牛乳中黃曲霉毒素B1和M1檢測(cè)方法的比較

羅昱芬，翁秀秀，唐德富，潘建忠，年 芳

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 4.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730000)

牛乳中黃曲霉毒素B1和M1檢測(cè)方法的比較

羅昱芬1，翁秀秀2，唐德富3，潘建忠4，年 芳1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 4.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730000)

比較了免疫親和柱-高效液相色譜法(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定牛乳中黃曲霉毒素B1(AFB1)和M1(AFM1)的回收率、方法檢出限及精密度。結(jié)果表明，HPLC法測(cè)定AFB1、AFM1的檢測(cè)限分別為0.02和0.01 μg·L-1，ELISA法測(cè)定AFB1、AFM1的最低檢出限分別為0.05和0.02 μg·L-1；陰性牛乳試樣AFB1(0.003、0.006、0.012、0.024 μg·kg-1)和AFM1(0.005、0.01、0.025、0.05 μg·kg-1)的回收率試驗(yàn)表明，HPLC法測(cè)定AFB1與AFM1的回收率分別為77.58%～82.81%和77.51%～82.23%，變異系數(shù)分別為1.93%和3.51%；ELISA法測(cè)定AFB1與AFM1回收率分別為77.28%～79.11%和75.40%～76.34%，變異系數(shù)分別為2.20%和3.80%，兩種方法測(cè)定AFB1的回收率差異不顯著(P>0.05)，當(dāng)AFM1添加濃度大于0.025 μg·kg-1時(shí)，HPLC法回收率顯著高于ELISA法(P<0.05)；綜上，兩種方法靈敏度高、重復(fù)性好，HPLC法測(cè)定高濃度AFM1時(shí)準(zhǔn)確性優(yōu)于ELISA法。

高效液相色譜法；酶聯(lián)免疫吸附法；比較；回收率；準(zhǔn)確性

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是主要由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的有毒真菌代謝物[1-2]，其基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，前者是產(chǎn)生毒素和致癌的主要結(jié)構(gòu)，后者對(duì)毒性、致癌性起加強(qiáng)作用[3-5]，能引起嚴(yán)重的肝損傷、肝硬化和肝癌，伴隨免疫抑制效應(yīng)[6]。根據(jù)AFT在紫外光下產(chǎn)生熒光顏色的不同，將其分為B族和G族兩大類及其衍生物，其中B族發(fā)藍(lán)色熒光，G族發(fā)綠色熒光[7]。目前已知結(jié)構(gòu)的黃曲霉毒素有B1、B2、B2a、G1、G2、G2a、M1、M2等20余種，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2是最常見的6種毒素[8]。AFB1是所有黃曲霉毒素中最普遍、毒性最強(qiáng)的，通常污染糧油及其制品、動(dòng)植物食品，如花生、花生油、玉米、小麥、豆類、堅(jiān)果類、棉籽、乳及乳制品、水產(chǎn)品等[9-10]，被世界衛(wèi)生組織的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為主要的致癌物[11]。

AFB1存在于未完全干燥的飼料中，動(dòng)物攝入被AFB1污染的飼料后，在體內(nèi)肝微粒體單氧化酶系催化作用下，AFB1經(jīng)過羥基化生成AFM1[12]，AFM1主要存在于生鮮乳、純牛奶、脫脂牛奶、酸奶和奶酪等乳制品中[13]。AFM1的毒性是B1的1/10，但M1致癌性很強(qiáng)，現(xiàn)已證實(shí)牛乳中的AFM1濃度與飼料中的AFB1呈正相關(guān)關(guān)系，AFB1轉(zhuǎn)化為M1的比例平均為66∶1[14]，因此檢測(cè)牛乳中的AFB1、AFM1含量，對(duì)進(jìn)一步了解AFB1在動(dòng)物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化機(jī)制，規(guī)定飼料中的AFB1限量有實(shí)際意義。為了避免嚴(yán)重的健康危害，歐盟委員會(huì)規(guī)定牛奶中AFM1的最大限量為0.05 μg·kg-1，供人食用的農(nóng)產(chǎn)品中AFB1的最大限量為2 μg·kg-1[15]，美國(guó)食品藥品管理局規(guī)定牛奶中AFM1的最大量為0.5 μg·L-1，谷類食品中AFB1的最大量為20 μg·kg-1[16]。

