槲皮素對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響①

閆斌，王靖博，張宏，田國(guó)慶，劉玉琴

槲皮素對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響①

閆斌1，王靖博1，張宏2，田國(guó)慶1，劉玉琴2

目的探討槲皮素對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡影響的可能作用機(jī)制。方法新生24 h Sprague-Dawley大鼠，取海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，分為正常對(duì)照組、高糖組、槲皮素組、槲皮素+Akt抑制劑組和Akt激動(dòng)劑組。各組在不同條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blotting檢測(cè)各組神經(jīng)元p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)，p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明顯減少(P＜0.01)；與高糖組比較，槲皮素組、Akt激動(dòng)劑組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.01)，p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明顯升高(P＜0.01)。與槲皮素+Akt抑制劑組比較，槲皮素組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.01)，p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明顯升高(P＜0.01)。結(jié)論槲皮素能夠減少高糖培養(yǎng)下海馬神經(jīng)元的凋亡，其作用機(jī)制與增加Akt信號(hào)通路中Akt蛋白磷酸化的程度，進(jìn)而增加Bcl-2蛋白的表達(dá)、抑制Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。

槲皮素；蛋白激酶B；高糖；海馬神經(jīng)元；凋亡；大鼠

隨著世界糖尿病患病率逐年增加，糖尿病慢性并發(fā)癥給患者和社會(huì)帶來(lái)的負(fù)擔(dān)日益沉重，其中糖尿病認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重影響患者的學(xué)習(xí)記憶能力和執(zhí)行功能，受到越來(lái)越多的重視。關(guān)于糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為與高濃度的血糖水平在大腦神經(jīng)元中通過(guò)滲透壓的改變、氧化應(yīng)激、慢性高血糖導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products,AGEs)等多種機(jī)制[1]，造成神經(jīng)元損傷、海馬體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化有關(guān)[2]。這被認(rèn)為是2型糖尿病患者較非糖尿病患者形成認(rèn)知障礙、腦萎縮風(fēng)險(xiǎn)更高的原因之一。

菟絲子是臨床常用治療糖尿病認(rèn)知功能障礙的藥物，槲皮素(quercetin)是菟絲子的有效成分。本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元為靶細(xì)胞，觀察槲皮素對(duì)高糖環(huán)境下海馬神經(jīng)元凋亡及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p-Akt、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)表達(dá)的影響，以期探討槲皮素對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)新生24 h Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量4～6 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2009-0004。

1.2 主要試劑與設(shè)備

槲皮素，分子式C15H10O7，分子量302.24，純度99.1%，批號(hào)100081-201610：中國(guó)食品藥品檢定研究院。Akt信號(hào)通路抑制劑MK-2206 2HCl，分子式C25H21N5O·2HCl，分子量480.39，純度99.91%，貨號(hào)S1078：美國(guó)SELLECK公司。Akt信號(hào)通路激動(dòng)劑SC79，分子式C17H17ClN2O5，分子量364.78，純度＞97%，貨號(hào)S7863：美國(guó)SELLECK公司。葡萄糖(Glu)：北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。DMEM-高糖、PBS：北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。Neurobasal?-A、B-27?Serum-Free Supplement：美國(guó) GIBCO 公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋公司。

Fresco冷凍離心機(jī)：美國(guó)THERMO公司。TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。電泳儀、蛋白濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀：美國(guó)BIO-RAD公司。ImageQuant LAS 4000mini凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)GE公司。

1.3 方法

1.3.1主要溶液、試劑的配置

DMEM完全培養(yǎng)基：DMEM-高糖培養(yǎng)基180 ml加入胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(終濃度10%)、谷氨酰胺2 mmol/L、丙酮酸鈉1 mmol/L、Hepes 20 mmol/L、雙抗(青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)10 ng/ml，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Neurobasal+B27培養(yǎng)基：Neurobasal?-A培養(yǎng)基100 ml加入B-27添加劑及L-谷氨酞胺(終濃度1 mmol/L)溶液2 ml混合均勻，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

槲皮素儲(chǔ)存液：微量天平稱取槲皮素15.11 mg，溶于DMSO 2.5 ml，充分混勻，0.22 μm濾器過(guò)濾，終濃度20 mmol/L，-20℃避光保存。

