miR-132調(diào)控神經(jīng)環(huán)路-突觸可塑性與改善卒中后癡呆的機制研究

張雪玲， 王黎明， 陳念東， 杜合賓， 張沈陽， 錢 來， 陳 靜， 王一峰

卒中后癡呆是腦卒中后最常見的心理行為障礙并發(fā)癥，在卒中患者中的發(fā)病率為25%～79%。卒中后癡呆主要表現(xiàn)為腦卒中后的情緒低落和興趣減退，延緩神經(jīng)功能的恢復(fù)，增加死亡率，極大降低了卒中患者的生活質(zhì)量[1]。雖然卒中是卒中后癡呆的直接原因，但其引起卒中后癡呆的具體機制尚未完全清楚，給治療帶來極大的困難。研究卒中后癡呆的發(fā)病機制，尋求早診斷、早預(yù)防、早治療的有效辦法，具有重要的社會和科學(xué)意義。有研究表明，額葉-皮質(zhì)下神經(jīng)環(huán)路損害與卒中后癡呆有關(guān)，但損害的機制尚不清楚，突觸可塑性直接影響神經(jīng)環(huán)路的重塑，從而直接影響認知功能。近年來，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平對突觸可塑性的調(diào)控越來越受到研究者的關(guān)注，有關(guān)miRNA調(diào)控卒中后癡呆相關(guān)的認知神經(jīng)環(huán)路(額葉-皮質(zhì)下神經(jīng)環(huán)路)突觸可塑性研究尚未見報道，miR-132到底調(diào)控何種基因影響卒中后癡呆相關(guān)的額葉-皮質(zhì)下神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性？通過本項研究，期望發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控卒中后癡呆相關(guān)的額葉-皮質(zhì)下神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性的關(guān)鍵基因，為臨床早期診斷尋找分子標志物(biomarkers)以及發(fā)現(xiàn)治療卒中后癡呆新靶點，為臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗步驟 從生物學(xué)水平驗證miR-132參與卒中后癡呆調(diào)控的靶點以及其相關(guān)機制 應(yīng)用水迷宮檢測兩組小鼠的認知能力，共48只大鼠入組：12只大鼠不作任何處理(對照組)，12只大鼠經(jīng)大腦中動脈阻塞+慢性溫和刺激制作卒中后癡呆模型(卒中后癡呆組)，12只大鼠經(jīng)大腦中動脈阻塞+腦室注射agomir-132+慢性溫和刺激(agomir-132組)，12只大鼠經(jīng)大腦中動脈阻塞+腦室注射agomir-NC+慢性溫和刺激(agomir-NC組)。為確定Grin2A是否參與miR-132抗卒中后癡呆作用,實驗將含Grin2A基因的表達質(zhì)粒經(jīng)腦室注入卒中后癡呆大鼠腦內(nèi)。24只大鼠被添加入組：12只大鼠經(jīng)大腦中動脈阻塞+腦室注射AAV9-CMV-Grin2A質(zhì)粒和agomir-132+慢性溫和刺激(agomir-132+Grin2A組);12只大鼠經(jīng)大腦中動脈阻塞+腦室注射空質(zhì)粒和agomir-132+慢性溫和刺激(agomir-132+vector組)。

1.2 實驗方法介紹

1.2.1 Morris水迷宮 從定位航行實驗和空間探索實驗評價各組小鼠的認知功能，檢測指標包括：逃避潛伏期時間、各象限游泳距離、原平臺象限游泳距離與總距離之比等。

1.2.2 腦室注射慢病毒質(zhì)粒 腦室注射方法參考Nishida等的方法。卒中后癡呆模型的建立:所有大鼠在腦室注射慢病毒質(zhì)粒48 h后，采用大腦中動脈阻塞法制作腦缺血再灌注模型。

1.2.3 大鼠行為檢測 曠野試驗：參考Wang等的方法制作敞箱，在安靜的情況下將大鼠放入箱內(nèi)，觀察記錄大鼠穿越的方格數(shù)作為水平活動得分(以大鼠四爪均進入方格為準)，以大鼠直立次數(shù)為垂直活動得分(兩前肢離地一次為準)。每只大鼠測定3次，每次3 min。蔗糖水消耗試驗:禁水禁食20 h后，所有大鼠同時給予1瓶1%濃度的蔗糖水和1瓶清水，計算1 h內(nèi)大鼠蔗糖水的消耗量(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+清水消耗量)×100%。

