisposition of life-threatening antiepileptic-induced skin reactions[J].Expert Opin Drug Saf,2010,9(1):15-21.

[2]Chong KW,Chan DW,Cheung YB,et al.Association of carbamazepine-induced severe cutaneous drug reactions and HLA-B*1502 allele status,and dose and treatment duration in paediatric neurology patients in Singapore[J].Arch Dis Child,2014,99(6):581-584.

[3]Kim SH,Lee KW,Song WJ,et al.Carbamazepine-induced severe cutaneous adverse reactions and HLA genotypes in Koreans[J].Epilepsy Res,2011,97(1-2):190-197.

[4]Kaniwa N,Saito Y,Aihara M,et al.HLA-B*1511 is a risk factor for carbamazepine-induced Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in Japanese patients[J].Epilepsia,2010,51(12):2461-2465.

[5]McCormack M,Alfirevic A,Bourgeois S,et al.HLA-A*3101 and carbamazepine-induced hypersensitivity reactions in Europeans[J].N Engl J Med,2011,364(12):1134-1143.

[6]Ozeki T,Mushiroda T,Yowang A,et al.Genome-wide association study identifies HLA-A*3101 allele as a genetic risk factor for carbamazepine-induced cutaneous adverse drug reactions in Japanese population[J].Hum Mol Genet,2011,20(5):1034-1041.

[7]Wang XQ,Lang SY,Shi XB,et al.Cross-reactivity of skin rashes with current antiepileptic drugs in Chinese population[J].Seizure,2010,19(9):562-566.

[8]Zaccara G,Franciotta D,Perucca E.Idiosyncratic adverse reactions to antiepileptic drugs[J].Epilepsia,2007,48(7):1223-1244.

[9]Hu FY,Wu XT,An DM,et al.Pilot association study of oxcarbazepine-induced mild cutaneous adverse reactions with HLA-B*1502 allele in Chinese Han population[J].Seizure,2011,20(2):160-162.

[10]Shi YW,Min FL,Liu XR,et al.Hla-B alleles and lamotrigine-induced cutaneous adverse drug reactions in the Han Chinese population[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2011,109(1):42-46.

[11]Gogtay NJ,Bavdekar SB,Kshirsagar NA.Anticonvulsant hypersensitivity syndrome:a review[J].Expert Opin Drug Saf,2005,4(3):571-581.

[12]Lee KW,Park MH.New HLA nomenclature (2010) and its clinical application in Koreans[J].Korean J Lab Med,2010,30(3):203-217.

[13]Hung SI,Chung WH,Jee SH,et al.Genetic susceptibility to carbamazepine-induced cutaneous adverse drug reactions[J].Pharmacogenet Genom,2006,16(4):297-306.

[14]Aihara M.Pharmacogenetics of cutaneous adverse drug reactions[J].J Dermatol,2011,38(3):246-254.

[15]王蕊艷,蔡蘭云,付麗琴.抗癲癇藥物皮膚不良反應與HLA-B*1502基因的相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2014,2(34):20-22.

[16]Hung SI,Chung WH,Liu ZS,et al.Common risk allele in aromatic antiepileptic-drug induced Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in Han Chinese[J].Pharmacogenomics,2010,11(3):349-356.

[17]Lee KW,Oh DH,Lee C.Allelic and haplotypic diversity of HLA-A,-B,-C,-DRB1,and -DQB1 genes in the Korean population[J].Tissue Antigens,2005,65(5):437-447.

[18]Lonjou C,Thomas L,Borot N,et al.A marker for Stevens-Johnson syndrome:ethnicity matters[J].Pharmacogenomics J,2006,6(4):265-268.