HPLC法測定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量

何廣吉+吳堅毅

[摘要] 目的 探討高效液相色譜法（HPLC）測定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量。 方法 采用HPLC測定，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱，以甲醇-冰醋酸-水（50∶1∶50）為流動相；流速：1.0 ml/min，檢測波長為278 nm，色譜柱溫度為30℃。理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應≥2500。用該方法測定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量進行分析。 結(jié)果 黃芩苷在278 nm波長，每毫升含50～500 μg溶液范圍檢測峰面積存在非常好的重現(xiàn)性，穩(wěn)定性好，平均回收率為96.02%，相對標準偏差（RSD）=0.29%（n=6）。 結(jié)論 高效液相色譜法檢測黃芩苷含量的方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，可應用于芩霍雙清飲中黃芩苷的定量測定，作為控制藥品質(zhì)量標準加以推廣及應用。

[關鍵詞] 高效液相色譜法；黃芩苷；含量測定

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）07（b）-0010-04

中成藥芩霍雙清飲主要由梔子、黃芩苷、連翹、淡竹葉、甘草以及薄荷油等中藥組成，具有疏風散熱、清熱解毒[1]之功效。原標準收載于原衛(wèi)生部頒布的中藥成方制劑標準第十三冊[2]，收載了理化鑒別以及黃芩的薄層色譜鑒別，無具體含量測定項，不容易控制主成分的含量，使該制劑療效不確切，并為制假、造假提供了便利。本研究主要采用高效液相色譜法（high performance liquid chrotomogrphy，HPLC）[3-6]對黃芩苷的主成分含量進行測定，從而為該成分的準確測定提供一種科學的檢驗依據(jù)。

1 儀器與方法

1.1 儀器

日本島津高效液相色譜儀，型號：LC-2010CHT；島津高效液相色譜紫外-可見光檢測器；島津高效液相色譜工作站；依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱；UPW-20NE超純水純水器；MS205DU電子分析天平等儀器。

1.2 樣品與對照品

供試品：芩霍雙清飲，廣東萬年青制藥有限公司；黃芩苷對照品：中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110715-200514；試劑：色譜甲醇、磷酸、乙醇以及超純水等。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱，以甲醇-冰醋酸-水（50∶1∶50）為流動相；流速：1.0 ml/min，檢測波長為278 nm，色譜柱溫度為30℃，進樣量為10 μl，理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應不低于2500[7]，且陰性無干擾。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取10 ml供試品溶液至錐形瓶中，加入70%乙醇溶液40 ml，先加熱回流3 h使其溶解，再轉(zhuǎn)移至50 ml的容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取黃芩苷對照品約12 mg，至200 ml的容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度（制成每毫升約含60 μg的溶液），作為對照品溶液[3]。

2.4 測定法

分別精密量取對照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。

2.5 樣品測定

分別取對照品、供試品3批依“2.2”制備供試品溶液與“2.3”制備對照品溶液，按照“2.1”色譜條件，“2.4”測定法進樣，測定其峰面積以及計算百分含量并進行比較，平均含量為12.6%，RSD=0.2%（n=3），結(jié)果表明本方法簡便、準確（表1、表2）。

2.6 線性關系考察

精密稱定黃芩苷對照品11.97 mg，按“2.3”項下方法制成濃度為54.85 μg/ml的對照溶液，取上述溶液分別進樣5、10、15、20、25 μl，測定色譜峰面積，以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程Y=1140.7X-3.583，R2=1，結(jié)果表明黃芩苷在0.2992～1.7955 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系（表3、圖1）。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，依“2.2”制備供試品溶液，“2.1”色譜條件，“2.4”測定法分別在0、5、10、15、20、25 h依次進樣，測得其峰面積以及計算百分含量進行比較，RSD=0.30%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（表4）。

