抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚的發(fā)育和成熟萌發(fā)*

許建秀 吳小芹 葉建仁 朱麗華 吳 靜

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037)

赤松(Pinusdensiflora)，主要分布于日本、朝鮮、俄羅斯東南部及我國(guó)東部，可作庭院、造林的樹種，易感染松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)而大量死亡，這對(duì)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重破壞(朱麗華等, 2010)。采用常規(guī)種苗繁殖技術(shù)，繁殖系數(shù)低(張守攻等, 2004)，選育出的抗病材料難以滿足大規(guī)模林業(yè)生產(chǎn)的需求。為了大量快速繁殖已選優(yōu)良抗病基因型，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，對(duì)赤松離體組織培養(yǎng)技術(shù)的研究顯得尤為重要。

體細(xì)胞胚發(fā)生具有繁殖系數(shù)大、周期短、結(jié)構(gòu)完整、再生率高、不受季節(jié)影響等特點(diǎn)(Guptaetal., 1980)，是植物大規(guī)模無(wú)性繁殖的一種主要手段(汪小雄等， 2006； Stasollaetal., 2003)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生成功獲得50多種針葉樹體細(xì)胞胚或體細(xì)胞胚再生植株(孫志強(qiáng)等， 2010)，其中火炬松(Pinustaeda)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)和輻射松(Pinusradiata)等樹種體細(xì)胞胚發(fā)生已經(jīng)應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)(張守攻等， 2004)。Taniguchi(2001)首次對(duì)赤松體細(xì)胞胚發(fā)生進(jìn)行研究，建立了胚性細(xì)胞系并進(jìn)行了體細(xì)胞胚成熟試驗(yàn)，但轉(zhuǎn)化率非常低； 隨后，Maruyama等(2005； 2012)、Shoji等(2006)、Kim等(2014)研究了赤松胚性愈傷組織增殖、體細(xì)胞胚成熟、萌發(fā)及轉(zhuǎn)化的影響因子，但試驗(yàn)結(jié)果存在胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、胚性愈傷組織能力的喪失、體細(xì)胞胚成熟與轉(zhuǎn)化率低等情況。國(guó)內(nèi)目前對(duì)赤松組織培養(yǎng)器官發(fā)生及植株再生有所研究(朱麗華等， 2010； 李清清， 2012)，而對(duì)赤松體細(xì)胞胚發(fā)生的研究報(bào)道較少(吳靜等， 2015)。

完整的體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程包括胚性愈傷組織的形成以及體細(xì)胞胚的形成、發(fā)育和成熟萌發(fā)等階段。為優(yōu)化抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚的形成、發(fā)育及成熟萌發(fā)條件，本試驗(yàn)以抗病赤松的未成熟合子胚誘導(dǎo)形成的胚性愈傷組織為材料，進(jìn)一步研究了外源激素、糖類、滲透劑、凝固劑及培養(yǎng)方式對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟萌發(fā)的影響，旨在對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚發(fā)生體系進(jìn)行優(yōu)化以提高其體細(xì)胞胚的質(zhì)量和數(shù)量，從而提高萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率，為抗病赤松的種質(zhì)資源保存、體胚苗的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗病赤松未成熟球果于2013年6月采集于江蘇句容林場(chǎng)抗松材線蟲病赤松種質(zhì)資源庫(kù)(2004年2月從日本林木良種繁育中心引種建立)，從球果中剝離出未成熟合子胚，在DCR基本培養(yǎng)基(Guptaetal.，1985)上添加2.0 mg·L-12,4-D和1.0 mg·L-16-BA成功誘導(dǎo)出具有胚性的愈傷組織(22#-1和13#-1)，并已繼代培養(yǎng)7次，再經(jīng)過(guò)3次繼代培養(yǎng)，將胚性愈傷組織生長(zhǎng)狀況良好的2個(gè)無(wú)性系22#-1和13#-1作為體細(xì)胞胚發(fā)生的材料(吳靜等， 2015)。

