高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定荔枝花粉和花蜜中腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑殘留

王思威, 劉艷萍, 孫海濱, 杜蘭娟, 徐能莉

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點實驗室, 廣東 廣州 510640)

荔枝(LitchichinensisSonn.)為亞熱帶常綠果樹,世界上荔枝栽培面積最廣和產(chǎn)量最大的國家是中國,主要集中在廣東、海南等地[1]。南方高溫高濕的氣候環(huán)境極易導(dǎo)致荔枝發(fā)生病害,尤其在花期、果實發(fā)育及成熟期。腈菌唑(myclobutanil)和苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)均屬于三唑類殺菌劑,具有內(nèi)吸性強、持效期長的特點,是用于荔枝樹炭疽病防治的主要藥劑。荔枝花為雌雄同株異花異熟,需要蜜蜂等昆蟲媒介才能較好地完成授粉。蜜汁和花粉是蜜蜂訪花的主要誘物,通過其授粉可使荔枝坐果率提高248% ～290%[2]。近年來,化學(xué)農(nóng)藥投入量巨大,蜜蜂在花期采集含有殘留農(nóng)藥(尤其是強內(nèi)吸性、長持效期的農(nóng)藥)的花蜜和花粉,對其生理行為構(gòu)成巨大影響。一般認(rèn)為,殺菌劑對非靶標(biāo)生物低毒,故在實際使用過程中極少關(guān)注殺菌劑的毒性。其實不然,許多殺菌劑對昆蟲有直接殺傷作用,且隨著殺菌劑使用量的逐年增多,殺菌劑對包括蜜蜂在內(nèi)的非靶標(biāo)生物存在潛在的和未知的風(fēng)險[3,4]。腈菌唑?qū)γ鄯涠拘詾橹卸?且對蜜蜂具有中等風(fēng)險性[4];苯醚甲環(huán)唑雖對蜜蜂毒性為低毒,但對蜜蜂具有中等風(fēng)險性[5],在蜜源作物花期時應(yīng)慎重使用。因此,通過建立分析方法檢測殺菌劑在蜜蜂直接接觸的花粉、花蜜中的殘留水平,評估殺菌劑對蜜蜂等有益生物的安全性十分必要。

國內(nèi)外有關(guān)腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑的分析方法主要有氣相色譜法(GC)[6-11]、高效液相色譜法(HPLC)[12,13]、氣相色譜- 質(zhì)譜法(GC- MS)[14-19]和液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法(LC- MS/MS)[20-27]等。主要的前處理方法有液液分配萃取+填充柱凈化、固相萃取(SPE)和QuEChERS凈化等。液液分配萃取法需要消耗大量溶劑且不環(huán)保;填充柱凈化耗時耗

力,步驟繁瑣,不適于大批量樣品的分析;SPE凈化過程也較復(fù)雜且價格偏高;QuEChERS方法快速、操作簡單,是目前較為通用的前處理方法。目前有關(guān)腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑分析的基質(zhì)主要有蔬菜、谷物和果樹,暫未見分析花粉和花蜜基質(zhì)的相關(guān)報道。

本研究應(yīng)用改良的QuEChERS結(jié)合高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立了測定荔枝花粉和花蜜中腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑的分析方法。該法簡便快速，極大地提高了分析效率。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent LC- 1200高效液相色譜- 串聯(lián)AB SCIEX 4000Q TRAP質(zhì)譜儀,配電噴霧電離(ESI)源;Milli- Q超純水機(美國Millipore公司); LD5- 2A離心機(北京雷勃爾醫(yī)藥公司); OA- SYS氮吹儀(美國Organomation Associates公司); XW- 80A渦旋儀(上海精科有限公司)。

乙腈(色譜純,美國Fisher公司);甲酸(色譜純,美國Fluka公司);無水硫酸鎂、氯化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、N- 丙基乙二胺吸附劑(PSA)(上海安譜實驗科技股份有限公司)。標(biāo)準(zhǔn)品:腈菌唑純度為99.8% (美國Chem Service公司)、苯醚甲環(huán)唑純度為99.9% (美國AccuStandard公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈稀釋成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;分別準(zhǔn)確吸取1 mL腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液定容至10 mL,配制100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-20 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1花粉

準(zhǔn)確稱取荔枝花粉樣品2.0 g,置于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈、8 mL超純水和3 mL正己烷進(jìn)行提取,然后加入1 g氯化鈉,立即用手劇烈振蕩,再渦旋1 min,然后以5 000 r/min離心2 min。取5 mL乙腈層溶液,置于加有0.9 g無水硫酸鎂、0.15 g PSA和0.15 g C18的離心管中,立即用手劇烈振蕩,然后渦旋10 s,再以5 000 r/min離心2 min。取2 mL上清液,置于5 mL錐形管中,用氮吹儀吹至約50 μL,用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液定容至2 mL,過0.22 μm有機濾膜,待HPLC- MS/MS測定。

