茵陳蒿湯聯(lián)合加味大柴胡湯對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠的影響

張北平 翟淑萍 苑偉 顏勇 章小兵 王百林

[摘要] 目的 觀察茵陳蒿湯聯(lián)合加味大柴胡湯對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。 方法 將肝臟缺血再灌注模型大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為缺血再灌注中藥組（TCM組，n = 75）、缺血再灌注對(duì)照組（Control組，n = 75）和假手術(shù)組（Sham組，n = 75）。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法和Western blot法分別檢測(cè)大鼠血清中白細(xì)胞介素-1（IL-1）和肝勻漿組織中細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的含量。 結(jié)果 三組大鼠缺血再灌注后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，血清IL-1含量逐漸升高，在缺血再灌注后相同時(shí)間內(nèi)，TCM組血清IL-1含量均低于Control組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，TCM組及Control組大鼠術(shù)后肝勻漿組織NF-κB及ICAM-1的表達(dá)逐漸增多，且TCM組各時(shí)間點(diǎn)NF-κB和ICAM-1的表達(dá)均低于對(duì)照組（P < 0.05）。結(jié)論 茵陳蒿湯聯(lián)合加味大柴胡湯可明顯減輕大鼠肝缺血再灌注的損傷，其可能是通過抑制NF-κB的激活，減少ICAM-1和IL-1的表達(dá)，從而在肝臟缺血再灌注損傷中起到保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 肝缺血再灌注；白細(xì)胞介素-1；細(xì)胞間黏附分子-1；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

[中圖分類號(hào)] R657.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）10（c）-0015-04

[Abstract] Objective To observe the protective effect of Major Capillaries Decoction and Bubleurum Decoction on liver ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Liver ischemia-reperfusion model rats were randomly divided into ischemia-reperfusion Chinese medicine group （TCM group， n = 75）， ischemia-reperfusion control group （control group， n = 75）， and sham operation group （sham group， n = 75）. The contents of interleukin-1 （IL-1） in serum， intercellular adhesion molecule-1 （ICAM-1） and nuclear factor-kappa B （NF-κB） in rat liver homogenate tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and Western blot. Results After ischemia and reperfusion in three groups， serum IL-1 content gradually increased with the extension of time. In the same time after ischemia-reperfusion， the serum IL-1 content of TCM group was significantly lower than that of the control group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The expression of NF-κB and ICAM-1 in the liver homogenate tissue of TCM group and control group increased gradually with the extension of time， and the expression of TCM group was higher than that of control group at the same time point（P < 0.05）. Conclusion Major Capillaries Decoction and Bubleurum Decoction can significantly alleviate liver ischemia-reperfusion injury in rats. It may be through inhibiting the activation of NF-κB and reducing the expression of ICAM-1 and IL-1 to play a protective role in ischemia-reperfusion injury.

[Key words] Hepatic ischemia-reperfusion； Interleukin-1； Intercellular adhesion molecule-1； Nuclear factor-κB

肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是一種多見于出血性休克、肝臟手術(shù)、肝臟移植術(shù)等過程中的病理生理過程，是引起肝損傷、肝衰竭及肝臟手術(shù)失敗的重要原因[1-2]。在HIRI過程中，由于Kupffer細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化，產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，引起組織炎癥的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重肝臟組織的損傷[3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是一種廣泛存在于細(xì)胞中具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子[4]，可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)[5]。細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）是一種特殊的炎癥介質(zhì)，能增強(qiáng)炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，加重炎性反應(yīng)[6]。