MK-2206 2HCl儲(chǔ)存液：微量天平稱取MK-2206 2HCl 5 mg，溶于DMSO 2.08 ml，充分混勻，0.22 μm濾器過(guò)濾，終濃度5 mmol/L，-20℃避光保存。

SC79儲(chǔ)存液：微量天平稱取SC79 5 mg，溶于DMSO 1.37 ml充分混勻，0.22 μm濾器過(guò)濾，終濃度10 mmol/L，-20℃避光保存。使用時(shí)用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋儲(chǔ)存液至需要濃度。

1.3.2分組

正常對(duì)照組：Neurobasal+B27完全培養(yǎng)基(含25 mmol/L葡萄糖)。高糖組：在Neurobasal+B27完全培養(yǎng)基中添加葡萄糖，使培養(yǎng)基中葡萄糖終濃度為50 mmol/L。槲皮素組：高糖組培養(yǎng)基+0.01 μmol/L槲皮素。槲皮素+Akt抑制劑組：高糖組培養(yǎng)基+0.01 μmol/L 槲皮素+0.3 μmol/L MK-2206 2HCl。Akt激動(dòng)劑組：高糖組培養(yǎng)基+5 μmol/L SC79。

1.3.3海馬神經(jīng)元的分離、純化與培養(yǎng)

出生24 h新生鼠，75%酒精浸泡5 min，取出后置-20℃約3～5 min，分離腦內(nèi)兩側(cè)海馬組織；用D-Hank氏液沖洗2次后將組織剪碎至0.5～1.0 mm3，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化約20 min；觀察液體呈一定懸濁度即加入FBS終止消化，用200目細(xì)胞篩過(guò)篩，收集細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液小心加入15 ml離心管中淋巴細(xì)胞分離液(與細(xì)胞懸液的比例1∶1.6)的上層，2000 r/min離心20 min，收集細(xì)胞層細(xì)胞；用D-Hank氏液重懸細(xì)胞，1500 r/min再次離心5 min；棄上清，用DMEM完全培養(yǎng)基30 ml重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按一定的細(xì)胞密度接種于多聚賴氨酸(Poly-D-lysine,PDL)包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。

1.3.4海馬神經(jīng)元的鑒定

將細(xì)胞懸液以5×105/孔的濃度接種到預(yù)先放置了蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)72 h取出蓋玻片進(jìn)行免疫熒光鑒定，共聚焦激光顯微鏡檢測(cè)非特異性酯酶(nonspecial esterase,NSE)的表達(dá)。取出蓋玻片，0.01 mmol/L PBS浸洗后加入4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛常溫固定1 h；0.01 mmol/L PBS漂洗2 min，共3次，加入0.1%Triton-X100浸泡10 min；0.01 mmol/L PBS清洗2 min，共3次，加入山羊血清封閉液與非特異性蛋白結(jié)合，室溫孵育20 min；加入兔抗鼠NSE多克隆抗體(1∶10)，濕盒內(nèi)37℃孵育1 h，陰性對(duì)照組以0.01 mmol/L PBS代替一抗；0.01 mmol/L PBS清洗2 min，共3次，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶聯(lián)山羊抗兔IgG(1∶50)，37℃濕盒避光孵育1 h；0.01 mmol/L PBS振洗5 min，共6次，加入苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)工作液封片；使用共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，所攝圖像以Leica Confocal圖像分析軟件分析，每組計(jì)數(shù)15～20個(gè)細(xì)胞。

1.3.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡率

將細(xì)胞懸液以1.5×106/瓶的密度接種到預(yù)先用0.01%PDL包被的T25培養(yǎng)瓶中，每瓶接種6 ml。細(xì)胞生長(zhǎng)至72 h，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分組，更換不同條件的培養(yǎng)基。72 h時(shí)棄掉原培養(yǎng)基，用D-Hank氏液輕輕清洗1次，棄上清。每個(gè)培養(yǎng)瓶加入0.05%胰酶-EDTA 3 ml，37℃消化約1 min。倒置相差顯微鏡下觀察，部分細(xì)胞突觸連接消失，細(xì)胞呈小圓形，浮起，即用吸管輕輕吹打細(xì)胞，加入FBS 1 ml終止消化，并將細(xì)胞懸液吸入15 ml離心管中。800 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS 5 ml，重懸細(xì)胞。800 r/min再次離心5 min，棄上清。按照Annexi n-V-FLUOS試劑盒的說(shuō)明，避光配置反應(yīng)液。每組加入反應(yīng)液100 μl，正常對(duì)照組另設(shè)立3個(gè)陰性對(duì)照組，即分別加入Hepes、Annexin-V-Fluos、PI各100 μl。各組避光反應(yīng)15 min。每組加入PBS 1 ml，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組神經(jīng)元，記錄結(jié)果。

