金黃色葡萄球菌CCT融合蛋白的表達及免疫活性研究

馬金柱，張少鐸，程欣然，葉玉婷，何溪雨，徐樂，宋佰芬，于立權(quán)，于永忠，朱戰(zhàn)波，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶 163319）

金黃色葡萄球菌CCT融合蛋白的表達及免疫活性研究

馬金柱，張少鐸，程欣然，葉玉婷，何溪雨，徐樂，宋佰芬，于立權(quán)，于永忠，朱戰(zhàn)波，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶 163319）

利用前期篩選的具有良好免疫原性的S.aureus表面Clfa蛋白免疫優(yōu)勢片段Clfais和TraP蛋白的融合重組蛋白，加入CTB分子內(nèi)佐劑，以表達CTB-Clfais-TraP（CCT）蛋白和研究CCT免疫活性。實驗采用重疊PCR方法將分子內(nèi)佐劑CTB與Clfais-TraP基因串聯(lián)，并將CTB-Clfais-TraP插入到表達載體pET32-a（+）上，構(gòu)建pET32-a（+）-CTB-Clfais-TraP重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21中表達目的蛋白，利用Western blot方法對其鑒定，以ELISA方法檢測CCT蛋白的免疫活性。實驗結(jié)果表明表達的CCT蛋白大小為87.6 ku，CCT能與Clfais、TraP免疫小鼠血清發(fā)生反應，表明CCT具有免疫活性，不受CTB分子影響，這為進一步研究CTB提高Clfais-TraP蛋白的免疫活性奠定了良好基礎。

金黃色葡萄球菌；CTB-Clfais-TraP；蛋白表達；免疫活性

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是引起人和動物感染的重要病原菌，可引起多種疾病，尤其以奶牛乳房炎最為重要[1-3]。近些年，抗生素廣泛使用引起金黃色葡萄球菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，導致抗生素無法有效治療S.aureus感染[4-6]。研究表明疫苗是解決S.aureus感染的有效方法，但現(xiàn)有的傳統(tǒng)疫苗免疫原性不高，達不到人們預期結(jié)果，需要人們研制新型有效疫苗預防S.aureus感染。最近，研究表明S.aureus表面蛋白具有較強的免疫原性，有望成為S.aureus新型疫苗[7-9]，并且，我們前期研究表明S.aureus的表面Clfa蛋白免疫優(yōu)勢片段Clfais和TraP蛋白的融合重組蛋白Clfais-TraP具有良好的免疫原性，有望成為新型候選疫苗的潛力，但還需提高其免疫保護作用。因此，研究將分子內(nèi)佐劑CTB與Clfais-TraP蛋白聯(lián)合表達，以進一步提高Clfais-TraP免疫效應，為今后S.aureus新型疫苗研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

大腸桿菌（E.coli）BL21和原核表達載體pET32-a（+）均來自黑龍江八一農(nóng)墾大學生物工程實驗室保存。

1.2 主要試劑及酶

核酸內(nèi)切酶SalⅠ與NotⅠ，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA聚合酶，蛋白Marker，DNA連接酶，HRP標記的羊抗鼠IgG等均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 表達載體構(gòu)建