1.2 ABA和PEG8000不同組合對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

以抗病赤松無(wú)性系22#-1胚性愈傷組織為材料進(jìn)行兩因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，A因素脫落酸 (ABA)濃度(10，15，20 mg·L-1)、B因素聚乙二醇 (PEG) 8000濃度(100，140，180 g·L-1)。 將胚性胚柄團(tuán)(embryonic suspensor mass, ESM)轉(zhuǎn)接至不同組合培養(yǎng)基，每處理30塊ESM，重復(fù)3次，實(shí)時(shí)觀察體胚的發(fā)育及成熟情況。培養(yǎng)基附加肌醇8.0 g·L-1、麥芽糖60 g·L-1、2-(N-嗎啡啉) 乙磺酸(MES)250 mg·L-1、水解酪蛋白(CH)500 mg·L-1、維生素C(VC)10 mg·L-1、谷氨酰胺(Glu)450 mg·L-1、活性炭(AC)2.0 g·L-1、植物凝膠 (phytagel)(Sigma公司)3.0 g·L-1，pH5.8。

抗病赤松體細(xì)胞胚誘導(dǎo)、增殖、成熟和萌發(fā)試驗(yàn)在培養(yǎng)溫度設(shè)定為(23±2)℃的組織培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)，每2個(gè)星期觀察1次。正常體細(xì)胞胚數(shù)(每克愈傷組織形成的正常體細(xì)胞胚數(shù)，個(gè)·g-1)=正常體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)/愈傷組織鮮質(zhì)量； 畸形體細(xì)胞胚數(shù)(每克愈傷組織形成的畸形體細(xì)胞胚數(shù)，個(gè)·g-1)=畸形體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)/愈傷組織鮮質(zhì)量； 體細(xì)胞胚數(shù)(每克愈傷組織形成的體細(xì)胞胚數(shù)，個(gè)·g-1)=體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)(包括正常和畸形)/愈傷組織鮮質(zhì)量。

1.3 碳源種類及濃度對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

將22#-1的ESM轉(zhuǎn)接在LP基本培養(yǎng)基(Arnoldetal.， 2010)中，分別添加麥芽糖(20，30，45，60，70 g·L-1)和蔗糖(20，30，45，60，70 g·L-1)，每處理30塊ESM，重復(fù)3次，實(shí)時(shí)觀察體胚的成熟情況。培養(yǎng)基附加ABA 15 mg·L-1、PEG8000 140 g·L-1、肌醇8 g·L-1、MES 250 mg·L-1、CH 500 mg·L-1、VC 10 mg·L-1、Glu 450 mg·L-1、AC 2.0 g·L-1、植物凝膠3.0 g·L-1，pH5.8。體細(xì)胞胚培養(yǎng)及測(cè)定同1.2。

1.4 肌醇濃度對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

將22#-1的ESM轉(zhuǎn)接在LP基本培養(yǎng)基中，添加肌醇0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，16.0 g·L-1，每處理30塊ESM，重復(fù)3次，實(shí)時(shí)觀察體胚的成熟情況。培養(yǎng)基附加ABA 15.0 mg·L-1、PEG8000 140.0 g·L-1、MES 250.0 mg·L-1、CH 500.0 mg·L-1、VC 10.0 mg·L-1、Glu 450.0 mg·L-1、AC 2.0 g·L-1、植物凝膠3.0 g·L-1，pH5.8。體細(xì)胞胚培養(yǎng)及測(cè)定同1.2。

1.5 凝固劑對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

采用2種凝固劑，分別為植物凝膠(phytagel)(Sigma公司)和瓊脂(agar powder)(西隴化工公司)。將22#-1的ESM轉(zhuǎn)接在LP基本培養(yǎng)基，分別添加植物凝膠(2.5，3.0，3.5，4.0 g·L-1)和瓊脂(6.0，8.0，10.0，12.0 g·L-1)， 每處理30塊ESM，重復(fù)3次,實(shí)時(shí)觀察體胚的成熟情況。體細(xì)胞胚培養(yǎng)及測(cè)定同1.2。

1.6 不同培養(yǎng)方式下抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚的發(fā)育和成熟

