雷替曲塞聯(lián)合X線照射對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2的協(xié)同作用

王 抒， 李 軒， 喬田奎

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤科，上海 201508

雷替曲塞聯(lián)合X線照射對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2的協(xié)同作用

王 抒， 李 軒， 喬田奎*

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤科，上海 201508

目的探討雷替曲塞與X射線對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2的協(xié)同作用及其潛在機(jī)制。方法CCK-8法檢測(cè)不同濃度雷替曲塞對(duì)Hep-2細(xì)胞活力的影響。將Hep-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、雷替曲塞組、照射組、雷替曲塞+照射組。單擊多靶模型繪制細(xì)胞存活曲線，檢測(cè)4組細(xì)胞存活情況及放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)4組Hep-2細(xì)胞凋亡情況和周期改變。結(jié)果雷替曲塞能抑制Hep-2細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性(P<0.05)。單擊多靶模型顯示，雷替曲塞平均致死劑量下SER為1.272。雷替曲塞能顯著增加細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯(P<0.05)。結(jié)論雷替曲塞能協(xié)同X線對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2的抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增加細(xì)胞G2/M期阻滯有關(guān)。

雷替曲塞；X線；Hep-2細(xì)胞；凋亡；細(xì)胞周期

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤之一。LSCC占頭頸部上皮細(xì)胞來源惡性腫瘤的第2位，具有高度侵襲性，患者5年總生存率(overall survival，OS)約為61%[1-2]。近年來，對(duì)于喉癌的治療，臨床醫(yī)師和患者越來越重視對(duì)喉部結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)。放射治療是治療喉癌的重要手段之一。對(duì)于早期喉癌患者，根治性放療的效果與手術(shù)療效相當(dāng)[3]。對(duì)于局部晚期喉癌患者，放療是手術(shù)后治療的重要手段[4]。對(duì)于無法行手術(shù)切除的喉癌患者或患者有強(qiáng)烈保喉意愿時(shí)，可采用放化療聯(lián)合治療[5-6]。然而，由于喉癌細(xì)胞對(duì)射線的抵抗性，往往導(dǎo)致放療失敗，引起腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[7]。因此，尋找有效的放射增敏劑是多年來腫瘤領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

雷替曲塞是與喹唑啉葉酸化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS)的特異性抑制劑，近年應(yīng)用于多種實(shí)體腫瘤。在體內(nèi)，雷替曲塞可以代謝成一系列多聚谷氨酸化合物，這些代謝物具有更強(qiáng)的TS抑制作用[8]。由于雷替曲塞與5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)具有相似的作用機(jī)制，因此雷替曲塞的應(yīng)用范圍較廣，在結(jié)直腸癌[9]、胃癌[10]、食管癌[11]、頭頸部惡性腫瘤[12]和惡性間皮瘤[13]等的治療中均取得了肯定療效。但雷替曲塞聯(lián)合放療在喉癌治療中的作用目前尚不明確。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，探討雷替曲塞協(xié)同X線照射對(duì)喉癌細(xì)胞的抑制作用，為其臨床聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人喉癌細(xì)胞系購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Chinese Type Culture Collection，CTCC)。雷替曲塞由南京正大天晴制藥有限公司提供。細(xì)胞培養(yǎng)基MEM和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國(guó)Gibco公司。Annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒均購自美國(guó)BD公司。CCK-8試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2細(xì)胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)消化傳代，選取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞照射 應(yīng)用美國(guó)Varian直線加速器，劑量率為2 Gy/min。X線能量為6 MV，源皮距100 cm。細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn)照射劑量依次為2、4、6、8、10 Gy，其余實(shí)驗(yàn)照射劑量均為10 Gy。

1.4 細(xì)胞增殖活力的測(cè)定 在96孔板中接種指數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)為6×103。加入終濃度分別為0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL的雷替曲塞，均分別培養(yǎng)24、48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光反應(yīng)3 h，振勻后用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)光密度(optical density,D)值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。細(xì)胞活力(%)=(處理孔D-空白對(duì)照D) /(對(duì)照孔D-空白對(duì)照D)×100%。

1.5 細(xì)胞分組 將Hep-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、雷替曲塞組(RTX 組)、照射組(IR組)和雷替曲塞加照射組(RTX+IR組)。根據(jù)細(xì)胞活力的檢測(cè)結(jié)果，RTX組和RTX+IR組照射前加入不影響細(xì)胞活力濃度的雷替曲塞。