1.3.1 引物設計 根據(jù)Genbank中的CTB基因序列和Clfais-TraP堿基序列，利用DNAStar軟件設計一對擴增CTB編碼基因的特異性引物，并且上游引物（P1）5′端加上酶切位點SalⅠ（標有下滑線堿基），下游引物（P2）5′端加上linker堿基序列，另外，擴增Clfais-TraP堿基序列上下游引物（分別為P3和P4）5′端分別加上linker堿基序列和NotⅠ的堿基序列，經(jīng)分析后以上引物均有很好的特異性。引物序列如下（標有下劃線堿基代表酶切位點或linker堿基序列）：P1：5′-GTCGACAAACACCTCAAAATATTACTGATTTGT-3′；P2：5′-AGATCCACCACCTGAACCTCCACCAATTTGCCATACTAATTGCG-3′；P3：5′-GGT GGAGG-TTCAGGTGGTGGATCTGTAGCTGCAGATG CACCGG-3′；P4：5′ATAGCGGCCGCCTATTCTTTTATTGG-GTATAGATATCTTT-3′。將以上引物郵寄上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.3.2 目的基因擴增 采用CTB基因和Clfais-TraP基因片段作為模板，并以p1和p4作為引物，擴增CTB-Clfais-TraP基因片段。擴增的串聯(lián)基因片段大小為1 848 bp片段。PCR反應體系組成如下：去離子水 13.8 μL，上游引物 1 μL（25 μmol·L-1）和下游引物1 μL（25 μmol·L-1），CTB 模板 0.5 μL，Clfais-TraP 模板 0.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 1 μL，10×PCR 緩沖液2 μL，10 U·μL-1LA Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，總反應體系為20 μL。反應熱循環(huán)參數(shù)為：95℃預熱3 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3.3 酶切與連接及轉(zhuǎn)化 將純化的CTB-Clfais-TraPPCR產(chǎn)物和pET32-a（+）載體酶切，酶切體系包括：10×NEB 緩沖溶液 5 μl，DNA 12 μL，SalⅠ 1 μL，NotⅠ 1 μL，ddH2O 31 μL，混勻后，37 ℃水浴中酶切1 h。再將純化的酶切產(chǎn)物進行連接，連接體系為：SolutionI 5 μL（含 T4 連接酶），DNA 5 μL，載體10 μL，最后，16 ℃過夜連接。

將上述連接產(chǎn)物與感受態(tài)細胞（E.coli BL21）混勻后按常規(guī)方法進行轉(zhuǎn)化：主要是連接產(chǎn)物冰浴45 min，42 ℃ 60 s，再冰浴 2 min，加入 1 mL LB 培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)1 h后，取100 μL培養(yǎng)物涂氨芐青霉素抗性的培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)，次日挑選單菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，采用SalⅠ與NotⅠ酶切和測序方法對其鑒定正確后，獲得原核表達載體，命名為pET32-a（+）-CTB-Clfais-TraP（CCT）。

1.4 蛋白表達

獲得的重組菌在含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.4時，采用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達 3、4、5和6 h，然后，收集的細菌加入SDS凝膠上樣緩沖液中，100℃煮沸6 min，冰浴2 min，室溫下離心（12 000 rpm）10 min，取15 μL上清液用于SDS-PAGE電泳，分析CTB-Clfais-TraP（CCT）蛋白表達[8]。

1.5 蛋白表達檢測

將重組菌（pET32-a（+）-CCT）、E.coli BL21 和重組菌 pET32-a（+）誘導之后，煮沸 6 min，離心后，上清液用于SDS-PAGE電泳。在Western blot過程中，以E.coli BL21和重組菌pET32-a（+）的上清液作為對照組，重組菌（pET32-a（+）-CCT）上清液作為實驗組，電轉(zhuǎn)后的膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌后，加入 His-Tag抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗滌后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）室溫反應1 h，最后，分析目的蛋白表達。

1.6 蛋白免疫活性分析

采用ELISA方法檢測CTB是否影響Clfais-TraP蛋白免疫活性。實驗過程中，以BSA、Clfais、TraP和CTB-Clfais-TraP蛋白作為包被抗原，其中，BSA作為陰性對照和Clfais、TraP蛋白作為陽性對照，包被抗原濃度均為0.01 mg·mL-1，包被時間4℃過夜，之后分別與Clfais和TraP免疫的小鼠血清反應，血清采用1∶1 000倍稀釋，反應條件為37℃ 1 h，然后與HRP標記的羊抗鼠抗體（1∶1 000稀釋）37℃孵育1 h，最后，PBST洗滌后，加入TMB溶液，避光條件下室溫作用 10 min，加 50 μl終止液（2 mol·L-1H2SO4），以450 nm波長檢測吸光度（OD450值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTB-Clfais-TraP基因獲得