I.液-固增殖-固成熟： 取胚性細(xì)胞系22#-1和13#-1胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)入10.0 mL不含激素DCR液體培養(yǎng)基中，手持劇烈震蕩形成體細(xì)胞分布均勻且無(wú)塊狀細(xì)胞團(tuán)的懸浮體系(每個(gè)細(xì)胞團(tuán)大約有300萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)，用1.0 mL的移液槍吸取懸浮液，分散在滅菌后的濾紙上，待水分瀝干后，將有培養(yǎng)物的濾紙放入固體增殖培養(yǎng)基，15天之后轉(zhuǎn)入固體成熟培養(yǎng)基。

II.固增殖-固成熟： 直接用鑷子夾取胚性細(xì)胞系22#-1和13#-1的胚性愈傷組織于固體增殖培養(yǎng)基上，15天之后轉(zhuǎn)入固體成熟培養(yǎng)基中。

Ⅲ. 液-固成熟： 取胚性細(xì)胞系22#-1和13#-1胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)入10.0 mL不含激素DCR液體培養(yǎng)基中，手持劇烈震蕩形成體細(xì)胞分布均勻且無(wú)塊狀細(xì)胞團(tuán)的懸浮體系，用1.0 mL的移液槍吸取培養(yǎng)好的懸浮液，均勻分散在滅菌后的濾紙上，待水分瀝干后，將有培養(yǎng)物的濾紙放入固體成熟培養(yǎng)基中。體細(xì)胞胚培養(yǎng)及測(cè)定同1.2。

1.7 抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚的萌發(fā)及植株再生

將體細(xì)胞胚22#-1放置于萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)。萌發(fā)基本培養(yǎng)基為L(zhǎng)P，添加20.0 g·L-1麥芽糖、2.0 g·L-1AC、3.0 g·L-1植物凝膠，pH5.8。非直射光培養(yǎng)5天左右，再放入直射光下培養(yǎng)15天左右，觀察體胚的萌發(fā)狀況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。然后將萌發(fā)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入WPM基本培養(yǎng)基(Pullmanetal.， 2005)，附加0.1 g·L-1肌醇、1.5 mg·L-1IBA、15.0 g·L-1蔗糖、0.2 mg·L-1NAA、7.0 g·L-1卡拉膠(福建省綠麒食品膠體有限公司)，每日光照(1 000 lx)下培養(yǎng)16 h、暗培養(yǎng)8 h，持續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，統(tǒng)計(jì)植株轉(zhuǎn)化率。植株轉(zhuǎn)化率(%)=生根的植株數(shù)/萌發(fā)正常體細(xì)胞胚的個(gè)數(shù)×100%; 萌發(fā)率(%)=萌發(fā)正常體細(xì)胞胚的個(gè)數(shù)/接種體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)×100%。

還有一種，比如說(shuō)同時(shí)期的不同題材的作品來(lái)進(jìn)行對(duì)比。就拿郁達(dá)夫在1927年寫的東西作例子。郁達(dá)夫在1927年有一個(gè)很奇怪的現(xiàn)象，就是他的論文和雜文都是慷慨激昂的，可以舉例如《在方向轉(zhuǎn)換的途中》《公開狀答日本山口君》《無(wú)產(chǎn)階級(jí)專政和無(wú)產(chǎn)階級(jí)文學(xué)》《訴諸日本無(wú)產(chǎn)階級(jí)文藝界同志》。從這四篇論文或雜感來(lái)看，他是慷慨激昂的。甚至有一篇題目叫《無(wú)產(chǎn)階級(jí)專政和無(wú)產(chǎn)階級(jí)文學(xué)》，1927年寫這樣的文章也就很慷慨激昂了，但是在1927年他的小說(shuō)比如《過(guò)去》《迷羊》《清冷的午后》，從這些小說(shuō)來(lái)講，都是很失望的，甚至是絕望的。那么這樣一對(duì)比，將這些資料一排比，我覺得也能夠得出論點(diǎn)。

1.8 抗松材線蟲病赤松再生植株的移栽

待再生植株根伸長(zhǎng)2.0 cm左右后移栽，為使幼苗能更好地適應(yīng)外界的環(huán)境，移栽前7天要逐漸把封口膜揭開，移栽的時(shí)候要把幼苗根部的培養(yǎng)基洗掉，移栽在苗圃土、珍珠巖和河沙構(gòu)成1∶1∶2的基質(zhì)中。移苗1個(gè)月內(nèi)注意保持溫度(23 ℃±2 ℃)、基質(zhì)濕度(85%±2%)和空氣濕度(90%～95%)。4個(gè)月后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。移栽成活率(%)=植株成活的株數(shù)/移栽的株數(shù)×100%。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同ABA和PEG8000組合對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