1.3.2花蜜

準(zhǔn)確稱取荔枝花蜜樣品5.0 g,置入50 mL離心管中,加入10 mL超純水,混勻,加入10 mL乙腈提取,再加入1 g氯化鈉,立即用手劇烈振蕩,渦旋1 min,然后以5 000 r/min離心2 min。取4 mL乙腈層溶液,置于加有0.9 g無水硫酸鎂和0.15 g PSA的離心管中,立即用手劇烈振蕩,然后渦旋10 s,再以5 000 r/min離心2 min。取1 mL上清液,置于5 mL錐形管中,用氮吹儀吹至約50 μL,用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液定容至2 mL,過0.22 μm有機濾膜,待HPLC- MS/MS測定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱:Poroshell- 120 EC- C18柱(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm);柱溫:35 ℃;流動相:0.1%(v/v)甲酸水溶液- 乙腈(25∶75, v/v),等度洗脫;分析時間:7 min;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL。

離子源:ESI源,正離子掃描;掃描模式:選擇離子監(jiān)測(SIM)模式;離子源溫度:550 ℃;氣簾氣壓力:0.2 MPa;毛細(xì)管電壓:5 500 V;霧化氣壓力:0.3 MPa;輔助氣壓力:0.3 MPa。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑的保留時間、母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取劑的選擇

實驗考察了乙酸乙酯、丙酮和乙腈作為提取劑時目標(biāo)農(nóng)藥的回收率。結(jié)果顯示,由于乙酸乙酯微溶于水,導(dǎo)致其不能將強極性的苯醚甲環(huán)唑從基質(zhì)中全部提取,回收率較低;丙酮易溶于水,對目標(biāo)農(nóng)藥的回收率較高,但其提取過程中共萃取物較多(花粉中的脂類、色素等),導(dǎo)致基質(zhì)的凈化效果較差,增加了后續(xù)凈化的難度,且分層效果不顯著,不易于后續(xù)凈化步驟的進(jìn)行;乙腈與水互溶,通過氯化鈉的鹽析作用,可以達(dá)到水相- 有機相界面的良好分層,提高了目標(biāo)農(nóng)藥的回收率,且基質(zhì)較干凈,是優(yōu)良的提取溶劑,故選為實驗所用。

由于花粉中含有較多的脂類物質(zhì),因此在提取過程中加入正己烷以達(dá)到去除脂類物質(zhì)干擾的目的,增強凈化效果。除脂前后腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)在選擇離子監(jiān)測模式下的總離子流色譜圖見圖1。

圖 1 加入正己烷(a)前、(b)后腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑混合標(biāo)準(zhǔn) 溶液(100 μg/L)在SIM模式下的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of myclobutanil and difenoconazole in a mixed standard (100 μg/L) under selected ion monitoring (SIM) mode (a) before and (b) after adding n- hexane

2.1.2吸附劑的選擇

花粉中含有大量脂類、黃酮類和糖類等成分,花蜜中主要含有糖類物質(zhì),針對不同基質(zhì)的特點,選擇不同吸附劑進(jìn)行凈化來降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,以達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的。無水硫酸鎂是干燥劑,主要用于除去花粉和花蜜中多余的水分,避免目標(biāo)農(nóng)藥溶解于水中而不易被提取到乙腈中,導(dǎo)致回收率不足;PSA是弱陰離子交換填料,可有效去除樣品中的脂肪酸、色素、糖類等物質(zhì);C18吸附劑是硅膠基質(zhì)鍵合十八烷基填料,比表面積大,具有較強的吸附能力,能夠去除脂肪、脂類等非極性干擾物?；ǚ壑泻兄舅岷椭舅狨ヮ惢衔?通過PSA+C18聯(lián)合應(yīng)用能夠明顯去除脂類物質(zhì)的干擾,改善花粉的凈化效果。相較于花粉,花蜜中的雜質(zhì)較少,大部分是糖類物質(zhì),通過無水硫酸鎂和PSA填料的加入,能夠?qū)⑻穷愇镔|(zhì)吸附,且基質(zhì)較為干凈,目標(biāo)物的添加回收率滿足分析要求。

圖 2 腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑在二級質(zhì)譜模式下的質(zhì)譜圖和裂解機理Fig. 2 Mass spectra and pyrolysis mechanisms of myclobutanil and difenoconazole under MS/MS mode