1.3.6 Western blotting檢測(cè)p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

將待檢測(cè)的各組細(xì)胞樣本加入預(yù)冷RIPA裂解液，冰上孵育20 min，離心取上清，按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒的使用方法計(jì)算出各組蛋白濃度；根據(jù)目的蛋白的分子量加入等量2×SDS-PAGE加樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白充分變性；冷卻樣品后，按順序?qū)⑻幚砗玫臉悠芳尤霛饪s膠加樣孔內(nèi)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離蛋白；使用濕轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果，對(duì)照marker，剪出膜上的目的蛋白及內(nèi)參蛋白β-actin的條帶；將膜完全浸泡于3%BSA-TBST中，搖床上室溫封閉30 min，TBST洗膜；按照1∶1000稀釋一抗(p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax 和 β-actin)，將膜的封閉液吸盡后，立即加入稀釋好的一抗，室溫?fù)u床上緩慢搖動(dòng)孵育40 min，4℃過(guò)夜；第二天將膜室溫放置30 min，TBST洗膜3次，5%脫脂奶粉-TBST按1∶1000稀釋HRP山羊抗兔IgG(H+L)，加入二抗稀釋液，室溫輕搖40 min。將ECL發(fā)光液加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光10～300 s，顯影2 min，定影。所攝圖像以LabWorks 4.6圖像分析軟件分析，記錄各組目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度掃描值，每組重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理。經(jīng)One Sample Kolmoglrov-SmimovZ檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用(xˉ±s)進(jìn)行描述。多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元純度

NSE免疫熒光染色，倒置相差顯微鏡下觀察，所有細(xì)胞的胞核均被染成藍(lán)色，即該視野下細(xì)胞總數(shù)，胞漿和突起被染成綠色者為陽(yáng)性細(xì)胞，即神經(jīng)元(見(jiàn)圖1)。在共聚焦激光掃描顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，計(jì)算該視野下神經(jīng)元和細(xì)胞總數(shù)

隨機(jī)取5個(gè)視野，經(jīng)鑒定神經(jīng)元純度為(96.5±1.2)%。

2.2 海馬神經(jīng)元凋亡率

與正常對(duì)照組比較，各組神經(jīng)元凋亡率均明顯增加(P＜0.01)；與高糖組比較，各組神經(jīng)元凋亡率均明顯減少(P＜0.01)；槲皮素+Akt抑制劑組神經(jīng)元凋亡率高于槲皮素組(P＜0.01)；與Akt激動(dòng)劑組比較，槲皮素組凋亡率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 各組神經(jīng)元凋亡率

2.3 海馬神經(jīng)元p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax的表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，各組p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明顯減少(P＜0.01)；與高糖組比較，槲皮素組、Akt激動(dòng)劑組p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax比值均明顯升高(P＜0.01)；與槲皮素組比較，槲皮素+Akt抑制劑組p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax的比值均明顯下降(P＜0.01)；與Akt激動(dòng)劑組比較，槲皮素組Bcl-2/Bax的比值減少(P＜0.05)，p-Akt/Akt的比值無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