1.2.4 實時定量PCR監(jiān)測miR-132表達 按Duan等的方法進行PCR測定卒中后癡呆大鼠腦內(nèi)和外周血中的miR-132的表達，步驟如下：總RNA通過Trizol(美國Sigma-Aldrich公司)提取后，使用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金公司)進行cDNA合成。2.5 μl合成的cDNA 1 μl特異性引物(廣州銳博生物科技有限公司)加入Trans Start T SYBR Green qPCR Supermix(北京全式金公司)后進行實時定量PCR測定miR-132水平，PCR儀(美國ABI公司)檢測PCR產(chǎn)物SyBR綠色熒光強度，以小RNA分子U6為內(nèi)參定量產(chǎn)物濃度。

2 實驗結(jié)果

2.1 miR-132改善卒中后癡呆小鼠認知功能(水迷宮實驗) 實驗結(jié)果表明，miR-132減少卒中后癡呆大鼠的行為學(xué)有改善作用(見圖1)。

2.2 過表達Grin2A阻斷miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學(xué)的改善作用 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， agomir-132組的大鼠垂直得分(80±0.31)，水平得分(78±0.28)，均高于模型組(P<0.05)，說明miR-132可改善卒中后癡呆相關(guān)的額葉-皮質(zhì)下神經(jīng)環(huán)路的突觸可塑性，從而改善PSD小鼠認知功能； agomir-132+Grin2A組的大鼠垂直得分(75±0.26)，水平得分為(73±0.39)；而陰性對照(agomir-132+vector)大鼠垂直得分(78±0.18)，水平得分為(76±0.35)，因此，agomir-132+Grin2A組的大鼠垂直得分以及水平得分均明顯低于其陰性對照(agomir-132+vector)和agomir-132組(P<0.05)，說明Grin2A基因的表達可以抑制miR-132調(diào)控突觸可塑性。同時，agomir-132組糖水消耗百分比為(52±0.59)%；agomir132+Grin2A組糖水消耗百分比為(26±0.58)%；其陰性對照組(agomir-132+vector)糖水消耗百分比為(48±0.32)%，因此，agomir-132組糖水消耗百分比高于模型組和陰性對照組(P<0.05)，說明miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學(xué)的改善作用；agomir132+Grin2A組糖水消耗百分比明顯低于其陰性對照組(agomir-132+vector)和agomir-132組(P<0.05)，表明Grin2A參與了miR-132對卒中后癡呆大鼠的治療作用(見表1)。

2.3 結(jié)論 卒中后癡呆的發(fā)病率正受到醫(yī)學(xué)界越來越多的關(guān)注。相關(guān)研究證明腦卒中后癡呆的發(fā)生率與神經(jīng)功能缺損程度具有相關(guān)性。神經(jīng)退行性疾病是一組典型的遲發(fā)的、漸進性的紊亂，能夠?qū)е抡J知和運動障礙。本文通過對大鼠的實驗證明，miR-132通過改善額葉-皮質(zhì)環(huán)路突觸的可塑性改善卒中后大鼠的認知功能，Grin2A可以阻斷miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學(xué)的改善作用。

表1 過表達Grin2A阻斷miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學(xué)的改善作用

組間比較aP<0.05，bP<0.05，abP<0.05

圖1A：miR-132 減少卒中后癡呆大鼠逃避潛伏期；B：miR-132可提高卒中后癡呆大鼠目標象限游泳距離；C：miR-132可提高卒中后癡呆大鼠穿臺次數(shù)；D：miR-132可提高卒中后癡呆大鼠目標象限時間

