柱前衍生-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葡萄和櫻桃中單氰胺殘留

蘭 豐, 劉傳德

(山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)部果品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)), 山東 煙臺(tái) 265500)

單氰胺(cyanamide)又名氨基氰,分子式為CH2N2,主要作破眠劑使用,促進(jìn)果樹(shù)提早萌芽、果實(shí)提前成熟上市。由于提前上市的水果市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng),近些年有關(guān)單氰胺用于設(shè)施栽培的櫻桃、葡萄、藍(lán)莓等果樹(shù)的研究越來(lái)越多[1-3]。然而,單氰胺對(duì)人體有一定的毒性,能引起接觸性皮炎、頭痛和惡心、嘔吐等胃腸道癥狀[4]。美國(guó)環(huán)境保護(hù)組織(EPA)[5]將單氰胺列為高毒Ⅰ類(lèi)危險(xiǎn)農(nóng)藥。2015年我國(guó)[6]啟動(dòng)了果蔬植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用調(diào)查與產(chǎn)品安全性評(píng)估研究,項(xiàng)目涉及的9種常用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中包含單氰胺。我國(guó)[7]目前只規(guī)定了葡萄中單氰胺的最大殘留臨時(shí)限量值為0.05 mg/kg,其他作物未做規(guī)定,也沒(méi)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。

單氰胺極易溶于水,使用常規(guī)有機(jī)溶劑難以提取,相對(duì)分子質(zhì)量小,濃縮過(guò)程易揮發(fā),無(wú)特征吸收峰,遇酸堿不穩(wěn)定,其殘留檢測(cè)極具挑戰(zhàn)性[8]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于單氰胺的殘留檢測(cè)方法較少,主要以柱前衍生間接測(cè)定為主。Rust[9]利用1,2- 萘醌- 4- 磺酸鉀為衍生試劑,測(cè)定植物中單氰胺的殘留。衍生前經(jīng)過(guò)兩步凈化處理:首先以硅藻土為固相分散劑,經(jīng)洗脫、濃縮后,再經(jīng)C18SPE柱凈化,衍生產(chǎn)物經(jīng)液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定。Reddy等[10]利用CHEM ELUTM固相萃取柱萃取葡萄汁中的單氰胺,與1,2- 萘醌- 4- 磺酸衍生反應(yīng),液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定。衍生前需要用100 mL正己烷預(yù)淋洗固相萃取柱,再用200 mL乙酸乙酯洗脫,衍生后用90 mL二氯甲烷萃取,整個(gè)前處理需要將近400 mL溶劑。張春濤[11]利用酸性氧化鋁為固相分散劑、丙酮作淋洗劑、丹磺酰氯(dansyl chloride, DNS)進(jìn)行柱前衍生,測(cè)定葡萄和土壤中單氰胺的殘留量,以酸性氧化鋁添加石墨化炭黑作固相分散劑的凈化方式存在基質(zhì)效應(yīng),而且人工填充柱子需要注意基質(zhì)的松緊對(duì)結(jié)果的影響。Cheng等[12]采用多壁碳納米管凈化植物樣品提取液,利用DNS與單氰胺衍生后進(jìn)行測(cè)定。每類(lèi)植物樣品需要根據(jù)含水量多少確定加入提取溶劑的體積和凈化劑的量,比較繁瑣。柱前衍生法對(duì)樣品前處理要求十分嚴(yán)格,特別是衍生前凈化除雜步驟對(duì)衍生能否成功及試驗(yàn)可重復(fù)性至關(guān)重要。在上述已報(bào)道的柱前衍生測(cè)定單氰胺方法中[9-12],有的前處理操作比較繁瑣,檢測(cè)效率不高,有的消耗試劑較多。本文著重考察了不同提取溶劑/體系對(duì)單氰胺的提取及衍生效果的影響,建立了單氰胺柱前衍生后直接進(jìn)樣的檢測(cè)方法。DNS作為伯胺、仲胺、氨基酸、羥基化合物等衍生化使用最為廣泛的試劑,相關(guān)研究較多[13,14],在單氰胺衍生化檢測(cè)方面也有不少應(yīng)用,比較成熟,本文主要借鑒了美國(guó)環(huán)境保護(hù)組織[15]公布的DNS衍生土壤中單氰胺的條件。在檢測(cè)器方面,優(yōu)先選擇靈敏度高、基質(zhì)干擾小的液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。所建立的DNS柱前衍生- 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定單氰胺的方法,前處理簡(jiǎn)便、有效,可用于批量檢測(cè)葡萄和櫻桃中單氰胺的殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC- MS 8040液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司); SHA- B恒溫振蕩器、SK- 1快速混勻器(常州國(guó)華電器有限公司); RE- 52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(帶北京博醫(yī)康HX- 1050型恒溫循環(huán)器)(上海亞榮生化儀器廠); Milli- Q超純水系統(tǒng)(德國(guó)默克集團(tuán))。