不同ABA 和PEG8000濃度對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚成熟具有顯著影響(表1)。在 ABA為 15 mg·L-1、PEG 為140 g·L-1的濃度組合下，正常體細(xì)胞胚數(shù)達(dá)到171個(gè)·g-1，均高于其他處理； 當(dāng) ABA濃度為20 mg·L-1時(shí)，正常體細(xì)胞胚數(shù)都偏低(79個(gè)·g-1)。添加適當(dāng)濃度的 ABA 可促進(jìn)體細(xì)胞胚單個(gè)化并進(jìn)一步發(fā)育成熟。PEG在合適的濃度下，促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟。本試驗(yàn)結(jié)果表明 PEG 對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚成熟誘導(dǎo)具有顯著影響。當(dāng) PEG 濃度達(dá)到180 g·L-1時(shí)，正常體細(xì)胞胚數(shù)反而有所下降，可見 PEG 的使用并非濃度越高正常體細(xì)胞胚數(shù)就越多，它們之間并不存在正相關(guān)。試驗(yàn)表明，ABA濃度為15 mg·L-1和PEG8000 140 g·L-1的組合最適宜抗松材線蟲病赤松的體細(xì)胞胚成熟。

表1不同ABA和PEG8000濃度對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響①
Tab.1EffectofABAandPEG8000withvariousconcentrationsonsomaticembryosinnematode-resistantPinusdensiflora

ABA/(mg·L-1)PEG8000/(g·L-1)體細(xì)胞胚數(shù)Numberofsomaticembryos/(embryo·g-1)正常體細(xì)胞胚數(shù)Numberofnormalsomaticembryos/(embryo·g-1)畸形體細(xì)胞胚數(shù)Numberofabnormalsomaticembryos/(embryo·g-1)10100121±551c48±4．65e10140112±379d67±2．00d1018097±400e43±12．29e1510090±252f46±1．53e15140171±624a25±2．00f15180129±208b31±1．53f2010098±252e77±1．53c2014089±379f93±1．00b2018079±306g119±3．74a

①不同字母表示Duncan檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant difference atP<0.05 in Duncan’s test. The same below.

2.2 肌醇濃度對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

試驗(yàn)研究表明(圖1)，在缺乏肌醇的情況下，抗松材線蟲病赤松雖能產(chǎn)生子葉胚，但是子葉胚胚頭膨大，胚柄短小甚至不能正常發(fā)育，胚體短而粗，顏色偏黃，生長(zhǎng)不良，均為畸形胚； 而且愈傷組織顏色偏褐，結(jié)構(gòu)逐漸緊密，生長(zhǎng)狀況明顯衰退(圖1a)。當(dāng)加入肌醇時(shí)，抗病赤松體細(xì)胞胚數(shù)明顯提高。而肌醇濃度大于8.0 g·L-1時(shí)，體細(xì)胞胚數(shù)劇增，但出現(xiàn)的均為畸形胚，胚頭膨大，胚柄短小，生長(zhǎng)不佳(圖1f，g)。因此肌醇的最適濃度為8.0 g·L-1，體細(xì)胞胚數(shù)最高達(dá)到179個(gè)·g-1(圖1e)。胚性愈傷組織直接放置于添加了肌醇的成熟培養(yǎng)基中，沒有在中間過(guò)渡培養(yǎng)基中培養(yǎng)，因此可以縮短2～3周培養(yǎng)時(shí)間，在8周前后就形成了成熟的子葉胚。