2.1.3吸附劑加入量的選擇

實驗考察了加入0.05、0.10、0.15和0.20 g PSA對花粉中2種目標(biāo)農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)PSA加入量為0.05 g和0.10 g時,目標(biāo)農(nóng)藥的回收率分別為83.1% ～86.7%和85.9% ～92.0% ； 加入量為0.15 g與0.20 g時，目標(biāo)農(nóng)藥的回收率相近,分別為88.7% ～94.6%和82.8% ～92.7% ,隨著PSA用量的增加,基質(zhì)中的色素越少,顏色越淡。綜合節(jié)約成本和保證回收率的需要,選擇加入0.15 g的PSA。由于花蜜的基質(zhì)相對花粉簡單,直接采用0.15 g PSA用于花蜜的凈化,回收率為84.7% ～95.8% ,滿足分析要求。

比較了加入0.05、0.10、0.15和0.20 g C18吸附劑對花粉中2種目標(biāo)農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果顯示,C18加入量為0.15 g時,花粉中2種目標(biāo)農(nóng)藥的回收率為83.4% ～92.9% 。C18加入量過少,不能達(dá)到去除脂類物質(zhì)的明顯效果;加入量過多,影響目標(biāo)物的添加回收率。因此,花粉凈化時選擇C18加入量為0.15 g。

2.2 流動相的選擇

實驗考察了甲醇- 水和乙腈- 水對腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑色譜分離度和響應(yīng)強度的影響。結(jié)果顯示,甲醇的黏度較大，容易引起柱壓升高[28],不利于色譜柱及相關(guān)儀器配件的長久使用,且2種目標(biāo)農(nóng)藥的色譜峰對稱性較差;乙腈- 水對目標(biāo)農(nóng)藥的分離程度和響應(yīng)強度均較好,是ESI+模式下優(yōu)先選擇的流動相組成。水相中加入0.1%(v/v)的甲酸可以促成[M+H]+離子峰的形成,以[M+H]+作為母離子能夠獲取高強度的離子碎片,增強目標(biāo)農(nóng)藥的響應(yīng)值,進(jìn)而提高儀器檢測的靈敏度。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用單針自動進(jìn)樣分析腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L),優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。通過一級質(zhì)譜掃描獲取目標(biāo)農(nóng)藥的準(zhǔn)分子離子峰,優(yōu)化去簇電壓;準(zhǔn)分子離子進(jìn)入二級質(zhì)譜后發(fā)生斷裂或重排等裂解反應(yīng),產(chǎn)生不同m/z的離子碎片,從而優(yōu)化碰撞能量、明確定量和定性離子。二級離子質(zhì)譜圖及可能的裂解機理見圖2。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)能夠影響目標(biāo)農(nóng)藥的準(zhǔn)確定量,通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液能夠有效消除基質(zhì)效應(yīng)的影響?；|(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為對目標(biāo)化合物信號的增強或抑制作用,通常采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液斜率的比值進(jìn)行評價,比值大于1,表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng),相反則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。實驗結(jié)果表明,腈菌唑在花粉和花蜜基質(zhì)中斜率的比值均小于1,表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng);苯醚甲環(huán)唑在花粉和花蜜基質(zhì)中斜率的比值均大于1,存在基質(zhì)增強效應(yīng)(見表2)。本實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正基質(zhì)效應(yīng)的方法,以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1線性范圍和檢出限

在1～100 μg/L范圍內(nèi),腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑在花粉和花蜜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的峰面積(y)與對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x, μg/L)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999 0(見表2)。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑的LOD分別為0.25 μg/kg和0.50 μg/kg, LOQ分別為0.83 μg/kg和1.7 μg/kg。

表 2 腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑在溶劑和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的線性方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5.2回收率和精密度

在10、50和100 μg/kg的添加水平下,腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑在荔枝花粉和花蜜中的平均加標(biāo)回收率分別為87.0% ～95.2%和90.1% ～96.4% ,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.2% ～3.6%和0.7% ～4.1%(見表3),符合殘留分析檢測要求。

2.6 實際樣品檢測

對某地區(qū)5個示范園的荔枝花粉和花蜜樣品進(jìn)行檢測,花粉和花蜜樣品中腈菌唑的含量均低于檢出限;花粉樣品中苯醚甲環(huán)唑的含量為0.6～0.9 μg/kg,花蜜樣品中苯醚甲環(huán)唑的含量低于檢出限?；ǚ酆突蹣悠吩赟IM模式下的總離子流色譜圖見圖3。

表 3 腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑在荔枝花粉和花蜜中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

圖 3 (a)花粉和(b)花蜜樣品在SIM模式下的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion chromatograms of (a) pollen and (b) honey samples under SIM mode

3 結(jié)論

本文建立了改良的QuEChERS- 高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜方法分析荔枝花粉和花蜜中痕量腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑的殘留水平。方法簡便、可靠,可用于荔枝樹上花粉和花蜜樣品的快速準(zhǔn)確定量,符合對蜜蜂安全評價指標(biāo)的要求。該方法可為監(jiān)測農(nóng)藥對蜜蜂等授粉生物的風(fēng)險性提供基礎(chǔ),為評價有益生物的安全性提供技術(shù)支持。

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