阿特拉津降解菌MSD6鑒定及其降解特性研究

李文帥 段玉春 范文艷 韓文革 姜述君

摘 要：阿特拉津是一種高效除草劑，但其廣泛大量的使用對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了危害。研究采用富集法從黑龍江省南部長期施用阿特拉津玉米田土壤中分離到一株能降解阿特拉津的菌株MSD6，通過生理生化和16S rRNA序列分析，確定菌株MSD6為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.），該菌株16S rRNA序列GenBank登錄號為MH698840。菌株MSD6在48h對阿特拉津的降解率可達到90%以上。菌株MSD6對堿性環(huán)境適應(yīng)性較好，在pH為9的條件下生長OD600值為0.486，對阿特拉津的降解率為30.89%。該菌株也顯示出對NaCl脅迫有較好耐性，在4%NaCl脅迫下，其生長量OD600值為0.455，阿特拉津降解率為43.91%。菌株對高溫環(huán)境適應(yīng)性相對較差。菌株MSD6生長和降解阿特拉津的適宜pH為6～7，最適溫度為30℃。

關(guān)鍵詞：阿特拉津；生物降解；節(jié)桿菌屬

中圖分類號 X172；X592 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）20-0045-5

Identification and Characterization of Atrazine-degrading Bacterial Strain MSD6

Li Wenshuai et al

（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：Atrazine is a highly effective herbicide，but its widespread use poses a threat to the ecological environment and human health. An atrazine-degrading strain MSD6 was isolated from the soil of maize fields in southern Heilongjiang Province. The strain MSD6 was identified as Arthrobacter sp by physiological，biochemical and 16S rRNA sequence analysis. The 16S rRNA sequence GenBank login number of the strain was MH698840. The degradation rate of strain MSD6 in atrazine at 48h can reach more than 90%. The strain MSD6 was well adapted to alkaline environment. The growth OD600 value and the degradation rate of atrazine were 0.486 and 30.89% at pH 9，respectively. The strain also showed better tolerance to NaCl stress. Under 4% NaCl stress，its growth OD600 value was 0.455，and the degradation rate of atrazine was 43.91%. The adaptability of strain to high temperature environment is relatively poor. The optimum pH for growth and degradation of atrazine by strain MSD6 was 6～7 and the optimum temperature was 30℃.

Key words：Atrazine；Biodegradation；Arthrobacter sp.

自從化學(xué)除草劑問世以來，除草劑的應(yīng)用對提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)發(fā)揮了重要的作用。阿特拉津是除草劑種類中的一個重要品種，是防治玉米雜草的主要除草劑品種之一，目前在玉米種植中被廣泛使用。由于阿特拉津除草劑屬于長殘效除草劑，在土壤中半衰期長，極易對一些后茬敏感作物造成藥害[1]。此外，許多研究也證明了阿特拉津不僅污染地下和地表水，同時對生態(tài)環(huán)境也有較大危害[2]。阿特拉津不僅干擾蛙類的性發(fā)育[3]，同時也可誘導(dǎo)乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生[4]。早在1998年，阿特拉津已被世界野生動物基金會（WWF）列為環(huán)境激素類物質(zhì)[5]。因此，如何有效應(yīng)對阿特拉津的污染成為廣泛關(guān)注的焦點。阿特拉津在土壤中的降解可通過化學(xué)和生物途徑來完成，其中生物降解途徑是其降解的主要過程。近年來，已報道的降解阿特拉津的生物主要有細菌、真菌和藻類等。由于氣候和生態(tài)環(huán)境因素對微生物有較大的影響，同一菌株在不同地域環(huán)境條件下降解阿特拉津能力常表現(xiàn)出較大的差異[6]。因此，筆者從黑龍江省南部地區(qū)長期施用阿特拉津的玉米田中分離、馴化高效降解菌，對菌株的鑒定、其適宜生長環(huán)境以及對降解阿特拉津的影響進行了研究，以期為其在阿特拉津污染環(huán)境的生物修復(fù)應(yīng)用中提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土樣 研究所用的土樣采集自黑龍江省尚志市帽兒山鎮(zhèn)長期施用阿特拉津的玉米（Zea mays L.）田，用土鉆取0～15cm土樣，然后將土樣裝入封口袋中4℃保存。

1.2 試劑 阿特拉津原藥（純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純，用于液相色譜的試劑均為色譜純。