1.6 細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn) IR組、RTX+IR組分別給予0、2、4、6、8、10 Gy的X線照射后，立即將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并以500～3 000個(gè)/皿[14]接種到60 mm2培養(yǎng)皿中。孵育14 d后，將菌落用甲醇固定，結(jié)晶紫染色。使用顯微鏡計(jì)數(shù)染色的集落數(shù)(每個(gè)集落不少于50個(gè)細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次?？寺⌒纬陕?plating efficiency，PE)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) ×100%，細(xì)胞生存分?jǐn)?shù)(survival fraction，SF)=(處理組PE/對(duì)照組PE)×100%。用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線計(jì)算各組平均致死劑量(mean death dose，D0)、準(zhǔn)閾劑量(quasi-threshold dose,Dq)及增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 六孔板指數(shù)生長(zhǎng)的Hep-2細(xì)胞分組處理同上，照射后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，用胰酶消化并收集各組細(xì)胞(包括上清液中的細(xì)胞)，冷PBS清洗2遍，加100 μL緩沖液重懸，再加入Annexin Ⅴ和碘化丙啶(PI)溶液各5 μL，混勻，室溫避光孵育15 min后加入300 μL緩沖液，用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞周期檢測(cè) Hep-2細(xì)胞分組處理同上，照射后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，用胰酶消化，收集各組細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞用70%冷乙醇在-20℃下固定過夜，避光將細(xì)胞加入含有50 μL/mL的RNase酶和50 μL/mL PI染色液，室溫避光孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相所占比例。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 雷替曲塞對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖活力的影響 用不同濃度雷替曲塞(0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL)處理Hep-2細(xì)胞后，細(xì)胞活力被抑制，并呈劑量依賴性(P<0.05)；隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活力進(jìn)一步下降(P<0.05，圖1)。

2.2 雷替曲塞對(duì)Hep-2細(xì)胞克隆形成的影響 雷替曲塞(0.1 μg/mL)聯(lián)合X線(2、4、6、8、10 Gy)照射后， 細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯低于相應(yīng)劑量的接受單純照射的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(P<0.05，圖2)；RTX+IR組存活曲線肩區(qū)較IR組變窄(圖2)，SERD0為1.272(表1)。

圖1 雷替曲塞對(duì)Hep-2細(xì)胞活力的影響

圖2 雷替曲塞對(duì)Hep-2細(xì)胞克隆形成的影響

表1 雷替曲塞聯(lián)合X線照射與單純X線照射組各放射參數(shù)值的比較

*外推值，細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵靶的數(shù)目或1個(gè)靶所需擊中的次數(shù)

2.3 細(xì)胞凋亡 處理24 h后，對(duì)照組、RTX 組、IR組、RTX+IR組細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P<0.05)；處理48 h后，對(duì)照組、RTX 組、IR組、RTX+IR組細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P<0.05)。其中，RTX+IR組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組、IR組升高(P<0.01，圖3)。

2.4 細(xì)胞周期 處理24 h后，對(duì)照組、RTX組、IR組、RTX+IR組的細(xì)胞周期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；處理48 h后，對(duì)照組、RTX組、IR組、RTX+IR組的細(xì)胞周期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，RTX+IR組與對(duì)照組、IR組相比，G2/M期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.001，圖4)。

圖3 不同組別細(xì)胞處理24、48 h后凋亡率比較

圖4 不同組別細(xì)胞各細(xì)胞周期比例的比較

3 討 論

雷替曲塞為新型水溶性TS特異性選擇性抑制劑。其作用機(jī)制為：通過還原型葉酸載體(reduced folate carrier，RFC)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，被葉酰多聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS)代謝為多聚谷氨?；衔锖?，選擇性抑制TS，進(jìn)而干擾DNA合成，導(dǎo)致DNA斷裂和細(xì)胞死亡，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用[8]。