通腑泄熱法是中醫(yī)理論的一種重要方法，我們的前期實(shí)驗(yàn)提示，通腑泄熱法可以通過清除氧自由基，保護(hù)肝細(xì)胞mtDNA的損傷，修復(fù)受損的肝細(xì)胞，加強(qiáng)利膽清熱祛濕，來保護(hù)肝細(xì)胞并修復(fù)受損肝細(xì)胞[7-9]。茵陳蒿湯聯(lián)合加味大柴胡湯是通腑泄熱法的常用方劑，本研究中利用茵陳蒿湯聯(lián)合加味大柴胡湯對(duì)大鼠肝缺血再灌注進(jìn)行預(yù)處理，觀察中藥對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注后炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素-1（IL-1）和ICAM-1、NF-κB的影響，并分析了其保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠225只，雌雄不拘，普通飼料喂養(yǎng)至7周齡，200～300 g/只，SD大鼠和飼料均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：44005900002510）。購(gòu)入后提供充足食材和水，適應(yīng)新環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 儀器與試藥 中藥購(gòu)自廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，具體中藥如下：茵陳20 g、金銀花15 g、柴胡15 g、黃芩10 g、梔子10 g、大黃10 g、延胡索10 g、白芍10 g、桂枝10 g、黃芪15 g、蒲公英10 g、豬苓10 g、澤瀉15 g、芒硝5 g，日1劑，水煎100 mL。離心機(jī)為德國(guó)艾本德離心機(jī)5810R；IL-1α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢華美公司（CSB-E04622r）；ICAM-1抗體購(gòu)自Bioss公司（bs-0608R）；NF-κB抗體購(gòu)自SANTA CRUZ公司（Sc-372）；GAPDH（內(nèi)參）抗體購(gòu)自abcam公司（Ab181602）；Western blot分析系統(tǒng)為杭州朗基科學(xué)儀器有限公司的LG2000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HIRI模型的建立 參照文獻(xiàn)[10]建立大鼠HIRI模型：術(shù)前大鼠禁食12 h，自由進(jìn)水，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥（0.5 mL/100 g）麻醉，麻醉成功后，仰臥固定于操作臺(tái)上，取上腹部正中切口，充分顯露第一肝門部，用無創(chuàng)性微血管夾夾閉第一肝門，以阻斷肝臟的血供，阻斷后可見整個(gè)肝臟顏色逐漸變暗，呈灰暗色缺血改變，胃腸處于瘀血狀態(tài)呈暗紅色。30 min后松開血管夾，進(jìn)入再灌注階段，可見肝臟、胃腸逐漸恢復(fù)鮮紅色，暗紅色變?yōu)轷r紅色說明肝臟再灌注成功，若復(fù)流不暢則終止實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將SD大鼠雌雄不拘，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為缺血再灌注中藥組（TCM組，n = 75）、缺血再灌注實(shí)驗(yàn)組（Control組，n = 75）和假手術(shù)組（Sham組，n = 75）。TCM組：術(shù)前按照5 mL/次中藥劑量，每日2次，予以連續(xù)灌胃3 d，術(shù)中打開腹腔后，顯露第一肝門部并阻斷，30 min后松開血管夾，進(jìn)入再灌注階段；Control組：術(shù)前按照5 mL/次生理鹽水劑量，每日2次，予以連續(xù)灌胃3 d，術(shù)中打開腹腔后，顯露第一肝門部并阻斷，30 min后松開血管夾，進(jìn)入再灌注階段；Sham組：術(shù)前正常飼養(yǎng)3 d，術(shù)中打開腹腔顯露第一肝門部后，不予阻斷肝門。

1.2.3 血液及肝臟組織標(biāo)本的收集 分別于肝缺血再灌注后1、3、6 h采血和肝組織：每只大鼠每次下腔靜脈采血1 mL，然后用超速離心機(jī)（半徑9.5 cm，轉(zhuǎn)速3500 r/min）分離出血清待檢；切取適量肝臟組織（約1 cm×1 cm×1 cm）后放入-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血清中IL-1含量檢測(cè) 運(yùn)用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IL-1的含量，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 肝臟勻漿組織中NF-κB和ICAM-1的蛋白含量檢測(cè) 運(yùn)用Western blot法檢測(cè)肝臟勻漿組織NF-κB和ICAM-1的蛋白含量，操作按說明書進(jìn)行。運(yùn)用數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)陽性表達(dá)，圖譜條帶越暗，陽性產(chǎn)物表達(dá)越多，計(jì)算并比較各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差齊性檢驗(yàn)和方差分析，兩兩比較采用Sidak的t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血清IL-1含量變化比較