以CTB與Clfais-TraP基因片段作為DNA模板和p1、p4作為引物，經(jīng)嵌合PCR擴增得到一條1 848 bp的條帶，PCR產(chǎn)物選用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1所示。

圖1 CTB-Clfais-TraP基因的PCR產(chǎn)物M，F(xiàn)ig.1 PCR product of CTB-Clfais-TraP

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

SalⅠ與 NotⅠ酶切的 pET32-a（+）-CCT 產(chǎn)物采用瓊脂糖電泳分析，紫外光下可見1 800 bp和5 900 bp左右的兩條帶，表明插入片段與目的片段1 848 bp大小相符，如圖2所示。另外，重組質(zhì)粒pET32-a（+）-CCT基因測序結(jié)果與目的基因序列相比，同源性為100%，說明目的基因插入正確（測序序列略去）。

2.3 目的蛋白表達

重組菌被IPTG誘導之后，蛋白表達情況選用SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示在凝膠中90.0 ku左右處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與預期蛋白87.6 ku大小相符，而對照菌中未見該蛋白條帶，表明重組菌能夠表達目的蛋白，并且IPTG誘導6 h，目的蛋白表達量相對較大，見圖3。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion identification of recombinant plasmid

圖3 重組菌的誘導表達Fig.3 The inducible expression of recombinant bacteria

2.4 Western Blot檢測結(jié)果

因為目的蛋白帶有His標簽，因此，選用His抗體檢測目的蛋白表達情況。結(jié)果顯示在重組菌（pET32-a（+）-CCT）裂解液中出現(xiàn)分子量大小約為90 ku的特異性條帶，與預期蛋白87.6 ku大小相符，而E.coli BL21菌裂解液和重組菌pET32-a（+）裂解液中未出現(xiàn)該條帶，表明目的蛋白表達正確（見圖4）。

圖4 Western blot的檢測結(jié)果Fig.4 Detection of Western blot

2.5 目的蛋白免疫活性檢測

利用ELISA方法分析CTB是否影響Clfais-TraP蛋白免疫活性。圖5 ELISA結(jié)果表明CCT實驗組與Clfais蛋白組的OD值比較無顯著差異，而與BSA組OD值相比差異極顯著；另外，圖6 ELISA結(jié)果顯示CCT實驗組與TraP蛋白組OD值相比無明顯差異，而與BSA組OD值比較差異極顯著。因此，研究結(jié)果說明CCT蛋白分別能與Clfais和TraP蛋白免疫的小鼠血清發(fā)生免疫反應，具有良好免疫活性，表明CTB-Clfais-TraP聯(lián)合表達時，CTB不影響Clfais-TraP蛋白的免疫活性，適合作為Clfais-TraP蛋白的分子內(nèi)佐劑。

圖5 CCT蛋白與Clfais免疫血清反應結(jié)果圖Fig.5 Reaction between CCT protein and Clfais-immune serum

3 討論

S.aureus致病機制復雜，能產(chǎn)生和分泌多種毒素和侵襲性酶類而致病，同時，它產(chǎn)生多種免疫逃避因子逃避宿主免疫反應[10-12]。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)S.aureus表面菌體蛋白具有較強的免疫原性，主要包括IsdB、ClfB、和FnBPA等分子[13-15]，具有成為新型疫苗的巨大潛力。我們前期研究表明免疫優(yōu)勢片段Clfais和TraP聯(lián)合表達的Clfais-TraP蛋白要強于二者單獨表達的蛋白免疫原性，說明聯(lián)合表達的蛋白可以一定程度上提高單獨表達蛋白的免疫效果，但是，仍需進一步提高Clfais-TraP免疫原性才能達到人們理想需求。