2.3 碳源對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

不同碳源類型及濃度對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚成熟的影響存在顯著差異，麥芽糖比蔗糖增加抗病赤松正常體細(xì)胞胚數(shù)的效果明顯(P<0.05)(圖2)。麥芽糖濃度為60 g·L-1時(shí)，抗病赤松正常的體細(xì)胞胚數(shù)達(dá)到235個(gè)·g-1，而且畸形胚也降到5個(gè)·g-1； 當(dāng)麥芽糖和蔗糖濃度升高時(shí)，體細(xì)胞胚數(shù)降低并且畸形胚增多； 當(dāng)麥芽糖和蔗糖濃度低于60 g·L-1時(shí)，體細(xì)胞胚數(shù)少。因此，抗病赤松體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基中，麥芽糖比蔗糖更適宜抗病赤松的體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟，最適濃度為60 g·L-1。

2.4 凝固劑對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，由于培養(yǎng)基中添加了聚乙二醇(PEG)，凝固劑瓊脂從6.0 g·L-1添加至12.0 g·L-1時(shí)，培養(yǎng)基都不能凝固，愈傷組織無(wú)法生長(zhǎng)，也無(wú)子葉胚形成。當(dāng)加入植物凝膠且濃度為3.0 g·L-1，培養(yǎng)基凝固，軟硬適中，產(chǎn)生的子葉胚細(xì)長(zhǎng)，發(fā)育正常，生長(zhǎng)良好； 當(dāng)植物凝膠濃度為2.0 g·L-1，子葉胚生長(zhǎng)良好，但是培養(yǎng)基較軟，不易固定； 當(dāng)植物凝膠濃度增為3.5 g·L-1時(shí)，培養(yǎng)基開始偏硬，只出現(xiàn)少量

圖1 肌醇濃度對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響Fig.1 Effect of inositol concentration on somatic embryos maturation in nematode-resistant Pinus densifloraa-g: 肌醇濃度分別為0, 2, 4, 6, 8, 10, 16 g·L-1Inositol concentration is 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16 g·L-1, respectively.

培養(yǎng)情況Cultivationsituation培養(yǎng)方式CulturemethodⅠ．液-固增殖-固成熟Liquid?solid?proliferationsolidmaturationⅡ．固增殖-固成熟Solid?proliferationsolidmaturationⅢ．液增殖-固成熟Liquid?proliferationsolidmaturation基因型Genotype13#?122#?113#?122#?113#?122#?1胚性愈傷組織鮮質(zhì)量Freshmassofem?bryogeniccallus/g101010101010成熟時(shí)間Maturationtime/week11～1210～119～109～1012～1412～14正常體細(xì)胞胚數(shù)Numberofnormalso?maticembryos/(embryo·g-1)215±569b239±473a203±624b205±777b134±1100d154±1100c畸形體細(xì)胞胚數(shù)Numberofabnormalso?maticembryos/(embryo·g-1)45±252c25±586d69±681b52±306c92±252a97±351a

非正常的子葉胚； 當(dāng)植物凝膠濃度增為4.0 g·L-1時(shí)，培養(yǎng)基過(guò)硬，愈傷組織干燥、顏色發(fā)白，未形成子葉胚。因此，在抗病赤松發(fā)育成熟階段宜選用植物凝膠濃度為3.0 g·L-1，可獲得質(zhì)量較好的子葉胚。

2.5 培養(yǎng)方式對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響

圖2 碳源對(duì)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的影響Fig.2 Effect of different sugars on somatic embryo maturation in nematode-resistant Pinus densiflora

2.6 抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚萌發(fā)及植株再生

抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚成熟時(shí)，正常子葉胚呈現(xiàn)乳白色或者乳黃色，子葉完全張開，可以清楚地看到有幾個(gè)子葉，并出現(xiàn)明顯的黃色細(xì)長(zhǎng)胚軸和紅色胚根(圖3a1,a2)； 畸形子葉胚呈現(xiàn)乳白色或者乳黃色，子葉未張開或胚頭膨大，胚軸短小甚至不能正常發(fā)育，胚根未形成或有紅色根點(diǎn)(圖3b1,b2)。