3 討論

Akt又稱PKB，是一種相對(duì)分子量為60 kDa的絲/蘇氨酸蛋白激酶，與PKA和PKC均有較高的同源性，故又稱為PKA與PKC的相關(guān)激酶(related to the A and C kinase,RAC-PK)。該激酶被證明是v-Akt的編碼產(chǎn)物，故又稱Akt。Akt位于多條信號(hào)通路的交叉點(diǎn)，包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/Akt信號(hào)通路、Jak激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(just another kinase/signal transducer and activator of transcription,Jak/Stat)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad蛋白(transforming growth factor-β/drosophila mothers against decapentaplegic protein,TGF-β/Smad)信號(hào)通路等，影響著細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、增殖、凋亡、新陳代謝，提高細(xì)胞復(fù)制和存活能力，同時(shí)減弱生長(zhǎng)阻滯和細(xì)胞凋亡[3]。Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞周期和基因表達(dá)起著重要的調(diào)控作用；通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)[4]相互作用，對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖起著重要作用；激活的Akt信號(hào)通路通過(guò)抑制tau蛋白、Bax、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-9)[5-6]抑制細(xì)胞的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)；磷酸化的Akt還能下調(diào)叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1(Forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)的表達(dá)[7]，上調(diào)胰腺十二指腸同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX-1)的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)胰島β細(xì)胞再生。Akt信號(hào)通路受神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族(neurotrophic factors,NTFs)、張力蛋白同源10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)等影響，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[8-10]、代謝起著重要的作用。Akt信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor,FKHR)有助于提高細(xì)胞存活率，調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶體蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)有助于增加蛋白的合成，影響神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)和突觸可塑性的形成，這與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)[11]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在高糖環(huán)境下，Akt信號(hào)通路受到明顯抑制，因此，Akt信號(hào)通路可能是糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵通路。

表2 各組海馬神經(jīng)元p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax蛋白的灰度值以及p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax值(×10-2)

圖1 大鼠海馬神經(jīng)元(NSE免疫熒光染色，200×)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組神經(jīng)元凋亡

圖3 各組p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax和β-actin的Western blotting檢測(cè)結(jié)果

糖尿病認(rèn)知功能障礙在中醫(yī)屬消渴病并發(fā)“呆癥”“健忘”的范疇。《圣濟(jì)總錄》曾載“消渴日久，健忘怔忡”。消渴病本在腎，歷代醫(yī)家在針對(duì)消渴病治療時(shí)多以補(bǔ)腎填精益髓為法，應(yīng)用菟絲子、淫羊藿、女貞子、枸杞子、紅景天等藥物。菟絲子味甘，性溫，歸肝、腎、脾經(jīng)，屬補(bǔ)益藥，具有滋補(bǔ)肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子含有樹(shù)脂甙和糖類，主要有效成分包括槲皮素，紫云(astragalin)，金絲桃甙(hyperin)及槲皮素-3-O-β-D-半乳糖-7-O-β-葡萄糖甙[12]。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化[12]、抗腫瘤[13]、抗炎[14]、改善內(nèi)皮功能、抗血小板聚集、提高人體免疫力等多種生物活性[15-16]。

為了研究槲皮素對(duì)高糖導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)機(jī)制與Akt信號(hào)通路的關(guān)系，選取SC79作為陽(yáng)性對(duì)照組，MK-2206 2HCl作為Akt信號(hào)通路阻斷劑。SC79是能穿透血腦屏障的Akt磷酸化激活劑，具有降低神經(jīng)元興奮性毒性、增加神經(jīng)元存活的功能[17-18]；MK-2206 2HCl是Akt的高度選擇性抑制劑，屬于變構(gòu)抑制劑，能抑制Akt T308和S473的自身磷酸化，MK-2206 2HCl還防止Akt介導(dǎo)的下游信號(hào)分子磷酸化[19]。

根據(jù)課題組既往試驗(yàn)結(jié)果、查閱文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果[20-23]，設(shè)置各分組藥物濃度：槲皮素濃度0.01 μmol/L，Akt抑制劑濃度0.3 μmol/L，Akt激動(dòng)劑濃度5 μmol/L。流式細(xì)胞儀檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡率，與正常對(duì)照組比較，高糖組海馬神經(jīng)元凋亡率明顯增加；當(dāng)在高糖培養(yǎng)基中加入槲皮素、Akt激動(dòng)劑以后，凋亡率明顯下降，提示，槲皮素、Akt激動(dòng)劑可以抑制高糖導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡；當(dāng)槲皮素組中加入Akt抑制劑后，凋亡率明顯增加，槲皮素的抗細(xì)胞凋亡作用減弱，說(shuō)明在該通路受到特異性抑制后槲皮素的作用失去了發(fā)揮途徑。同時(shí)，槲皮素組、Akt激動(dòng)劑組的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者在改善高糖引起的海馬神經(jīng)元凋亡上的作用相似。Western blotting結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖組p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax明顯下降；與高糖組比較，槲皮素組、Akt激動(dòng)劑組p-Akt/Akt的表達(dá)均升高，提示槲皮素、Akt激動(dòng)劑可以逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)Akt蛋白磷酸化的抑制作用。進(jìn)一步檢測(cè)Akt信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子(Bcl-2、Bax)顯示，槲皮素組、Akt激動(dòng)劑組的Bcl-2/Bax都較高糖組升高；應(yīng)用Akt特異性抑制劑后，槲皮素組p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax明顯下降，提示在Akt信號(hào)通路被阻斷后，槲皮素提高p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用明顯減弱，可以推測(cè)，Akt信號(hào)通路是槲皮素的海馬神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制之一。此外，與Akt激動(dòng)劑組比較，槲皮素組p-Akt/Akt比值無(wú)顯著性差異，提示槲皮素逆轉(zhuǎn)高糖抑制Akt蛋白磷酸化的效果與SC79相似。