2.8 精密度試驗

取依“2.2”制備的同一供試品溶液，依“2.1”色譜條件，“2.4”測定法連續(xù)進樣6次，測定其峰面積以及計算百分含量進行比較（表5）。

2.9 重復性試驗

取同一供試品溶液取樣6份，依“2.2”項下方法分別制備供試品溶液，“2.1”色譜條件，“2.4”測定法測定，測得其峰面積以及計算百分含量進行比較，平均含量為12.7%，RSD=0.12%（n=6），結(jié)果表明本方法重復性良好（圖2，表6）。

2.10 陰性對照試驗

根據(jù)處方比例以及制備工藝，配制成不含有黃芩苷的陰性樣品，按“2.2”供試品溶液的制備方法制備陰性供試品，按“2.1”色譜條件，“2.4”測定法進樣，測定其峰面積以及計算百分含量進行比較，結(jié)果顯示，陰性供試品溶液沒有與黃芩苷對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰（圖3～5）。

2.11 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品（含量為12.74%）10 ml，精密加入按“2.3”對照品溶液的制備方法制備的已知含量的對照品溶液（含量為12.07%）10 ml，依“2.2”供試品溶液的制備方法制備混合溶液，按“2.1”色譜條件，“2.4”測定法測定其峰面積以及計算百分含量進行比較，計算黃芩苷的回收率，平均回收率為96.02%，RSD=0.29%（表7）。

3 討論

據(jù)文獻報道[7-11]，用HPLC法測定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量，方法簡便，結(jié)果準確，可有效控制藥品質(zhì)量，確保療效。因此，筆者測定芩霍雙清飲中主成分黃芩苷的含量方法完全按照《中國藥典》2010年版規(guī)定的HPLC測定[8]。在此色譜條件下，黃芩苷主峰明顯，主峰前、后分離度均>4.0，理論塔板數(shù)均在3000以上，完全達到藥典含量檢測的規(guī)定和要求。在實際的操作過程中，還應注意一些問題，如采用甲醇和70%乙醇溶液兩種溶劑分別對樣品進行超聲提取，結(jié)果顯示，僅用甲醇超聲提取，樣品提取不是很完全，選用70%乙醇溶液先加熱回流3 h，再測定黃芩苷的含量，提取率高 。

黃芩為芩霍雙清飲劑中的主藥之一，黃芩苷為其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清熱解毒的作用[1]。因此選擇對黃芩苷進行含量測定，可以有效控制配方中黃芩的質(zhì)量，進而控制芩霍雙清飲的質(zhì)量。為提高藥品質(zhì)量，確保療效，筆者參考有關文獻[13-15]，采用HPLC法對黃芩中的主要成分黃芩苷進行含量測定。取黃芩苷對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行波長掃描，圖譜中黃芩苷在278 nm波長處有最大吸收，故以278 nm為檢測波長。曾試用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多種品牌的色譜柱，各色譜柱所得待測成分色譜峰峰形好，分離度高，本實驗色譜柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱。

實驗中發(fā)現(xiàn)溶解樣品的溶劑對黃芩苷的峰形有很大影響，若只以甲醇作為溶劑，黃芩苷的色譜峰會出現(xiàn)明顯肩峰，而改用7%乙醇溶液作為溶劑后，肩峰完全消失，峰形明顯改善。此外，在樣品的制備過程中發(fā)現(xiàn)加入甲醇后，樣品會出現(xiàn)較多的絮狀沉淀，易阻止黃芩苷的進一步析出和溶解，使樣品回收率偏低。

綜上所述，高效液相色譜法用于黃芩苷的臨床測定，方法簡便、確切以及重現(xiàn)性較好，可應用于芩霍雙清飲中黃芩苷的含量測定，應加以推廣及應用。

[參考文獻]

[1] 王媛，范全民.HPLC測定清熱解毒口服液中綠原酸與黃芩苷含量[J].中國藥品標準，2011，12（1）：35.

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[9] 劉同祥，王慧森.HPLC法測定復方蒲芩片中黃芩苷的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（3）：225-226.