將不同發(fā)育階段產(chǎn)生的成熟體細(xì)胞胚輕輕挑出，轉(zhuǎn)至無(wú)激素的萌發(fā)培養(yǎng)基，散射光培養(yǎng)5天后，體細(xì)胞胚子葉由黃白色逐漸變?yōu)辄S綠色(圖3c1,c2)，把子葉胚放在日光燈下培養(yǎng)。在光照之后，正常萌發(fā)的子葉逐漸張開，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色； 胚軸伸長(zhǎng)，基部呈現(xiàn)紅色微小根尖(圖3d1)，后根尖逐漸變?yōu)樯詈稚?，根部生長(zhǎng)。正常萌發(fā)的子葉胚子葉張開，胚軸伸長(zhǎng)，基部有微小紅色根點(diǎn)(圖3d1)，而畸形的子葉胚子葉很小，未張開或者不規(guī)則張開，胚軸很短或者幾乎沒有，基部有一點(diǎn)紅色小根點(diǎn)或者沒有，基部愈傷化嚴(yán)重(圖3d2,d3)。隨后將萌發(fā)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入WPM培養(yǎng)基中，1個(gè)月后長(zhǎng)出初生針葉，形成再生植株： 正常的子葉胚胚軸較長(zhǎng)，胚根伸長(zhǎng)，1個(gè)月后長(zhǎng)出初生針葉，嫩白色根長(zhǎng)1.0 cm左右(圖3e1,f1)； 畸形胚胚軸較短，根部的愈傷組織嚴(yán)重(圖3e2,f2)。在WPM壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3個(gè)月后，正常子葉胚初生針葉繼續(xù)生長(zhǎng)，有的還長(zhǎng)出了次生針葉，根部嫩白色，并只有1條主根，主根周圍長(zhǎng)出許多須根(圖3g1)，這時(shí)可以直接移栽； 而畸形子葉胚在WPM壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3個(gè)月后，初生針葉雖繼續(xù)生長(zhǎng)，但未見有次生針葉，根部棕褐色，愈傷化嚴(yán)重，有的還長(zhǎng)出若干側(cè)根(圖3g2)，移栽100株，全部死亡。體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率分別為67.2%和46.5%。

2.7 抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚再生植株的移栽

正常子葉胚移栽之后，體細(xì)胞胚再生植株(圖3h1)生長(zhǎng)較幼嫩，移栽3個(gè)月后體細(xì)胞胚再生植株(圖3h2)都長(zhǎng)出次生針葉，根系深入土壤。移栽體細(xì)胞胚再生植株為202株，成活株數(shù)為66株，移栽成活率為32.7%。

3 討論

圖3 抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚成熟、萌發(fā)及植株再生Fig.3 Somatic embryo maturation, germination and plant regeneration of nematode-resistant Pinus densifloraa1, a2. 正常子葉胚; b1,b2. 畸形子葉胚; c1, c2. 萌發(fā)培養(yǎng)基中5天后的體細(xì)胞胚; d1,d2,d3. 萌發(fā)培養(yǎng)基中20天后體細(xì)胞胚形成的再生植株; e1, e2. WPM培養(yǎng)基中壯苗的再生植株; f1, f2. WPM培養(yǎng)基中壯苗1個(gè)月的再生植株; g1, g2. WPM培養(yǎng)基中壯苗3個(gè)月的再生植株; h1. 移栽后的體細(xì)胞胚苗; h2. 移栽后3個(gè)月的體細(xì)胞胚苗。a1,a2. Normal cotyledon embryo; b1,b2. Abnormal cotyledon embryo; c1,c2. Somatic embryos on germination medium after five days; d1,d2,d3. Plant regeneration from somatic embryogenesis on germination medium after twenty days; e1,e2. Plant regeneration in WPM medium; f1,f2. Plant regeneration in WPM medium after one month; g1,g2. Plant regeneration in WPM medium after three months; h1. Transplanting somatic embryo plantlets; h2. Somatic embryo plantlets three months after transplanting.