1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：10.0g蛋白胨、5.0g酵母粉、10.0gNaCl、1000mL蒸餾水、13.0g瓊脂粉。無機鹽培養(yǎng)基：0.4gMaCl、0.2gMgSO4.7H2O、1.5gNaH2PO4、1.5gKH2PO4、1mL微量元素營養(yǎng)液、1000mL蒸餾水、pH7.0。微量元素配方：0.4gNa2B4O7·10H2O、0.5gNa2MoO4·2H2O、0.8gCuSO4·5H2O、2gFeSO4·7H2O、2gMnSO4·H2O、10gZnSO4·7H2O、5g EDTA）。根據(jù)實驗要求加入適量的阿特拉津原藥。配置固體培養(yǎng)基時加入適量的瓊脂粉。高溫滅菌備用。

1.4 降解菌的富集、馴化和分離 稱取5g土樣加入到100mL含有以阿特拉津作為唯一碳氮源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，阿特拉津初始濃度為50mg/L，置于搖床中，黑暗下，30℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)7d，然后吸取10mL培養(yǎng)液，接種到含有更高濃度阿特拉津的無機鹽液體培養(yǎng)基中。每次富集培養(yǎng)中設(shè)置的阿特拉津濃度均較前次增加50mg/L，直至培養(yǎng)基中阿特拉津的濃度達到500mg/L。將富集的菌群液部分在-80℃保存，其余用于后續(xù)試驗。將最終富集的菌群液分別稀釋10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍，然后用涂布器將稀釋的菌液涂布到以200mg/L阿特拉津作為碳氮源的無機鹽固體培養(yǎng)基中，5d之后挑取顏色、形態(tài)不相同并且周圍出現(xiàn)透明圈的菌落進行純化。將純化后菌株接種于以200mg阿特拉津作為唯一碳氮源的無機鹽固體平板上，對其降解阿特拉津能力進行驗證。

1.5 降解菌株鑒定

1.5.1 菌株生理生化特征鑒定 將多次純化的菌株MSD6，參照《常見細菌鑒定手冊》對其進行生理生化特性鑒定[7]。

1.5.2 分子鑒定 以菌株MSD6的基因組DNA為模板，對其16S rRNA基因進行克隆和分析。16S rRNA的PCR引物為：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1541R：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。PCR擴增條件為：94℃，5min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，共30個循環(huán)；最后72℃，10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收后與pMD18-T Vextor連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，用載體通用引物驗證后送至擎科公司測定全長序列。序列在NCBI網(wǎng)站進行Blastn比對，然后利用MEGA6.0軟件中的鄰近法（Neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1000次重抽樣評估，其他參數(shù)為默認值。

1.6 分離菌株在含有阿特拉津培養(yǎng)基中的生長特性測定 將分離的菌株MSD6接種至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)24h，然后將菌液8000r/min離心10min，棄上清，收集菌體，用無菌水配制成菌懸液（OD600=0.1）。將菌株MSD6的菌懸液（OD600=0.1）按1%接種量分別接種到LB培養(yǎng)基和含有200mg阿特拉津的無機鹽培養(yǎng)基中，30℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)，每間隔4h取樣1次，測定培養(yǎng)液的OD600值，以培養(yǎng)時間作為橫坐標，OD值作為縱坐標，做出4株菌的生長曲線。

1.7 不同培養(yǎng)條件對菌株MSD6生長和降解阿特拉津的影響 培養(yǎng)基初始pH值設(shè)置為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等6個處理；鹽濃度處理分別設(shè)置5個NaCl質(zhì)量分數(shù)（1%、2%、4%、6%、8%）。將菌株MSD6的菌懸液（OD600=0.1）接種到含有100mg阿特拉津的無機鹽液體培養(yǎng)基中，接種量為1%菌懸液。在黑暗下，30℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)48h后取樣，測定菌株的生物量和培養(yǎng)液中的阿特拉津含量。生長量測定采用OD600值法。阿特拉津測定參考王靜等的方法[8]。溫度條件設(shè)置為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃共6個處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿特拉津降解菌株的鑒定 經(jīng)過63d的富集培養(yǎng)，將富集液梯度稀釋后涂布于含有200mg阿特拉津的LB固體平板上，培養(yǎng)后，挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落，經(jīng)純化后的菌株MSD6再次接種到含有200mg阿特拉津作為唯一碳氮源的無機鹽培養(yǎng)平板上，接種24h后菌落周圍的阿特拉津大部分被降解（圖1）。這一結(jié)果說明，菌株MSD6能夠以阿特拉津作為唯一碳氮源進行生長。