3 討 論

卒中后癡呆(post-stroke dementia，PSD)是指卒中后發(fā)生的所有癡呆類型，包括血管性癡呆(vascular dementia，VaD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)或其他變性性癡呆以及混合型癡呆。流行病學(xué)調(diào)查顯示，卒中可使癡呆風(fēng)險增高至少2倍；由于研究人群和研究方法的不同，卒中發(fā)病后1 y內(nèi)的癡呆發(fā)生率范圍為7.4%～41.3%不等[2]。長期隨訪研究顯示，PSD可對至少半數(shù)卒中存活者產(chǎn)生影響，可增高卒中病死率和殘疾率，嚴重影響存活時間。PSD的發(fā)病機制涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮毒性、Ca2+超載、免疫抑制、膽堿能系統(tǒng)功能障礙等多種病理生理學(xué)過程[3]。卒中導(dǎo)致關(guān)鍵部位病變，如海馬或腦白質(zhì)病變、微出血等，造成皮質(zhì)-皮質(zhì)下環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能破壞，是PSD發(fā)生的主要解剖學(xué)機制。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，大量神經(jīng)元通過突觸相互聯(lián)系形成神經(jīng)回路。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性突觸主要以谷氨酸為遞質(zhì)，突觸前神經(jīng)元釋放谷氨酸，通過突觸后的谷氨酸受體(AMPA和NMDA兩種亞型)，將突觸前神經(jīng)元的信號傳遞到突觸后神經(jīng)元。谷氨酸與AMPA受體結(jié)合，使突觸后神經(jīng)元去極化，從而產(chǎn)生脈沖發(fā)放,NMDA受體與谷氨酸結(jié)合，將突觸前電信號轉(zhuǎn)變成突觸后神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+信號，啟動一系列生化級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致突觸的可塑性變化[4]。在神經(jīng)元樹突棘上，谷氨酸受體及其偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過各種支架蛋白形成突觸后致密區(qū)(PSD)，它含有幾百種蛋白質(zhì)。這種復(fù)雜而精巧的棘突結(jié)構(gòu)，是接收突觸前信號并進行生化加工的獨立單元。樹突棘能對接收的大量信號進行神經(jīng)計算和整合，并依據(jù)刺激的方式做出反應(yīng)，使突觸的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生相應(yīng)變化，即形成突觸的可塑性。

根據(jù)突觸功能可塑性變化的性質(zhì)不同，它可分為長時程增強(long term potentiation,LTP)和長時程抑制(long term depression,LTD)[5]。它們均能選擇性地修飾行使功能的突觸，使突觸連接增強或減弱，因而能貯存大量信息，被認為是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)。突觸可塑性可分為與傳遞效率有關(guān)的功能可塑性和與信息貯存相關(guān)的樹突棘形態(tài)變化的結(jié)構(gòu)可塑性。突觸不僅能通過對AMPA受體通道的修飾以及AMPA受體插入和遷出突觸來增強或抑制突觸的傳遞效率，而且能通過樹突棘的增大和萎縮以及棘的消失和新棘的形成使傳遞效率發(fā)生變化[6]。突觸可塑性因神經(jīng)細胞種類、發(fā)育階段、激活方式不同而變化，其形成機制復(fù)雜而多樣。由于它可能是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)，長期以來一直都是分子和細胞神經(jīng)生物學(xué)的熱門研究領(lǐng)域之一。

人源miR132定位于染色體17p13.3，富含于腦組織，尤其是在海馬區(qū)高表達。miR132在多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病或者模型動物中表達下調(diào)，包括阿爾茨海默病、胎兒無腦畸形、亨廷頓疾病、精神分類癥和雙相情感障礙、帕金森病，并且miR132還能影響一些突觸相關(guān)蛋白的表達，研究證實體外過表達miR132會引起谷氨酸受體NR2A、NR2B、G1uR1的表達上調(diào)。有報道顯示miR132的生物合成受到CRAB和REST的雙向調(diào)控，并且隨著LTP表達過程中也會平行性的升高。體外實驗表明miR132和BDNF以及Mecp2能夠形成反饋調(diào)節(jié)環(huán)路[7]。

miR132可以通過抑制一種GTP酶活性依賴蛋白p250GAP的表達而誘導(dǎo)皮質(zhì)和海馬區(qū)樹突的外向性生長和改變樹突的形態(tài)，并且體內(nèi)敲除miR132則會導(dǎo)致突觸的減少和抑制新生神經(jīng)元的遷移。最新研究揭示在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中敲除miR132導(dǎo)致FOX03a的表達升高而誘導(dǎo)大量的神經(jīng)元凋亡。另外，選擇性在小鼠邊緣皮質(zhì)過表達miR132會引起LTP和LTD的降低而導(dǎo)致短期記憶損傷。miR132：由于參與了眾多的神經(jīng)生理和病理過程而被稱為“NeurimmiR”，以上的研究結(jié)果也說明miR132涉及到了突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的過程，但是具體的分子機制現(xiàn)在還不清楚。探索miRl32調(diào)控神經(jīng)環(huán)路-突觸可塑性對于一些神經(jīng)退行性疾病的理解和治療非常有意義。