體細(xì)胞胚成熟是植株能否再生的關(guān)鍵所在，與激素種類和濃度、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基滲透壓等有關(guān)。ABA 已被用于許多樹種提高體細(xì)胞胚的質(zhì)量，防止早熟發(fā)芽，提高萌發(fā)率和轉(zhuǎn)化率(Capuanaetal., 1997)。研究表明，滲透壓在針葉樹體細(xì)胞胚的發(fā)育過(guò)程中起到了重要的作用，一般是利用聚乙二醇(PEG)作滲透劑，來(lái)提高培養(yǎng)基的滲透壓。很多研究證實(shí)在成熟培養(yǎng)基中同時(shí)使用ABA 和 PEG 有利于提高體細(xì)胞胚的數(shù)量和質(zhì)量(Attreeetal., 1989)。黃健秋等(1995a)研究了云南松(Pinusyunnanensis)體細(xì)胞胚發(fā)生，結(jié)果表明PEG與ABA同時(shí)使用，幾周可形成粗壯的子葉胚。Yildirim等(2006)研究表明，土耳其紅松(Pinusbrutia)體細(xì)胞胚成熟的最適激素組合為80 μmol·L-1ABA和3.75%PEG。本試驗(yàn)表明，當(dāng) ABA 濃度為 15.0 mg·L-1以及PEG8000濃度為 140 g·L-1時(shí)，正常體細(xì)胞胚數(shù)達(dá)到171個(gè)·g-1，均高于其他處理。因此，添加適當(dāng)濃度的 ABA和PEG 可促進(jìn)抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚的個(gè)體發(fā)育和成熟。此外，培養(yǎng)基中額外添加肌醇、山梨醇等均可產(chǎn)生高滲透壓條件，促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)生，防止其早熟萌發(fā)，其中以肌醇最為有效(黃健秋等，1995a)。本試驗(yàn)表明，肌醇的濃度為8.0 g·L-1時(shí)，抗松材線蟲病赤松的正常體細(xì)胞胚數(shù)最多； 肌醇濃度大于8.0 g·L-1時(shí)，體細(xì)胞胚數(shù)劇增，但多數(shù)為畸形胚； 而當(dāng)肌醇濃度低于8.0 g·L-1或不添加時(shí)，大多為畸形胚，愈傷組織顏色偏褐，結(jié)構(gòu)逐漸緊密，生長(zhǎng)狀況明顯衰退。因此，肌醇的濃度以8.0 g·L-1最適宜抗松材線蟲病赤松的體細(xì)胞胚成熟。黃健秋等(1995b)及唐巍等(1998)分別將馬尾松(Pinusmasssoniana)、火炬松早期原胚轉(zhuǎn)入含9 000 mg·L-1肌醇的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成后期原胚后，再將后期原胚轉(zhuǎn)入成熟培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚成熟； 而在本試驗(yàn)中，抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織直接放置于添加了肌醇的成熟培養(yǎng)基中，沒有在中間過(guò)渡培養(yǎng)基中培養(yǎng)，因此可以縮短2～3周培養(yǎng)時(shí)間，在8周前后就形成了成熟的子葉胚，加快了抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚發(fā)生的進(jìn)程。

在植物體細(xì)胞胚的發(fā)育過(guò)程中，不同種類及其濃度的碳源起到至關(guān)重要的作用。碳源既可以作為能量物質(zhì)，又可作為滲透調(diào)節(jié)劑對(duì)體細(xì)胞胚的發(fā)育與成熟起到促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，麥芽糖比蔗糖更能增加抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚的數(shù)量。其中麥芽糖濃度為60 g·L-1時(shí)，抗病赤松體細(xì)胞胚數(shù)達(dá)到235個(gè)·g-1，而且畸形胚也降到最低。當(dāng)蔗糖和麥芽糖濃度升高時(shí)，體細(xì)胞胚數(shù)降低且畸形胚也較多，這與Li等(1998)和Shoji等(2006)的研究結(jié)果一致。

凝固劑在培養(yǎng)基中起固定支撐作用，不同種類凝固劑有可能影響到培養(yǎng)基的物理結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用。張巧等(2010)研究表明： 以植物凝膠(phytagel)作為凝固劑，提高了陸地棉(Gossypiumhirsutum)體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生頻率。本研究以抗松材線蟲病赤松22#-1胚性愈傷組織為材料，比較了2種不同凝固劑瓊脂(agar powder)和植物凝膠培養(yǎng)基對(duì)抗病赤松體細(xì)胞胚發(fā)生的影響。結(jié)果表明： 植物凝膠濃度為3.0 g·L-1時(shí)，培養(yǎng)基凝固，軟硬適中，產(chǎn)生的子葉胚細(xì)長(zhǎng)，發(fā)育正常，生長(zhǎng)良好； 而成熟培養(yǎng)基中加入PEG8000，瓊脂作為凝固劑無(wú)法凝固培養(yǎng)基。故植物凝膠對(duì)抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和體細(xì)胞胚成熟均具有良好作用，但考慮到植物凝膠價(jià)格因素，在胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖過(guò)程中可使用較廉價(jià)的瓊脂，而在體細(xì)胞胚成熟和萌發(fā)過(guò)程中應(yīng)使用植物凝膠。