甲酸(色譜級(jí))購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司;丙酮(色譜純)和乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)均購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲醇(質(zhì)譜級(jí))、DNS(純度≥98% )和單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98% )均購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 溶液的配制

2 g/L DNS衍生劑:稱(chēng)取0.1 g DNS,用丙酮溶解定容至50 mL。

單氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:將單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈配制成0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/kg的單氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

單氰胺基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液:用經(jīng)提取、濃縮、定容后獲得的葡萄和櫻桃空白基質(zhì)溶液分別將單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/kg的單氰胺基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

衍生緩沖液:4 mL 0.2 mol/L碳酸鈉水溶液和46 mL 0.2 mol/L碳酸氫鈉水溶液混合,用水定容至200 mL。

無(wú)水硫酸鈉:550 ℃烘烤4 h,于干燥器中保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化

用移液槍分別移取200 μL系列單氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,置于具塞試管中,分別加入0.5 mL衍生緩沖液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生劑,渦旋30 s后,置于50 ℃水浴中，并振蕩反應(yīng)1 h,冷卻至室溫,用甲醇定容至2 mL,復(fù)溶后過(guò)0.45 μm尼龍濾膜。

1.3.2空白樣品的衍生化

取200 μL空白基質(zhì)溶液,加入0.5 mL衍生緩沖液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生劑,按1.3.1節(jié)步驟進(jìn)行衍生化。

1.3.3樣品衍生化

稱(chēng)取4.0 g經(jīng)破壁機(jī)勻漿后的待測(cè)樣品,加入20 mL乙酸乙酯,超聲10 min,加入25 g無(wú)水硫酸鈉,持續(xù)渦旋1 min,經(jīng)濾紙過(guò)濾并用10 mL乙酸乙酯沖洗2次,所有濾液收集到100 mL具塞量筒中,最后轉(zhuǎn)移到50 mL雞心瓶中,于30 ℃水浴減壓蒸發(fā)濃縮近干,加丙酮定容至1 mL,得到待衍生液。取0.5 mL待衍生液,加入0.5 mL衍生緩沖液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生劑,于50 ℃水浴中振蕩反應(yīng)1 h,冷卻至室溫,用甲醇定容至2 mL,復(fù)溶后過(guò)0.45 μm尼龍濾膜。

1.3.4色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:Shim- pack XR- ODS色譜柱(75 mm×2.0 mm, 1.6 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:1 μL。流動(dòng)相A: 0.05%(體積分?jǐn)?shù))甲酸+2 mmol/L醋酸銨,流動(dòng)相B:甲醇;流速為0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.90 min, 10%B; 0.90～3.00 min, 10%B～50%B; 3.00～3.10 min, 50%B～70%B; 3.10～3.60 min, 70%B～95%B; 3.60～4.00 min, 95%B; 4.00～4.01 min, 95%B～10%B。目標(biāo)化合物出峰時(shí)間為2.5 min左右。

質(zhì)譜條件:ESI+電離模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;DL(desolvation)管溫度為250 ℃;加熱模塊溫度為400 ℃;干燥氣流速為15 L/min；碰撞氣壓力為230 kPa。m/z276.0/156.1為定量離子對(duì),m/z276.0/171.1為定性離子對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑

單氰胺在43 ℃與水互溶,在水中有極高的溶解度,因此首先選擇水作提取劑。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以水作提取劑存在兩方面不便:一方面,提取后不易濃縮,并且濃縮過(guò)程單氰胺先于水揮發(fā),易損失;另一方面,水可以提取出大量含氨基、酚羥基等能與DNS反應(yīng)的極性化合物,不易除去,影響后續(xù)衍生。因此嘗試采用乙腈提取,經(jīng)鹽析后,取有機(jī)層衍生分析,單氰胺回收率低。其中大部分單氰胺可能仍在水層,加之有機(jī)層提取了很多與DNS反應(yīng)的雜質(zhì),影響了衍生效果,從而影響回收率。