在相同缺血再灌注時(shí)間點(diǎn)，TCM組血清IL-1含量均比Control組大鼠低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；隨著肝缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，三組大鼠血清IL-1的含量均逐漸升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 三組大鼠術(shù)后NF-κB和ICAM-1的表達(dá)水平比較

隨著肝缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，TCM組和Control組大鼠肝組織勻漿中NF-κB和ICAM-1的Western blot圖譜條帶越來越暗，且Control組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)NF-κB和ICAM-1的暗度均大于TCM組；Sham組大鼠肝組織勻漿中NF-κB和ICAM-1的Western blot圖譜條帶變化不明顯。見圖1。TCM組各時(shí)間點(diǎn)NF-κB和ICAM-1的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

HIRI機(jī)制目前仍不十分清楚，但其通過推動(dòng)自身放大的炎性反應(yīng)對(duì)肝實(shí)質(zhì)造成損傷已得到公認(rèn)[11]。在HIRI過程中，由于急性炎癥的產(chǎn)生，引起肝細(xì)胞損傷，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡[12]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控炎性反應(yīng)，在細(xì)胞受到某些炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，可激活NF-κB，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)及炎性反應(yīng)[13]。黏附分子是細(xì)胞膜表面糖蛋白，廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞和各種白細(xì)胞表面，它通過與其受體的特異性結(jié)合，使白細(xì)胞、炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用增強(qiáng)，從而參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、免疫應(yīng)答等生理病理過程[14]。NF-κB信號(hào)通路在黏附分子的表達(dá)中起重要作用，通過抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)可減少ICAM-1的表達(dá)[15]。有研究表明，在大鼠的HIRI中，缺血再灌注可顯著增加肝細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)以及促炎細(xì)胞因子IL-1的水平，從而引起肝臟損傷[16]。本研究對(duì)大鼠的HIRI不同研究組IL-1、NF-κB和ICAM-1的含量變化進(jìn)行分析，結(jié)果提示當(dāng)發(fā)生HIRI時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，IL-1和ICAM-1的表達(dá)增加與NF-κB的調(diào)控增強(qiáng)有關(guān)。

中醫(yī)中藥可以通過不同的途徑和機(jī)制減輕HIRI：茵陳蒿湯不僅可以促進(jìn)膽紅素代謝，還可抑制肝細(xì)胞凋亡[17]；加味大柴胡湯能抑制氧自由基產(chǎn)生，起到保護(hù)肝功能作用[18]；另外，加味大柴胡湯具有明顯的抗炎、降酶、降低腫瘤壞死因子作用，也能夠通過減少自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化損傷和線粒體內(nèi)鈣超載，從而起到減輕肝臟損傷的作用[19]。本研究通過通腑泄熱法常用的茵陳蒿湯聯(lián)合加味大柴胡湯加減，對(duì)HIRI大鼠肝組織中的NF-κB、ICAM-1和血清中IL-1含量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，中藥預(yù)處理可下調(diào)HIRI大鼠的NF-κB水平，并降低IL-1和ICAM-1的表達(dá)水平。在HIRI中，NF-κB和炎性反應(yīng)密切相關(guān)，NF-κB的激活可促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的釋放，引起肝臟損傷[20]；而抑制NF-κB途徑可以降低炎性細(xì)胞因子IL-1的表達(dá)[21]。因此，通腑泄熱法對(duì)大鼠HIRI的保護(hù)作用機(jī)制與抑制NF-κB的激活，減少ICAM-1和IL-1的表達(dá)有關(guān)，從而減輕HIRI，起到對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

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