生理生化鑒定結(jié)果表明，菌株MSD6為革蘭氏陽性。在糖類利用方面，菌株MSD6的甘露糖和半乳糖利用為陰性，淀粉水解不確定。菌株MSD6不能水解明膠，不產(chǎn)生硫化氫，并且菌株MSD6的乙二酰、甲基紅和脂類水解等實驗也均為陰性，其他測試指標均呈陽性（表1）。利用PCR擴增獲得菌株MSD6的16S rRNA基因序列，其長度為1430bp（GenBank登錄號為MH698840）。通過NCBI的BLAST比對結(jié)果表明，菌株MSD6的16S rRNA基因序列與多株節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）的同源性在98%以上。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，菌株MSD6與節(jié)桿菌屬菌株THG-LS114親緣關(guān)系最近，它們在同一聚類分支（圖2）。結(jié)合菌株MSD6生理生化特性和分子鑒定結(jié)果，確定菌株MSD6為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）。

2.2 阿特拉津降解菌株的生長曲線 由圖3可以看出，菌株MSD6在LB培養(yǎng)基明顯較在以阿特拉津為唯一碳氮源的無機鹽培養(yǎng)基中的生長速度快，但菌株MSD6在2種培養(yǎng)基中的生長曲線的變化趨勢較為相似。在LB培養(yǎng)基中，在0～12h期間菌株MSD6生長緩慢，為調(diào)整期；12～36h期間各菌株的生長呈對數(shù)增長，為對數(shù)生長期；培養(yǎng)36h后菌株生長相對平穩(wěn)，為穩(wěn)定期。在以阿特拉津為唯一碳氮源的無機鹽培養(yǎng)基中，在0～24h期間菌株MSD6生長緩慢，為調(diào)整期；24～72h期間菌株的生長亦呈對數(shù)增長，為對數(shù)生長期；培養(yǎng)72h后菌株的生長均進入穩(wěn)定期。

2.3 培養(yǎng)基初始pH對菌株MSD6生長和降解阿特拉津特性的影響 由圖4可知，培養(yǎng)基初始pH值對菌株MSD6生長和降解阿特拉津能力有較大影響，并且菌株MSD6對酸堿環(huán)境有一定的耐受性。此外，從圖4的數(shù)據(jù)還可以看出，菌株MSD6對堿性環(huán)境的耐受性稍強于對酸性環(huán)境的耐性。在pH4～5條件下，菌株MSD6培養(yǎng)液的OD600值分別為0.206和0.226，阿特拉津的含量分別為89.564mg/L和78.336mg/L；而在pH9～10的培養(yǎng)條件下的OD600值分別為0.386和0.208，阿特拉津的含量分別為69.113mg/L和80.882mg/L。菌株MSD6生長最適宜pH值為6～7，在此酸堿度下其降解阿特拉津能力也最強。在pH為6～7時，菌株MSD6培養(yǎng)液中阿特拉津含量分別為10.861mg/L和9.341mg/L。

2.4 培養(yǎng)溫度對菌株MSD6生長和降解阿特拉津特性的影響 從圖5可知，菌株MSD6生長的最適溫為30℃，并且其對高溫相對更為敏感。菌株在30℃培養(yǎng)溫度下，其生長量最大，生長量OD600值為1.035，并且降解阿特拉津能力最強，培養(yǎng)液中阿特拉津含量僅為9.141mg/L，降解率為90.859%。當(dāng)培養(yǎng)溫度超過35℃時，菌株MSD6的生長速度和阿特拉津降解能力均大幅度降低。在35℃培養(yǎng)條件下，菌株MSD6的生長量OD600值為0.603，較最高值降低了41.74%，培養(yǎng)液中的阿特拉津含量為43.067mg/L。當(dāng)培養(yǎng)溫度達到45℃時，菌株MSD6生長極為緩慢，其生長量OD600值為0.066，培養(yǎng)液中的阿特拉津含量為93.853mg/L，僅降解了6.147%。

