止得咳顆粒質量標準的研究

黃敏 黃國東 韋瑀龍 謝廣源 陸丹萍 吳變美

[摘要] 目的 建立止得咳顆粒的質量標準研究方法。 方法 采用薄層色譜法（TLC）對白前、射干進行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）C18色譜柱測定黃芩苷和次野鳶尾黃素的含量：流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液（49∶51）；流速為1 mL/min；檢測波長為266 nm。 結果 TLC斑點清晰，陰性無干擾。HPLC定量測定中，黃芩苷和次野鳶尾黃素分別在947.1～7577.0 ng（r = 0.9998）、18.03～180.30 ng（r = 0.9999）范圍內線性關系良好，平均加樣回收率分別為100.6%（RSD = 0.4%）、93.1%（RSD = 0.6%）。 結論 該方法簡便、可行、靈敏、準確，可作為止得咳顆粒的質量控制方法。

[關鍵詞] 止得咳顆粒；黃芩苷；次野鳶尾黃素；白前；射干；薄層色譜；高效液相色譜

[中圖分類號] R927.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（c）-0106-05

[Abstract] Objective To establish a study method for the quality standard of Zhideke Granules. Methods Thin layer chromatography （TLC） was used for the qualitative identification of Cynanchum glaucescens and Belamcanda chinensis. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine baicalin and irisflorentin by C18 chromatographic column， the mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid solution （49∶51）， the flow rate was 1 mL/min， the detection wavelength was set at 266 nm. Results The TLC spots were clear and free from negative interference. In HPLC quantitative determination， baicalin and irisflorentin showed good linear relationships within the ranges of 947.1-7577.2 ng （r = 0.9998） and 18.032-180.32 ng （r = 0.9999）， whose average recovery were 100.6% （RSD = 0.4%） and 93.1% （RSD = 0.6%）， respectively. Conclusion The method is simple， feasible， sensitive and accurate， which can be used as the quality control method of Zhideke Granules.

[Key words] Zhideke Granules； Baicalin； Irisflorentin； Cynanchum glaucescens； Belamcanda chinecsis； Thin layer chromatography； High performance liquid chromatography

止得咳顆粒由桔梗[1]、白前[2]、枇杷葉[3]、射干[4]、柴胡[5]、黃芩[6]等10味中藥經科學配伍而成，具有清熱解毒、止咳化痰的功效，臨床上用于感冒發(fā)熱、頭痛、噴嚏、急慢性氣管炎、肺炎咳嗽、喉炎。本品為廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院醫(yī)療機構制劑，其質量控制方法簡單，無鑒別、含測等專屬性強的檢測項目，為了能更好地控制產品質量[7]，本研究參考2015版《中國藥典》各味藥材質量檢測標準[8]、廣東省中藥材標準第一冊[9]及廣西壯族自治區(qū)壯藥質量標準第二卷[10]，基于樣品提取和色譜條件的優(yōu)化，選取白前和射干作為定性鑒別成分，另選取黃芩活性成分黃芩苷、射干活性成分次野鳶尾黃素作為含量測定指標性成分，建立準確性好、專屬性強的質量檢驗方法，用于該品種制劑的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀、十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC-pack ODS-A 250 mm×4.6 mm，5 μm；Spolar C18 250 mm×4.6 mm，5 μm）；AB265-S十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多）；SQ8200HBT超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；AXLC1820超純水機（重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司）；薄層板（青島海洋化工廠）；紫外分析儀（北京賓達英創(chuàng)科技有限公司）。

1.2 樣品與試劑

樣品：止得咳顆粒（廣西匯科藥物研究有限責任公司，批號：170701、170702、170703）；缺黃芩、射干的雙陰性樣品（廣西匯科藥物研究有限責任公司）；對照藥材：白前（批號：121442-200501）、射干（批號：120994-201206）；對照品：射干苷（批號：11632-200602）、黃芩苷（批號：110715-201612）、次野鳶尾黃素（批號：111557-200602），對照品與對照藥材均來自中國食品藥品檢定研究院。試劑：甲醇（色譜純），水（超純水），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜定性鑒別

2.1.1 白前藥材的鑒別

2.1.1.1 白前對照藥材溶液 取白前對照藥材1 g，加水50 mL，加熱回流1 h，放冷，用棉花濾過，取濾液，用氨試液飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水50 mL洗滌，棄去水洗液，正丁醇層蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，制成白前對照藥材溶液。