目前，牛乳及其制品中AFT的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[17]、酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)[18]、高效液相色譜法(HPLC)[19]及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[20]等。其中薄層色譜法操作繁瑣、靈敏度差、定量不夠準(zhǔn)確，已很少使用[21]；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢出限低、靈敏度高、線性范圍廣、簡(jiǎn)便快捷，但是儀器價(jià)格較為昂貴，因此應(yīng)用受到限制。本研究采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜熒光檢測(cè)法及酶聯(lián)免疫吸附法比較生鮮乳中AFB1和AFM1測(cè)定的檢出限、線性范圍、回收率及重復(fù)性，對(duì)兩種方法進(jìn)行比較及評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

島津LC-20高效液相色譜儀：配有熒光檢測(cè)器，帶柱后衍生系統(tǒng)(日本島津公司)；PriboFast黃曲霉毒素B+G+M免疫親和柱3 mL，8位泵流操作架，空氣壓力泵，黃曲霉毒素B1、M1測(cè)定采用ELISA檢測(cè)試劑盒(青島Pribolab有限公司)；3K15冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；Bio-Tek ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)；玻璃纖維濾紙(孔徑1.5 μm，美國(guó)Whatman公司)；VORTEX KB-3型漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 試劑和材料

甲醇、乙腈(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；柱后衍生碘液；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μg·L-1，青島Pribolab有限公司)，黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0、0.7、1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、11.2 μg·L-1，青島Pribolab有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水(超純水)；濾膜(0.45 μm，北京萊德凱斯科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1高效液相色譜-熒光檢測(cè)法

1)提取:稱取10 g牛奶試樣，精確到0.01 g，置于50 mL的離心管中，于8 000 r·min-1、-4 ℃條件下離心15 min，取下層用玻璃纖維濾紙過濾，待凈化。

2)樣品凈化:將上述過濾液全部轉(zhuǎn)移到10 mL注射器中，調(diào)節(jié)空氣壓力泵，使提取液以1～2 mL·min-1流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3 mL空氣通過柱體。

向上述注射器內(nèi)加20 mL水淋洗柱子，棄去全部流出液，并使2～3 mL空氣通過柱體。以2.0 mL色譜甲醇分兩步進(jìn)行重力洗脫，收集全部洗脫液過0.45 μm濾膜，供液相色譜測(cè)定。

3)色譜條件:色譜柱為Inertsil ODS-3，5 μm，250 mm × 4.6 mm(內(nèi)徑)；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量100 μL；檢測(cè)器為島津LC-20熒光檢測(cè)器；流速1 mL·min-1；其它色譜條件如表1所示。

表1 AFB1、AFM1色譜測(cè)定條件Table 1 Chromatographic conditions of AFB1 and AFM1

4)色譜測(cè)定:根據(jù)表1所述液相色譜分析條件，分別對(duì)黃曲霉毒素B1、M1標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，根據(jù)峰保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度(μg·L-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附法

1)黃曲霉毒素B1的測(cè)定

試劑準(zhǔn)備：從冰箱中取出黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒，平衡至室溫，所有試劑使用前輕輕顛倒搖勻。洗滌工作液：用去離子水將濃縮洗滌液按1∶9體積比稀釋。樣品前處理：稱取10 g牛奶試樣，精確到0.01 g，置于50 mL的離心管中，于8 000 r·min-1、-4 ℃條件下離心15 min，棄去脂肪層待測(cè)。檢測(cè)步驟：加AFB1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4 μg·L-1)或待測(cè)樣品提取液每孔100 μL，并做2孔平行，隨即在各孔中分別加入50 μL酶標(biāo)物，再加入50 μL試劑液#1，混勻，加蓋板膜，室溫下反應(yīng)10 min；去蓋板膜，甩干孔液，用洗滌工作液重復(fù)洗滌3次，每次間隔30 s，拍干后各孔分別加入100 μL顯色液，加蓋板膜，室溫避光反應(yīng)10 min，各孔分別加入100 μL終止液；終止反應(yīng)后，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的AFB1含量。

2)黃曲霉毒素M1的測(cè)定

試劑準(zhǔn)備：從冰箱中取出黃曲霉毒素M1酶聯(lián)免疫試劑盒，平衡至室溫，所有試劑使用前輕輕顛倒搖勻。洗滌工作液：用去離子水將濃縮洗滌液按1∶9體積比進(jìn)行稀釋。標(biāo)準(zhǔn)工作液：用樣品稀釋液將濃縮標(biāo)準(zhǔn)液按1∶9體積比稀釋，稀釋后標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg·L-1。樣品前處理：稱取10 g牛奶試樣，精確到0.01 g，置于50 mL的離心管中，于8 000 r·min-1、-4 ℃條件下離心15 min，棄去脂肪層待測(cè)。檢測(cè)步驟：加AFM1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品提取液每孔100 μL，并做兩孔平行，再加50 μL試劑液#1，加蓋板膜蓋住微孔，室溫下反應(yīng)60 min；去蓋板膜，甩干孔液，用洗滌工作液重復(fù)洗滌3次，每次間隔30 s，拍干后各孔分別加入100 μL酶標(biāo)物，輕輕混勻，加蓋板膜蓋住微孔，室溫下反應(yīng)60 min后繼續(xù)洗滌微孔板；拍干后各孔分別加入100 μL顯色液，輕輕混勻，在室溫黑暗下反應(yīng)20 min，加終止液每孔100 μL，終止反應(yīng)后，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的AFM1含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，對(duì)ELISA法和HPLC法所得AFB1、AFM1的回收率進(jìn)行t檢驗(yàn)，顯著性水平為0.05，采用Origin 10.0繪圖軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性及檢出限