2.5 NaCl對菌株MSD6生長和降解阿特拉津特性的影響 從圖6可以看出，菌株MSD6對低鹽脅迫有一定的適應(yīng)性，而高鹽脅迫則明顯抑制菌株MSD6的生長和降解阿特拉津的能力。1%NaCl處理對菌株MSD6的生長速度和阿特拉津降解能力無顯著影響，菌株MSD6的生長量和阿特拉津降解率與無NaCl處理相近。當(dāng)NaCl濃度達到2%時，菌株MSD6的生長量和阿特拉津降解率僅有小幅度降低，但其降解率仍達到84%以上。在4%NaCl濃度下，菌株的生長量OD600值仍達到了0.455，阿特拉津降解率也達到了40%以上。但NaCl濃度達到6%以上時，菌株MSD6的生長量和阿特拉津降解率大幅度降低。當(dāng)NaCl濃度達到8%時，其生長量OD600值和降解率僅為0.096和5.1%。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論 研究篩選出1株能高效降解阿特拉津的菌株MSD6（GenBank登錄號為MH698840）。該菌株能夠以阿特拉津作為唯一碳氮源生長，其對阿特拉津的降解率可達90%以上。菌株MSD6對酸堿環(huán)境均有一定的耐受性，其生長的適宜pH為6～7；在此pH范圍內(nèi)其生長量OD600值接近于1.00，阿特拉津降解率分別為89.14%和90.66%。菌株MSD6對高溫的耐受性較差，其最適宜的生長溫度為30℃，生長量OD600值為1.035，阿特拉津降解率為90.85%。菌株MSD6對NaCl具有較好的耐性。在4%NaCl條件下，菌株MSD6仍可較好的生長，阿特拉津的降解率為43.91%。研究結(jié)果表明，菌株MSD6具有較好的應(yīng)用和開發(fā)潛力。

3.2 討論 節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）是土壤中較為常見的細菌種類，其不僅是土壤有機物的主要分解者，而且也能降解多種環(huán)境污染物。目前已報道的阿特拉津降解菌中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）占較大的比例。研究分離的菌株MSD6能夠以阿特拉津作為唯一碳氮源生長，并且該菌株對阿特拉津有較高的降解能力。菌株MSD6在48h內(nèi)對阿特拉津的降解率可達到90%以上。雖然目前已報道了多株可降解阿特拉津的節(jié)桿菌屬菌株，但菌株MSD6的生理生化特征與它們有較大差異。菌株MSD6革蘭氏染色顯陽性，而菌株FM362[9]和AT2[10]為陰性。在碳源利用上，菌株MSD6可以利用乳糖和麥芽糖，而菌株T3AB1則不能以這兩種糖作為其碳源[11]。菌株MSD6的甲基紅試驗為陰性，檸檬酸利用為陽，而菌株AT1恰好與MSD6相反[12]。菌株MSD6蔗糖利用為陽性，不產(chǎn)生H2S，淀粉水解不明確，而菌株Z42的蔗糖利用為陰性，可產(chǎn)生H2S，淀粉水解為陽性[13]。菌株MSD6吲哚實驗為陽性，乙二酰實驗為陰性。洪青等分離的菌株X-4則表現(xiàn)為吲哚陰性和乙二酰陽性[14]。菌株AG1[15]和菌株ADH2[16]能液化明膠，但AG1不能水解淀粉而ADH2可水解淀粉，而菌株MSD6則顯現(xiàn)出水解淀粉不確定及明膠液化陰性的特征。菌株MSD6的脲酶實驗為陽性，而楊合同等[17]篩選的菌株SD41則顯示出脲酶實驗陰性。這些結(jié)果表明，菌株MSD6與上述菌株應(yīng)為節(jié)桿菌屬中的不同近源種。

雖然菌株MSD6顯示出較高的阿特拉津降解能力，但對其降解代謝的機制還并不清楚。根據(jù)之前的研究報道，微生物降解阿特拉津主要受基因調(diào)控，但不同屬種間差異較大。在假單胞菌Pseudomonas sp. ADP中，阿特拉津降解是受基因atzA、atzB、atzC、atzD、atzE和atzF調(diào)控[18]，而菌株P(guān)seudomonas sp. D3-1l中參與阿特拉津降解的基因只有atzA、atzB和atzC[19]。節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）中調(diào)控降解阿特拉津的基因通常為trzN、atzB和atzC，如A. aurescens TC1[20]和A. histidinolovorans KU001[21]，而菌株Arthrobacter sp. D6r1-2則只含有trzN和atzC[19]。因此，探索菌株MSD6阿特拉津降解基因?qū)⑹呛罄m(xù)研究的一個方向。

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（責(zé)編：徐世紅）