2.1.1.2 供試品溶液 取本品15 g，研細，加水50 mL使溶解，用氨試液飽和的正丁醇溶液振搖提取2次，每次50 mL，自“2.1.1.1”項下合并正丁醇提取液起，同法制成供試品溶液。

2.1.1.3 鑒別方法 吸取供試品溶液和白前對照藥材溶液各10～15 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（4∶8∶0.05）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖1（封四）。由圖1可知，供試品在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且斑點清晰，分離度與比移值均良好。

2.1.2 射干藥材的鑒別

2.1.2.1 射干苷對照品溶液與射干對照藥材溶液 取射干對照藥材1 g，加水30 mL，超聲提取30 min，濾過，用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，制成射干對照藥材溶液。再取射干苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為射干苷對照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液 取本品8 g，研細，加水30 mL使溶解，自“2.1.2.1”項下合并乙酸乙酯液起，同法配制作為供試品溶液。

2.1.2.3 鑒別方法 吸取供試品溶液和射干對照藥材溶液、射干苷對照品溶液各2～5 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-丁酮-甲醇-冰醋酸（3∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，結果見圖2。由圖2可知，供試品在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且斑點清晰，分離度與比移值均良好。

2.2 HPLC定量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（49∶51）；流速：1 mL/min；檢測波長：266 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液 取止得咳顆粒樣品研磨，取粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇25 mL，稱定重量，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補足減失的重量，搖勻。

2.2.2.2 雙陰性樣品溶液 取缺黃芩與射干的雙陰性樣品，與“2.2.2.1”同法配制。

2.2.2.3 對照品儲備液與對照品溶液 ①黃芩苷對照品儲備液與對照品溶液：取黃芩苷對照品50.38 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容稀釋至刻度，搖勻，作為黃芩苷對照品儲備液；精密量取2 mL，加甲醇定容至10 mL作為黃芩苷對照品溶液。②次野鳶尾黃素對照品儲備液與對照品溶液：取次野鳶尾黃素對照品11.27 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容稀釋至刻度，搖勻，作為次野鳶尾黃素對照品儲備液；精密量取5 mL，加甲醇定容至100 mL，作為次野鳶尾黃素對照品溶液。

2.2.3 專屬性試驗

分別吸取對照品溶液、樣品溶液（批號：170703）及雙陰性樣品溶液各10 μL，依法測定。結果見圖3。結果顯示陰性樣品在主峰出峰位置無吸收峰，提示陰性樣品無干擾，方法專屬性良好。

2.2.4 線性關系考察

分別精密量取黃芩苷對照品儲備液，逐步稀釋成濃度為0.094 71、0.1894、0.3789、0.5683、0.7577 mg/mL的線性系列溶液。精密量取次野鳶尾黃素對照品儲備液，逐步稀釋成濃度為1.803、3.606、4.508、7.213、9.016、18.03 μg/mL的線性系列溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄圖譜。以進樣量C（x，ng）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性擬合，得回歸方程。黃芩苷：y = 1.9750x + 75.5497，r = 0.9998。次野鳶尾黃素：y = 4.2999x - 2.2947，r = 0.9999。結果顯示黃芩苷和次野鳶尾黃素分別在進樣量為947.1～7577.0 ng和18.03～180.30 ng范圍內線性關系良好。

2.2.5 重復性試驗

取止得咳顆粒樣品，按照“2.2.2.1”平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄圖譜，計算黃芩苷、次野鳶尾黃素的含量及相對標準偏差。結果6份供試品溶液黃芩苷平均含量為4.260 mg/g，RSD為0.6%；次野鳶尾黃素平均含量為84.73 μg/g，RSD為1.4%，表明方法重復性良好。

2.2.6 精密度試驗

取黃芩苷對照品溶液、次野鳶尾黃素對照品溶液按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣5次，記錄圖譜。結果兩組分峰面積RSD分別為0.1%和0.3%，表明該儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.5”項下重復性樣1溶液分別于室溫下放置0、4、8、16、24 h時按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果顯示樣品黃芩苷、次野鳶尾黃素峰面積RSD分別為0.6%和2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的止得咳顆粒樣品約1 g，平行稱取6份，黃芩苷對照品儲備液（0.9321 mg/mL）5 mL、次野鳶尾黃素對照品儲備液（0.036 06 mg/mL）2.5 mL，依法測定，記錄圖譜并計算加樣回收率，結果見表1～2。