植物體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)、固-液結(jié)合培養(yǎng)，培養(yǎng)方式對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生具有顯著影響。以往培養(yǎng)方式是松屬(Pinus)樹種胚性愈傷組織以團(tuán)塊的形式夾取到成熟培養(yǎng)基中，但是此方式需要大量的胚性愈傷組織(Keinonen-Mett?l?etal., 1996)。而現(xiàn)在將胚性愈傷組織放入有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的懸浮液中生長(zhǎng)來(lái)最大化地產(chǎn)生體細(xì)胞胚(Klimaszewskaetal., 2007)，每皿(7 cm)胚性愈傷組織起始量在50 mg(Carnerosetal., 2009)到500 mg(Maruyamaetal., 2007)。本試驗(yàn)對(duì)固體培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)、固-液結(jié)合培養(yǎng)3種培養(yǎng)方式進(jìn)行了比較，結(jié)果表明： 液-固增殖-固成熟方式的正常體細(xì)胞胚數(shù)最高且畸形體細(xì)胞胚數(shù)最低，雖成熟時(shí)間較固增殖-固成熟方式多了3周左右，但同步化程度高，所需材料少，因此，該方式適合進(jìn)行抗病赤松體胚成熟試驗(yàn)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，歐洲赤松(Pinussylvestris)液-固培養(yǎng)比固-固培養(yǎng)能夠產(chǎn)生更多良好的細(xì)長(zhǎng)型的體細(xì)胞胚，原因是液-固培養(yǎng)中的胚性愈傷組織在較薄的濾紙上比固-固培養(yǎng)能夠更好地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生大量的體細(xì)胞胚(Lelu-Walteretal., 2008)。

植物體細(xì)胞胚的萌發(fā)與植株再生培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)有利于提高萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率。齊力旺等(2004)研究表明附加IBA和NAA的萌發(fā)培養(yǎng)基可以促進(jìn)華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)體細(xì)胞胚根的發(fā)生。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，附加1.5 mg·L-1IBA和0.2 mg·L-1NAA的WPM植株再生培養(yǎng)基有利于促進(jìn)抗松材線蟲病赤松根的發(fā)生，體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率高，分別為67.2%和46.5%。研究中發(fā)現(xiàn)，僅挑出質(zhì)量好的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)是能夠成功獲得良好的植株再生苗的關(guān)鍵因素之一(Aronenetal., 2009)。本試驗(yàn)中，高質(zhì)量的體細(xì)胞胚可以轉(zhuǎn)化為良好的植株再生苗，而低質(zhì)量的體細(xì)胞胚最終移栽不成活，這表明高質(zhì)量的體細(xì)胞胚能夠提高體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率。此外在本試驗(yàn)中再生植株壯苗利用WPM培養(yǎng)基，3個(gè)月之后再生植株根伸長(zhǎng)3.0 cm左右，這表明WPM培養(yǎng)基能促進(jìn)植株生長(zhǎng)和根的進(jìn)一步伸長(zhǎng)。

4 結(jié)論

將抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織置于15.0 mg·L-1ABA、140 g·L-1PEG8000、8.0 g·L-1肌醇、60 g·L-1麥芽糖、3.0 g·L-1植物凝膠的LP培養(yǎng)基上，以液-固增殖-固成熟培養(yǎng)方式培養(yǎng)，成功獲得了高質(zhì)量的體細(xì)胞胚和再生植株，體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和植株轉(zhuǎn)化率分別為67.2%和46.5%，再生植株移栽3個(gè)月后成活率為32.7%，為抗病赤松的大規(guī)模繁殖和工廠化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

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