2.1.1高效液相色譜法 由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖可以看出，黃曲霉毒素B1、M1參考保留時(shí)間分別為14、1.6 min左右(圖1、圖2)；從加標(biāo)樣品的色譜圖可看出，凈化效果良好，色譜峰峰形較佳，基本沒有雜質(zhì)峰(圖3、圖4)。

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig. 1 Standard chromatogram of AFB1

圖2 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig. 2 Standard chromatogram of AFM1

圖3 加黃曲霉毒素B1標(biāo)品樣品色譜圖Fig. 3 Sample chromatogram with AFB1 standard

圖4 加黃曲霉毒素M1標(biāo)品樣品色譜圖Fig. 4 Sample chromatogram with AFM1 standard

利用AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制濃度為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 、3.5、4.0 μg·L-1的系列 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，在表1所述的色譜條件下進(jìn)樣分析。以色譜峰面積對(duì)AFB1濃度(μg·L-1)繪制曲線(圖5)，線性回歸方程為y=45 518x-2.995 2，決定系數(shù)R2=0.999 9，AFB1在0～4.0 μg·L-1濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。以熒光檢測(cè)器的檢測(cè)信號(hào)為基線噪聲信號(hào)3倍(即信噪比為3︰1)計(jì)算相對(duì)應(yīng)的添加濃度，該濃度即為檢測(cè)限[22]。確定本方法AFB1檢測(cè)限為0.02 μg·L-1。

配制濃度為 0、0.7、1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、11.2 μg·L-1的系列 AFM1標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色譜峰面積對(duì)AFM1濃度(μg·L-1)繪制曲線(圖6)，線性回歸方程為y=2 941.8x-9.159 8，決定系數(shù)R2=0.999 9，AFM1在0～11.2 μg·L-1濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，確定AFM1檢測(cè)限為0.01 μg·L-1。

圖5 黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve of AFB1

圖6 黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Standard curve of AFM1

2.1.2酶聯(lián)免疫吸附法 配制AFB1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0、0.15、0.30、0.60、1.20、2.40 μg·L-1進(jìn)行ELISA檢測(cè)，以百分吸光率(各濃度標(biāo)準(zhǔn)品平均吸光度值與0 μg·L-1吸光度值的比值，%)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg·L-1)為橫坐標(biāo)作圖(圖7)，得回歸方程為y=-47.815x+98.351，決定系數(shù)R2=0.994 5，AFB1在0～2.4 μg·L-1濃度范圍內(nèi)與其百分吸光率的線性關(guān)系良好，通過計(jì)算3.3σ/校準(zhǔn)曲線的斜率確定ELISA法測(cè)定黃曲霉毒素的最低檢出限[23]，其中σ為7條特定校準(zhǔn)曲線截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差，每一條特定校準(zhǔn)曲線由3個(gè)濃度點(diǎn)組成，AFB1的檢出限為0.05 μg·L-1。

圖7 黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 7 Standard curve of AFB1

AFM1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μg·L-1，用與AFB1相同的方法作圖(圖8)，得回歸方程為y=-141.33x+97.251，決定系數(shù)R2=0.996 6，AFM1在0～1 μg·L-1與其百分吸光率的線性關(guān)系良好，AFM1的檢出限為0.02 μg·L-1。

圖8 黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 8 Standard curve of AFM1

2.2 方法的回收率及精密度

對(duì)未檢出黃曲霉毒素的陰性牛奶樣品進(jìn)行0.003、0.006、0.012、0.024 μg·kg-1(AFB1)和0.005、0.010、0.025、0.050 μg·kg-1(AFM1)4個(gè)添加水平回收率試驗(yàn)，其中0.025 μg·kg-1(AFM1)和0.012 μg·kg-1(AFB1)水平重復(fù)測(cè)8次，平均回收率和精密度數(shù)據(jù)見表2和表3。