[10] 付艷敏，李伯軍.HPLC法測定雙黃消炎片中黃芩苷的含量[J].中國藥師，2008，11（6）：654-655.

[11] 左惠芳，張金成，張春成.HPLC法測定雙黃消炎片中黃芩苷的含量[J].西北藥學雜志，2008，23（4）：202-203.

[12] 侯艷寧，朱秀媛，陳桂芳.黃芩苷的抗炎機理[J].藥學學報，2000，35（3）：161.

[13] 梁遠園，馮彪，祝晨蔯，等.HPLC法測定枳實藥材中橙皮苷與柚皮苷的含量[J].中國新藥與臨床藥理，2006， 17（5）：359.

[14] 呂凌，路小東，戴萍萍，等.RP-HPLC測定銀黃咀嚼片中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中成藥，2007，29（6）：921-922.

[15] 劉剛，王海濤，趙淼，等.HPLC 法測定雙黃連口服液中綠原酸和黃芩苷的含量[J].解放軍藥學學報，2007，23（4）：299-301.

（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：林利利）

3 討論

據(jù)文獻報道[7-11]，用HPLC法測定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量，方法簡便，結(jié)果準確，可有效控制藥品質(zhì)量，確保療效。因此，筆者測定芩霍雙清飲中主成分黃芩苷的含量方法完全按照《中國藥典》2010年版規(guī)定的HPLC測定[8]。在此色譜條件下，黃芩苷主峰明顯，主峰前、后分離度均>4.0，理論塔板數(shù)均在3000以上，完全達到藥典含量檢測的規(guī)定和要求。在實際的操作過程中，還應注意一些問題，如采用甲醇和70%乙醇溶液兩種溶劑分別對樣品進行超聲提取，結(jié)果顯示，僅用甲醇超聲提取，樣品提取不是很完全，選用70%乙醇溶液先加熱回流3 h，再測定黃芩苷的含量，提取率高 。

黃芩為芩霍雙清飲劑中的主藥之一，黃芩苷為其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清熱解毒的作用[1]。因此選擇對黃芩苷進行含量測定，可以有效控制配方中黃芩的質(zhì)量，進而控制芩霍雙清飲的質(zhì)量。為提高藥品質(zhì)量，確保療效，筆者參考有關文獻[13-15]，采用HPLC法對黃芩中的主要成分黃芩苷進行含量測定。取黃芩苷對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行波長掃描，圖譜中黃芩苷在278 nm波長處有最大吸收，故以278 nm為檢測波長。曾試用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多種品牌的色譜柱，各色譜柱所得待測成分色譜峰峰形好，分離度高，本實驗色譜柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱。

實驗中發(fā)現(xiàn)溶解樣品的溶劑對黃芩苷的峰形有很大影響，若只以甲醇作為溶劑，黃芩苷的色譜峰會出現(xiàn)明顯肩峰，而改用7%乙醇溶液作為溶劑后，肩峰完全消失，峰形明顯改善。此外，在樣品的制備過程中發(fā)現(xiàn)加入甲醇后，樣品會出現(xiàn)較多的絮狀沉淀，易阻止黃芩苷的進一步析出和溶解，使樣品回收率偏低。

綜上所述，高效液相色譜法用于黃芩苷的臨床測定，方法簡便、確切以及重現(xiàn)性較好，可應用于芩霍雙清飲中黃芩苷的含量測定，應加以推廣及應用。

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[10] 付艷敏，李伯軍.HPLC法測定雙黃消炎片中黃芩苷的含量[J].中國藥師，2008，11（6）：654-655.

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[12] 侯艷寧，朱秀媛，陳桂芳.黃芩苷的抗炎機理[J].藥學學報，2000，35（3）：161.

[13] 梁遠園，馮彪，祝晨蔯，等.HPLC法測定枳實藥材中橙皮苷與柚皮苷的含量[J].中國新藥與臨床藥理，2006， 17（5）：359.