近幾年，作為分子內(nèi)佐劑的霍亂毒素B亞單位（Cholera Toxin B Subunit，CTB）具有很好佐劑效應，且CTB可誘導Th1與Th17細胞活化[16]，已引起很多學者重視。另外，人們已證實Th1與Th17細胞可活化CTL細胞和募集中性粒細胞，從而更加有效抵抗S.aureus感染，給S.aureus新型疫苗的研究提供了新思路[17-19]。因此，研究將CTB作為分子內(nèi)佐劑與Clfais-TraP蛋白聯(lián)合表達，以高效促進Th1與Th17細胞活化，進一步提高Clfais-TraP蛋白的免疫原性。研究采用原核表達系統(tǒng)表達了CTB-Clfais-TraP蛋白，且利用該蛋白N末端含有6個組氨酸的特點，以有效純化該蛋白。ELISA研究結(jié)果顯示CCT蛋白均能與Clfais和TraP蛋白免疫血清產(chǎn)生反應，表明CTB不影響Clfais-TraP蛋白的免疫活性，可以作為Clfais-TraP蛋白的分子內(nèi)佐劑。研究僅對CCT蛋白免疫原性做了初步研究，還需要今后利用動物實驗，進一步評價CCT蛋白的免疫保護作用，從而為S.aureus新型多亞單位疫苗研究提供重要參考。

4 結(jié)論

研究將CTB作為分子內(nèi)佐劑，成功構(gòu)建了原核表達載體 pET32-a（+）-CTB-Clfais-TraP，表達了目的蛋白CCT，并且CCT具有很好的免疫原性，這為進一步深入研究CCT免疫原性奠定了良好基礎。

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Expression and Immunocompetence of CCT Protein of Staphylococcus aureus

Ma Jinzhu，Zhang Shaoduo，Cheng Xinran，Ye Yuting，He Xiyu，Xu Le，Song Baifen，Yu Liquan，Yu Yongzhong，Zhu Zhanbo，Cui Yudong
（College of Life Science and Biotechnology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

According to the recombinant proteins of Clfais as immune superiority fragment of Clfa and TraP protein of Staphylococcus aureus（S.aureus）surface that exhibited good immunogenicity，the CTB intramolecular adjuvant gene was spliced with Clfais-TraP，then CTB-Clfais-TraP （CCT）protein was expressed and its immune activity was evaluated.Initially，CTB was tandem linked with Clfais-TraP by the overlapping PCR method，then，CTB-Clfais-TraP gene was inserted into pET32-a （+）vector to construct recombinant plasmids，pET32-a （+）-CTB-Clfais-TraP.After the pET32-a （+）-CTB-Clfais-TraP recombinant plasmids were identified，they were transformed into Escherichia coli（E.coli）BL21 to express the CCT，and CCT was detected by Western blot，then，immune activity of CCT was estimated by ELISA.These results showed the molecular size of CCT protein was 87.6 ku，and the CCT recombinant protein as ELISA coating antigen，could react with serum from mice immunized with Clfais，TraP，respectively.In conclusion，the pET32-a （+）-CTB-Clfais-TraP recombinant plasmids were successfully constructed，and CCT was correctly expressed in E.coli BL21 with the pET32-a（+）-CTB-Clfais-TraP plasmids，more importantly，CCT had strong immune activity，which would provide the foundation to further explore its immunogenicity.

Staphylococcus aureus；CTB-Clfais-TraP；protein expression；immunocompetence

Q786

A

1002-2090（2017）06-0040-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.010

2016-07-21

黑龍江省自然科學基金項目（C201443）；黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510223001）；大慶市指導性科技計劃項目（szdfy-2015-44）；黑龍江八一農(nóng)墾大學博士啟動基金。

馬金柱（1976－），男，副教授，東北農(nóng)業(yè)大學畢業(yè)，現(xiàn)主要從事分子免疫學和病原生物學方面的研究。