卒中后癡呆是腦血管病后最常見的心理行為障礙并發(fā)癥，其發(fā)病機制目前尚未明確。目前研究表明，micro RNA與神經(jīng)發(fā)生和突觸形成有關(guān)，可能在精神疾病中扮演至關(guān)重要的作用[8，9]。各種干細胞中均存在特異性的miRNA，并且在干細胞的不同分化階段亦有特異性miRNA表達，它們是保持干細胞自我更新和多向分化特性的關(guān)鍵分子之一;在細胞的不同發(fā)育階段，miRNA的組成不同，決定了細胞的分化方向以及分化時相，是細胞定時、定向分化的開關(guān)[10]。miR-132基因在所有物種中有相同的結(jié)構(gòu)，在大鼠、小鼠和人中2個基因均呈串聯(lián)排列，分別位于10、11和17號染色體上，稱為miR-132基因簇。根據(jù)miRNA編碼基因在基因組中的位置分為基因間miRNAs和基因內(nèi)miRNAs。在人的基因組中，miR-132基因簇位于染色體17p13.3，含有3個外顯子基因(AK006051)的第1個內(nèi)含子內(nèi)，為基因內(nèi)miRNA。miR-132 可調(diào)控多個蛋白。文獻報道[11 ]，miR-132抑制p250GAP的翻譯過程，調(diào)節(jié)Rac1或 RhoA來調(diào)控突觸棘的形態(tài)學(xué)發(fā)生發(fā)展。在新生的大鼠海馬中，miR132呈低表達，但是在出生后 7～21 d，其表達量增高，與突觸發(fā)生的活躍期相關(guān)。在海馬神經(jīng)元中，抑制miR-132可以減弱突觸棘發(fā)生的活性以及突觸棘的大小，而過表達miR-132可以加強此作用。且miR-132/p250GAP可通過調(diào)節(jié)突觸特異性的kalirin7/Rac1/Pak信號途徑來調(diào)控Rac1的活性和突觸棘發(fā)生。另外還有研究表明，BDNF誘導(dǎo)的miR-132表達可以上調(diào)突觸上的谷氨酸受體，調(diào)控突觸的結(jié)構(gòu)和功能[12 ]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-132減少卒中后癡呆大鼠逃避潛伏期， miR-132可提高卒中后癡呆大鼠目標象限游泳距離， miR-132可提高卒中后癡呆大鼠穿臺次數(shù)，miR-132可提高卒中后癡呆大鼠目標象限時間。結(jié)果表明，miR-132對減少卒中后癡呆大鼠的行為學(xué)有改善作用；同時，本研究表明agomir-132組的大鼠垂直得分和水平得分均高于模型組(P<0.05)，說明miR-132 可改善卒中后癡呆相關(guān)的額葉-皮質(zhì)下神經(jīng)環(huán)路的突觸可塑性，從而改善卒中后大鼠的認知功能；agomir-132+Grin2A組的大鼠垂直得分以及水平得分均明顯低于其陰性對照(agomir-132+vector)和agomir-132組(P<0.05)，說明Grin2A基因的表達可以抑制miR-132調(diào)控突觸可塑性。agomir-132組糖水消耗百分比高于模型組和陰性對照組(P<0.05)，說明miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學(xué)的改善作用，agomir132+Grin2A組糖水消耗百分比明顯低于其陰性對照組(agomir-132+vector)和agomir-132組(P<0.05)，表明Grin2A參與并抑制了miR-132對卒中后癡呆大鼠的治療作用，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致，說明miR-132通過調(diào)控神經(jīng)環(huán)路-突觸可塑性從而改善卒中后癡呆大鼠的行為學(xué)特征，Grin2A參與并抑制了miR-132對卒中后癡呆大鼠的治療作用，該研究結(jié)果為臨床早期診斷和治療卒中后癡呆提供新的理念和策略。

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