[14] 呂凌，路小東，戴萍萍，等.RP-HPLC測定銀黃咀嚼片中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中成藥，2007，29（6）：921-922.

[15] 劉剛，王海濤，趙淼，等.HPLC 法測定雙黃連口服液中綠原酸和黃芩苷的含量[J].解放軍藥學學報，2007，23（4）：299-301.

（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：林利利）

3 討論

據(jù)文獻報道[7-11]，用HPLC法測定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量，方法簡便，結(jié)果準確，可有效控制藥品質(zhì)量，確保療效。因此，筆者測定芩霍雙清飲中主成分黃芩苷的含量方法完全按照《中國藥典》2010年版規(guī)定的HPLC測定[8]。在此色譜條件下，黃芩苷主峰明顯，主峰前、后分離度均>4.0，理論塔板數(shù)均在3000以上，完全達到藥典含量檢測的規(guī)定和要求。在實際的操作過程中，還應注意一些問題，如采用甲醇和70%乙醇溶液兩種溶劑分別對樣品進行超聲提取，結(jié)果顯示，僅用甲醇超聲提取，樣品提取不是很完全，選用70%乙醇溶液先加熱回流3 h，再測定黃芩苷的含量，提取率高 。

黃芩為芩霍雙清飲劑中的主藥之一，黃芩苷為其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清熱解毒的作用[1]。因此選擇對黃芩苷進行含量測定，可以有效控制配方中黃芩的質(zhì)量，進而控制芩霍雙清飲的質(zhì)量。為提高藥品質(zhì)量，確保療效，筆者參考有關文獻[13-15]，采用HPLC法對黃芩中的主要成分黃芩苷進行含量測定。取黃芩苷對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行波長掃描，圖譜中黃芩苷在278 nm波長處有最大吸收，故以278 nm為檢測波長。曾試用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多種品牌的色譜柱，各色譜柱所得待測成分色譜峰峰形好，分離度高，本實驗色譜柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱。

實驗中發(fā)現(xiàn)溶解樣品的溶劑對黃芩苷的峰形有很大影響，若只以甲醇作為溶劑，黃芩苷的色譜峰會出現(xiàn)明顯肩峰，而改用7%乙醇溶液作為溶劑后，肩峰完全消失，峰形明顯改善。此外，在樣品的制備過程中發(fā)現(xiàn)加入甲醇后，樣品會出現(xiàn)較多的絮狀沉淀，易阻止黃芩苷的進一步析出和溶解，使樣品回收率偏低。

綜上所述，高效液相色譜法用于黃芩苷的臨床測定，方法簡便、確切以及重現(xiàn)性較好，可應用于芩霍雙清飲中黃芩苷的含量測定，應加以推廣及應用。

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[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京.化學工業(yè)出版社，2010：612.

[8] 苗明，李振陶.現(xiàn)代實用中藥質(zhì)量控制技術[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：877-888.

[9] 劉同祥，王慧森.HPLC法測定復方蒲芩片中黃芩苷的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（3）：225-226.

[10] 付艷敏，李伯軍.HPLC法測定雙黃消炎片中黃芩苷的含量[J].中國藥師，2008，11（6）：654-655.

[11] 左惠芳，張金成，張春成.HPLC法測定雙黃消炎片中黃芩苷的含量[J].西北藥學雜志，2008，23（4）：202-203.

[12] 侯艷寧，朱秀媛，陳桂芳.黃芩苷的抗炎機理[J].藥學學報，2000，35（3）：161.

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[14] 呂凌，路小東，戴萍萍，等.RP-HPLC測定銀黃咀嚼片中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中成藥，2007，29（6）：921-922.

[15] 劉剛，王海濤，趙淼，等.HPLC 法測定雙黃連口服液中綠原酸和黃芩苷的含量[J].解放軍藥學學報，2007，23（4）：299-301.

（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：林利利）