以AFB1計(jì)，牛乳樣品在添加濃度為0.003、0.006、0.012、0.024 μg·kg-1時(shí)，ELISA法測(cè)定的回收率在77.28%～79.11%，HPLC法的回收率在77.58%～82.81%，兩種方法間回收率差異不顯著(P>0.05)(表2)；以AFM1計(jì)，牛乳樣品在添加濃度為0.005、0.010、0.025、0.050 μg·kg-1時(shí)，ELISA法測(cè)定的回收率在75.40%～76.34%，HPLC法的回收率在77.51%～82.23%，添加濃度為0.005、0.010 μg·kg-1時(shí)，兩方法間回收率差異不顯著(P>0.05)，而添加濃度為0.025 μg·kg-1時(shí)差異顯著(P<0.05)，添加濃度為0.05 μg·kg-1時(shí)差異極顯著(P<0.01)。ELISA法與HPLC法測(cè)定AFB1的變異系數(shù)分別為2.20%和1.93%，測(cè)定AFM1的變異系數(shù)分別為3.80%和3.51%(表3)。

3 討論與結(jié)論

表2 牛奶中黃曲霉毒素添加回收率Table 2 Additive recovery of aflatoxins in milk

表3 兩方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The repeatability results of two methods

目前，測(cè)定牛乳中AFB1與M1的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 23212-2008(牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的測(cè)定復(fù)合免疫親和柱液相色譜-熒光檢測(cè)法)，GB 5413.37-2010(乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定)和GB 5009.24-2010(食品中黃曲霉毒素M1和B1的測(cè)定薄層色譜法)，應(yīng)用免疫親和柱進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，是將黃曲霉毒素特異性抗體交聯(lián)在柱內(nèi)固體支持物上，當(dāng)提取液通過免疫親和柱時(shí)，黃曲霉毒素與抗體結(jié)合。用水清洗免疫親和柱，去除柱內(nèi)的雜質(zhì)，然后用洗脫劑(甲醇等)洗脫吸附在柱上的黃曲霉毒素，不同廠家免疫親和柱材料不同，在產(chǎn)品使用前有必要對(duì)其準(zhǔn)確度與精密度進(jìn)行評(píng)估。本研究中HPLC法檢測(cè)AFB1和AFM1的加標(biāo)回收率分別為77.58%～82.81%和77.51%～82.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.93%和3.51%，檢出限分別為0.02和0.01 μg·L-1，這與國(guó)標(biāo)GB 5413.37-2010中AFM1的檢測(cè)結(jié)果一致，也與胡宏?duì)N等[24]、周貽兵等[25]測(cè)得HPLC法對(duì)AFM1的加標(biāo)回收率為68%～85%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.73%～4.55%，檢出限為0.01 μg·L-1的結(jié)果基本一致，而AFB1的檢測(cè)，本研究所用方法與國(guó)標(biāo)GB/T 23212-2008中免疫親和柱類型不同，柱后衍生系統(tǒng)亦有差異，所以檢出限結(jié)果差異較大，但回收率結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，HPLC法測(cè)定黃曲霉毒素的精密度和準(zhǔn)確度均良好，但該法樣品前處理較為繁瑣，免疫親和柱消耗多，檢測(cè)成本高，而且AFB1的熒光檢測(cè)靈敏度較低，需要增加衍生處理。另外，該方法需要專業(yè)技術(shù)人員操作，所需儀器設(shè)備昂貴，主要應(yīng)用在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室[26]。

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是將抗體抗原反應(yīng)的特異性和酶與底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫分析技術(shù)[27]，有直接競(jìng)爭(zhēng)和間接競(jìng)爭(zhēng)兩種模式，測(cè)定牛乳中黃曲霉毒素的ELISA國(guó)標(biāo)測(cè)定法目前只有GB 5413.37-2010。盧安根等[28]的研究表明，ELISA法檢測(cè)牛奶中的AFB1加標(biāo)回收率為95.0%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～1.6%，靈敏度為0.03 μg·L-1；李平等[29]利用ELISA試劑盒檢測(cè)牛奶中的AFM1，得到回收率在93%～120%，最低檢出限為0.039 μg·L-1；GB 5413.37-2010方法中應(yīng)用雙流向酶聯(lián)免疫法測(cè)定AFM1的檢出限為0.5 μg·kg-1，而本研究得出ELISA法檢測(cè)AFB1的回收率為77.28%～79.11%，檢出限為0.05 μg·L-1，AFM1的回收率為75.40%～76.34%，檢出限為0.02 μg·L-1。目前雖然ELISA測(cè)定方法應(yīng)用較為廣泛，但由于ELISA法使用的抗體和酶，牛乳樣品基質(zhì)成分(糖類、脂肪、蛋白質(zhì)及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))均比較復(fù)雜，易受諸多不確定因素影響，因此不同來源的ELISA試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精密度會(huì)出現(xiàn)差異，需要在使用前進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。