鑒于以乙腈和水作提取劑不利于后續(xù)的濃縮和衍生,不建議使用二者作提取溶劑。再者,植物源樣品含有的水對(duì)提取、濃縮不利,需予以去除。因此,本試驗(yàn)選取沸點(diǎn)低、便于濃縮的丙酮、甲醇、乙酸乙酯和乙醚等對(duì)單氰胺有較高溶解度的溶劑作提取劑,并通過(guò)過(guò)量無(wú)水硫酸鈉除水,經(jīng)提取、濃縮與DNS衍生等步驟,考察單氰胺的回收率。結(jié)果表明,在丙酮、甲醇和乙醚3組試驗(yàn)中,單氰胺回收率不足30% ,僅有乙酸乙酯組單氰胺回收率滿(mǎn)足農(nóng)殘檢測(cè)要求,具體回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。原因可能是乙酸乙酯相比其他3種溶劑提取的不利衍生的雜質(zhì)較少,而DNS又過(guò)量,因此乙酸乙酯更適于作單氰胺的提取溶劑。

表1 葡萄基質(zhì)中采用不同提取劑時(shí)單氰胺的回收率Table1 RecoveriesofcyanamideingrapematrixwithdifferentextractionsolventsTreatmentExtrationsolventRecovery/%Moistureretentionwater-acetonitrile20Moistureremovingacetone27methanol10ethylacetate75ether- -:nocyanamidederivativesweredetected.

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1基質(zhì)效應(yīng)(ME)評(píng)判

為評(píng)價(jià)是否存在基質(zhì)效應(yīng),對(duì)比了單氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線(xiàn)與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線(xiàn)。以單氰胺質(zhì)量濃度(X, mg/L)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)得到線(xiàn)性方程?；|(zhì)效應(yīng)用ME=B/A×100%計(jì)算,A和B分別為單氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線(xiàn)和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線(xiàn)的斜率。一般情況下,ME在85% ～115%之間表示不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng),由此判斷,本檢測(cè)方法中單氰胺基質(zhì)效應(yīng)不明顯(見(jiàn)表2)。

表 2 單氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)和基質(zhì)效應(yīng)

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.2.2回收率、精密度和定量限

按0.01、0.05和1.0 mg/kg 3個(gè)添加水平向葡萄和櫻桃樣品中添加單氰胺,每個(gè)添加水平重復(fù)5次,并作空白對(duì)照。按本方法對(duì)樣品進(jìn)行處理和測(cè)定,考察單氰胺的加標(biāo)回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。單氰胺在葡萄和櫻桃中的平均回收率為75% ～81% ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.5% ～9.8% 。可見(jiàn)該方法具有較高的回收率和較好的精密度,可以滿(mǎn)足葡萄和櫻桃中單氰胺殘留量檢測(cè)需要。根據(jù)添加回收試驗(yàn)確定葡萄和櫻桃中單氰胺殘留檢測(cè)定量限均為0.01 mg/kg,相關(guān)譜圖見(jiàn)圖1。

表3 葡萄和櫻桃中單氰胺在3個(gè)添加水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table3 RecoveriesandRSDsofcyanamideatthreespikedlevelsinthegrapesandcherries(n=5) FruitSpikedlevel/(mg/kg)Recovery/%RSD/%Grape0.01769.70.05769.81.0808.9Cherry0.01756.70.05817.01.0776.5

圖 1 空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the blank samples and the spiked samplesa. the blank sample; b. the sample spiked with 0.05 mg/kg cyanamide.

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

按所建立的方法對(duì)2016年抽取的山東濰坊、煙臺(tái)兩地的葡萄和櫻桃中單氰胺殘留量進(jìn)行測(cè)定。20個(gè)櫻桃樣品(設(shè)施栽培)中有4個(gè)樣品檢出單氰胺殘留,殘留量為0.005～0.018 mg/kg。20個(gè)葡萄樣品未有單氰胺檢出。

3 結(jié)論

本研究利用過(guò)量無(wú)水硫酸鈉除水,乙酸乙酯提取,提取液經(jīng)濃縮后無(wú)需凈化可直接與DNS衍生反應(yīng),建立了液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定葡萄和櫻桃中單氰胺殘留的方法。免除了前處理過(guò)程的繁瑣操作,簡(jiǎn)便、快速,可以滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求,可用于葡萄和櫻桃中單氰胺殘留批量檢測(cè)。同時(shí),該方法中乙酸乙酯表現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)也為研究DNS柱前衍生的科研工作者提供了有益參考。

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