雷替曲塞問世早期主要用以治療結(jié)直腸癌，目前研究顯示其對(duì)多種實(shí)體腫瘤均具有抗腫瘤活性[9-13]。雷替曲塞聯(lián)合奧沙利鉑在晚期結(jié)直腸癌中較5-Fu更具優(yōu)勢(shì)[15]；雷替曲塞聯(lián)合奈達(dá)鉑使晚期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性咽喉癌患者總生存時(shí)間延長(zhǎng)[12]；雷替曲塞聯(lián)合卡鉑對(duì)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性頭頸鱗癌患者有效率約53%[16]。雷替曲塞不僅用于腫瘤化療，還可聯(lián)合靶向或放射治療。James等[17]進(jìn)行的Ⅰ期臨床研究顯示，對(duì)于不可切除或復(fù)發(fā)性直腸癌，雷替曲塞聯(lián)合放療有顯著療效。在鼻咽癌[18]及食管鱗癌[19]中，雷替曲塞聯(lián)合放療不良反應(yīng)較輕，治療效果確切。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)揭示了雷替曲塞能協(xié)同X線照射對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞Hep-2的抑制作用。本研究中，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖活力不斷下降。與對(duì)照組相比，雷替曲塞為0.1 μg/mL時(shí)才對(duì)細(xì)胞增殖活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故本實(shí)驗(yàn)SER研究中采用此濃度。

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是公認(rèn)的驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞放射敏感性的“金標(biāo)準(zhǔn)”[20]。本研究結(jié)果提示，雷替曲塞聯(lián)合放療能顯著減少Hep-2細(xì)胞的克隆形成數(shù)目。單純放療及聯(lián)合治療時(shí)的D0值分別為1.962、1.542 Gy，聯(lián)合治療的SER為1.272，提示在放療之前使用雷替曲塞可提高Hep-2細(xì)胞株對(duì)放療的敏感性。

細(xì)胞凋亡是放射殺死腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要途徑。腫瘤細(xì)胞放射敏感性與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，凋亡率的增加提示細(xì)胞有更大的放射敏感性[21]。本研究顯示，低濃度的雷替曲塞對(duì)喉癌細(xì)胞凋亡率沒有明顯影響，但RTX+IR組較IR組凋亡率升高。

腫瘤細(xì)胞放射敏感性在細(xì)胞周期的不同時(shí)相有很大差別，G2/M期細(xì)胞放射敏感性較G1或S期高；影響細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)或周期蛋白表達(dá)均會(huì)改變腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[22]。因此，腫瘤細(xì)胞的G2/M期阻滯也是提高放射敏感性的重要途徑。本研究顯示，RTX+IR組較IR組S期細(xì)胞比例降低，并出現(xiàn)明顯的G2/M期停滯，提示雷替曲塞能提高喉癌細(xì)胞的放射敏感性。

放射抵抗是導(dǎo)致腫瘤放療失敗的關(guān)鍵因素之一，可能導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證明，雷替曲塞能協(xié)同X線對(duì)人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞的抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增加G2/M期阻滯有關(guān)，為雷替曲塞聯(lián)合放射治療在喉癌治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究只涉及了體外研究，相關(guān)體內(nèi)試驗(yàn)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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ThesynergisticeffectofraltitrexedcombinedwithX-rayradiationonhumanlaryngealcancerHep-2cells

WANG Shu, LI Xuan, QIAO Tian-kui*

Department of Oncology, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China

Objective： To investigate the synergistic effect of raltitrexed combined with radiotherapy on Hep-2 cells and its potential mechanism.MethodsCCK-8 assay was used to determine the cell viability after Hep-2 cells were treated with different concentrations of raltitrexed. Hep-2 cells were randomly divided into the control group, the raltitrexed group, the radiation group, and raltitrexed + radiation group. Cell survival curves were fitted with a single-hit multi-target model, cell viability and sensitization enhancement ratio(SNR) of the 4 groups were detected, and apoptosis and cycle changes of Hep-2 cells in 4 groups were detected by flow cytometry.ResultsCCK-8 assay proved that raltitrexed could suppress cell viability in a dose-dependent manner. The single-hit multi-target model showed that the SER of mean death dose (D0) was 1.272.Furthermore, the apoptosis rate and the number of Hep-2 cells at G2/M phase were significantly increased in the group treated with the combination of raltitrexed and X-ray as compared to the group treated with X-ray alone (P<0.05).ConclusionsThe inhibitory effect of raltitrexed combined with X-ray on human laryngeal cancer Hep-2 cells may be related to the induction of tumor cell apoptosis and the increase of G2/M phase arrest.

raltitrexed; X-ray; Hep-2 cells; apoptosis; cell cycle

2017-06-17接受日期2017-08-21

上海市金山區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)青年項(xiàng)目(JSKJ-KTQN-2014-01).Supported by the Jinshan District Health and Family Planning Commission Project in Shanghai (JSKJ-KTQN-2014-01).

王 抒，碩士，主治醫(yī)師. E-mail：wshu830821@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel：021-57039590, E-mail：qiaotk@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170522

R 739.65

A

[本文編輯] 姬靜芳