綜上所述，我們認(rèn)為，槲皮素能夠減輕高糖培養(yǎng)下海馬神經(jīng)元的凋亡，其作用機(jī)制與增加Akt信號(hào)通路中Akt蛋白磷酸化的程度，進(jìn)而增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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Effects of Quercetin on Expression of Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax and Apoptosis of Hippocampal Neurons Cultured in High Glucose

YAN Bin1,WANG Jing-bo1,ZHANG Hong2,TIAN Guo-qing1,LIU Yu-qin2
1.Department of Traditional Chinese Medicine,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730,China;2.Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730,China

TIAN Guo-qing.E-mail:gq-tian@163.com

ObjectiveTo explore the possible mechanism of quercetin on apoptosis of hippocampal neurons cultured in high glucose.MethodsHippocampus was obtained from newborn 24 hours Sprague-Dawley rats and then primarily cultured.Then hippocampal neurons were divided into normal control group,high glucose group,quercetin group,quercetin+Akt inhibitor group and Akt agonist group.After each group was cultured in different conditioned medium for 72 hours,they were detected the apoptosis of neurons with flow cytometry,and the expression of Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax with Western blotting.ResultsCompared with the normal control group,the apoptosis rate of hippocampal neurons increased significantly(P＜0.01),and p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax decreased significantly(P＜0.01)in the high glucose group.Compared with the high glucose group,the apoptosis rates of hippocampal neurons decreased significantly(P＜0.01),and p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax increased significantly(P＜0.01)in the quercetin group and the Akt agonist group.Compared with the quercetin+Akt inhibitor group,the apoptosis rate of hippocampal neurons decreased significantly(P＜0.01),and p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax increased significantly(P＜0.01)in the quercetin group.ConclusionQuercetin could reduce the apoptosis of hippocampal neurons cultured in high glucose,which may be achieved by increasing the phosphorylation of Akt protein in Akt signal pathway,and then increasing the expression of Bcl-2 and inhibiting the expression of Bax.

quercetin;protein kinase B;high glucose;hippocampal neurons;apoptosis;rats

R587.1

A

1006-9771(2017)12-1390-07

[本文著錄格式]閆斌，王靖博，張宏，等.槲皮素對(duì)高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(12):1390-1396.

北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項(xiàng)目(No.JJ2015-68)。

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京市100730；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京市100730。作者簡(jiǎn)介：閆斌(1991-)，男，漢族，山西新絳縣人，碩士研究生，主要研究方向：糖尿病及其慢性并發(fā)癥的中西醫(yī)結(jié)合防治。王靖博(1989-)，男，漢族，河南內(nèi)鄉(xiāng)縣人，碩士，主要研究方向：糖尿病及其慢性并發(fā)癥的中西醫(yī)結(jié)合防治。閆斌和王靖博為共同第一作者。通訊作者：田國(guó)慶，男，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：糖尿病及其慢性并發(fā)癥的中西醫(yī)結(jié)合防治。E-mail:gq-tian@163.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.12.005

CITED AS:Yan B,Wang JB,Zhang H,et al.Effects of quercetin on expression of Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax and apoptosis of hippocampal neurons cultured in high glucose[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(12):1390-1396.

2017-08-21

2017-10-11)