2.2.9 耐用性試驗

取供試品溶液，分別改變“2.2.1”項下色譜柱品牌（Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC-pack ODS-A 250 mm×4.6 mm，5 μm；Spolar C18 250 mm×4.6 mm，5 μm）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱溫（25℃、30℃、35℃）、波長（261、266、271 nm）、流動相比例甲醇-0.2%磷酸溶液（46∶54、49∶51、54∶46），依法測定。結果顯示在改變色譜柱品牌、流速、柱溫、波長及流動相比例時，樣品測定結果相對標準偏差分別為黃芩苷：0.20%、0.20%、0.78%、0.54%、0.61%；次野鳶尾黃素：0.41%、0.51%、0.65%、0.42%、0.35%。各試驗條件下主峰分離效果良好，黃芩苷主峰理論塔板數均>2000，提示方法耐用性良好。

2.2.10 樣品測定

分別取3個批號的樣品照本方法進行分析測定，結果見表3。

3 討論

3.1 薄層色譜定性鑒別

3.1.1 白前藥材的鑒別

由于《中國藥典》無白前藥材的鑒別方法，同時考慮到本品藥材較多，干擾大。在選擇提取方法的時候考慮用不同濃度的堿液溶解，并用乙酸乙酯多次提取，但最終結果均不如本研究中的提取方法斑點清晰。筆者同時對白前鑒別方法的展開劑也進行了研究：①三氯甲烷-甲醇-水（2∶1∶1.5）下層液[11]；②三氯甲烷-甲醇-水（3.5∶1∶1.5）下層液；③甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5∶6∶3∶1）[12]；結果顯示斑點均不夠圓整，比移值太高，而本研究中收載的展開劑效果好，比移值適中，斑點清晰，重現性好。

3.1.2 射干藥材的鑒別

除本研究中選擇的提取方法，筆者亦選取藥典中射干藥材的鑒別方法研究，但斑點不明顯，同時也比較以下展開系統：①三氯甲烷-丁酮-甲醇（10∶5∶1）[13]；②三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（20∶3∶0.5）[14]；結果顯示①斑點不夠圓整，②特征斑點不明顯，而本研究中收載的展開劑效果好，比移值適中，斑點清晰，重現性好。

3.2 HPLC定量測定研究

3.2.1 定量測定成分的選擇

筆者參考產品中10味藥材的質量標準，在對白前和射干藥材進行定性鑒別的基礎研究上，對比研究枇杷葉、桔梗、柴胡、黃芩、射干等藥材的含量測定的方法，由于處方中中藥成分較多，組分復雜，各組分峰之間難分離，同時考慮各藥材在成品中的功效，選取黃芩中黃芩苷[15]與射干中次野鳶尾黃素[16-17]作為本品質量研究的主成分。

3.2.2 測定波長的選擇

《中國藥典》中“黃芩”與“射干”的“含量測定”項下波長分別為280 nm及266 nm。本方法同時測定黃芩苷和次野鳶尾黃素2種成分，但樣品中黃芩苷響應大，而次野鳶尾黃素響應較低，故選擇266 nm作為本方法的檢測波長。

3.2.3 樣品提取方法的選擇

分別以70%乙醇、乙醇、甲醇、70%甲醇為溶劑采用超聲提取和回流提取的方法對試驗的結果對比研究。結果顯示本方法70%乙醇作為溶劑得到的含量較高，峰型較好，而超聲30 min提取效果與加熱回流1 h結果無明顯差別，但超聲提取省時、操作簡便。而在對超聲時間進行考察時，結果顯示超聲20 min與40 min的結果與30 min無明顯差異，故本法選取超聲30 min作為樣品提取的條件。

3.2.4 流動相比例的選擇

結合《中國藥典》2015版一部中黃芩、射干含量測定的方法及相關文獻資料調整流動相比例[18]，考慮到梯度洗脫時，系統精密度與重復性較等度洗脫差，且梯度洗脫程序平衡時間較長，故本法選擇等度洗脫，同時對不同比例的甲醇-0.2%磷酸溶液進行調整，建立了能同時測定黃芩苷和次野鳶尾黃素的定量分析方法，經過一系列方法學項目驗證試驗[19-20]，表明本方法簡便、分離效果好、準確、重復性好。

綜上所述，本文建立的質量控制方法專屬性強、準確性高、重現性好，能較好地控制產品質量，但配方中桔梗、枇杷葉等藥味還有待建立專屬性強的控制方法，進一步完善止得咳顆粒的質量標準。

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（收稿日期：2018-04-08 本文編輯：張瑜杰）