本研究顯示，HPLC法與ELISA法測(cè)定AFB1的準(zhǔn)確性差異不顯著，但當(dāng)AFM1添加濃度為0.025 μg·kg-1時(shí)，HPLC法與ELISA法所得回收率數(shù)據(jù)差異顯著，添加濃度為0.05 μg·kg-1時(shí)，差異極顯著，說明HPLC法測(cè)定高濃度AFM1時(shí)準(zhǔn)確性優(yōu)于ELISA法。本研究中采用HPLC法與ELISA法兩種方法測(cè)定兩種毒素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在4.0%以內(nèi)，準(zhǔn)確性、重復(fù)性良好，符合定量檢測(cè)對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求[30]。HPLC法中所用免疫親和柱在使用前應(yīng)注意恢復(fù)柱溫至室溫(22～25 ℃)，需多次洗脫以提高回收率，流動(dòng)相需要經(jīng)濾膜過濾并超聲脫氣，放置在規(guī)定位置逐個(gè)排氣，液相檢測(cè)前必須平衡柱子使基線平穩(wěn)；ELISA測(cè)定樣品的前處理過程較簡(jiǎn)單，回收率較高，操作較為簡(jiǎn)便，但在操作中需注意實(shí)驗(yàn)一旦開始，后續(xù)步驟應(yīng)連續(xù)完成，在30 min內(nèi)讀取吸光光度值，且樣品和標(biāo)準(zhǔn)品要同時(shí)進(jìn)行操作，以保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性，洗滌微孔過程至關(guān)重要，應(yīng)迅速甩干以防止微孔間交叉污染。

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ComparisonofmethodsfordetectingaflatoxinsB1andM1inmilk

Luo Yu-fen1, Weng Xiu-xiu2, Tang De-fu3, Pan Jian-zhong4, Nian Fang1

(1.Faculty of Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China; 2.College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu, China; 3.Faculty of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China; 4.Lanzhou Food and Drug Inspection, Lanzhou 730000, Gansu, China)

Immunoaffinity column-high performance liquid chromatography (HPLC) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methods were adopted to determine aflatoxins (AF) B1and M1in milk. The recovery, detection limit, and precision of these two methods were compared in this study. The results showed that, for HPLC, the detection limits of AFB1and AFM1were 0.02 and 0.01 μg·L-1, respectively, while for ELISA, the detection limits of AFB1and AFM1were 0.05 and 0.02 μg·L-1, respectively. Standard solutions of AFB1(0.003, 0.006, 0.012, and 0.024 μg·kg-1) and AFM1(0.005, 0.01, 0.025, and 0.05 μg·kg-1) were added into blank milk samples and the results of recovery experiments indicated that, for HPLC, the recoveries of AFB1and AFM1were 77.58%～82.81% and 77.51%～82.23% with relative standard deviations of 1.93% and 3.51%, respectively. For ELISA, the recoveries of AFB1and AFM1were 77.28%～79.11% and 75.40%～76.34% with relative standard deviations of 2.20% and 3.80%, respectively. The recovery of AFB1did not significantly differ between the two methods (P>0.05). However, the recovery of AFM1, when the amount added was more than 0.025 μg·kg-1, was significantly higher by HPLC than by ELISA (P<0.05). In conclusion, both the tested methods were highly accurate, with a high sensitivity and good repeatability. At higher concentrations of AFM1, the accuracy of HPLC was better than that of ELISA.

high-performance liquid chromatography method; enzyme-linked immunosorbent assay; comparison; recovery; precision

Nian Fang E-mail:nianf@gsau.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0104

羅昱芬,翁秀秀,唐德富,潘建忠,年芳.牛乳中黃曲霉毒素B1和M1檢測(cè)方法的比較.草業(yè)科學(xué),2017,34(12)：2546-2553.

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S823.9+2;S858.23

A

1001-0629(2017)12-2546-08

2017-03-08接受日期2017-04-21

甘肅省自然科學(xué)基金(145RJZA058)；蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(lzujbky-2014-198)

羅昱芬(1990-)，女，山東沾化人，在讀碩士生，研究方向?yàn)榕Ｄ讨悬S曲霉毒素檢測(cè)。E-mail:lyf19900701@163.com

年芳(1976-)，女，甘肅禮縣人，副教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油副產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究。E-mail:nianf@gsau.edu.cn

(責(zé)任編輯 武艷培)